资木瓜中莽草酸通过减少RBL-2H3细胞脱颗粒抑制大鼠软骨细胞分化

.论著.文章编号：1007 -8738(2020)10-0890 -07资木瓜中莽草酸通过减少RBL-2H3细胞脱颗粒抑制大鼠软骨细胞分化
陈桂婷，郑倩倩，余婕，闫梦真，周婷婷，曹后平，李世刚*
(三峡大学医学院中药药理（肿瘤）科研三级实验室，湖北宜昌443002)
[摘要]目的研究资木瓜中总提物莽草酸（SA)通过抑制RBL-2H3细胞脱颗粒从而减少软骨细胞向肥厚软骨细胞的分化作 用。

方法采用甲苯胺蓝染色法，类胰蛋白酶免疫组织化学染色法进行软骨细胞的鉴定；软骨细胞培养组分为正常软骨细胞对 照组，化合物48/80(C48/80)活化RBL-2H3细胞培养上清液处理组，（3、lO d O h g/m LSA分别作用后的RBL-2H3细胞培养 上清液处理组。

噻唑蓝（MTT)法检测SA和RBL-2H3细胞上清液对软骨细胞的毒性作用；Western blot法检测软骨细胞2型胶 原蛋白（C〇12)和CollO的蛋白表达；免疫组织化学染色法检测软骨细胞CollO蛋白水平；ELISA检测软骨细胞培养上清液基质 金属蛋白酶13(MMP13)、可溶性核因子K B受体激活蛋白配体（sRANKL)及骨保护素（0PG)含量，二甲基亚甲蓝（DMB)比色法 检测糖胺多糖(GAG)的含量。

结果（0 SA对软骨细胞生长无显著影响，与C48/80活化RBI-2H3细胞培养上清液处理组比较，随着SA剂量的增加，软骨细胞中C〇12、GAG蛋白表达增加，CollO、MMP13的表达明显降低、sRANKiyOPG的比值降低。

结论SA通过抑制RBL-2H3细胞脱颗粒减少软骨细胞向肥厚软骨细胞的分化。

[关键词]资木瓜；莽草酸(SA); RBL-2H3细胞；软骨细胞；分化
[中图分类号]R392.12, R285.5, Q254, R392-33 [文献标志码]A
木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠的成熟果实，临床 上可舒筋活络，对关节疼痛有一定的治疗作用[1]。

资木瓜是盛产于湖北鄂西南地区的道地药材，因生 长在长阳资丘而得名，被证明在抗炎、镇痛、抑菌方 面发挥治疗功效[2_3]。

有研究表明，资木瓜主要成 分莽草酸（shikimic acid,SA)可以通过减少肥大细胞 (mast cell，MC)和大鼠嗜碱性粒细胞性白血病细胞 RBL-2H3的脱颗粒，从而减少组胺的释放[4]。

更有 研究证明，MC和软骨细胞共培养中活化MC诱导软 骨细胞II型胶原蛋白（collagen type II ,Col2)和糖胺 多糖(glycosaminoglycans,GAG)的表达显著降低，提 示MC释放的活性介质可能影响增殖软骨细胞向肥 厚软骨细胞分化[5]。

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA)是一■ 种常见的以滑膜炎为主要病理特点，会导致软骨组 织和骨质破坏的慢性系统性自身免疫性疾病[6]。

据 统计，我国RA患病率为0. 24%，且继续呈现增长的 趋势，全国RA患者人数逾有500万人，随着病程的 延长，残疾及功能受限发生率升高[7],属于我国危害 严重、分布广泛的一种慢性疾病。

虽然临床上抗风 湿药物众多，并且绝大多数R A患者的病情进展能 够得以控制，但由于目前的R A治疗药物易使病症反复、不良反应多、部分患者得不到救治等问题存 在，将临床治疗带入进退两难的境地。

国内外对天 然药物有效成分治疗R A的开发和运用逐渐得到重 视，从中药中寻找安全可靠有效的R A治疗药物可 能是最有效的方法之一。

护骨因子/核因子k B受体活化因子配体/核因子K B 受体活化因子(osteoprotegerin/receptor activator for nuclear factor-k B ligand/receptor activator for nuclear factor-KB，OPG/RANKL/RANK)系统因可调节破骨 细胞的形成，促进破骨细胞的分化，在R A领域内的 研究日渐广泛[8]。

近期研究表明[9]，软骨细胞同样 可表达RANKL，而肥厚软骨细胞中RANKL的表达 显著多于增殖软骨细胞，软骨细胞可能通过RANKL 和0P G的表达而调控破骨细胞的生成，导致成骨细 胞与破骨细胞失衡，血管人侵，造成关节和骨的破 坏。

目前R A的发病机制尚不完全清楚，大量研究表 明，R A的发生发展过程依赖于MC在滑膜的聚集和 活化，在R A患者的滑膜组织和关节液以及软骨侵 蚀部位M C的数量显著增加[1°_12]。

基于以上研究和 MC的相关生物学特征，提示通过抑制MC活化脱颗 粒相关活性介质可能是R A治疗的新途径，并且天 然药物具有毒副作用小、价格便宜、取材广泛等
收稿日期：2020-07-01;接受日期：2020-09-05
基金项目：国家自然科学基金(81274166, 81673665);湖北省卫生健康委员会联合基金重点项目（W J2019H531) 作者简介：陈桂婷（1995-)，女，湖北宜昌人，硕士研究生
T el：180****6921；E-mail：405245268@
*通讯作者，李世刚，E-mail: **************
优势，所以从天然药物中寻找最佳治疗R A药物将 会给R A患者带来福音。

由于R B L-2H3细胞具有与 M C相似的功能，常用R B L-2H3细胞用来体外模拟 M C分泌过程，本实验参照文献[13]使用80 p g/m L MC 刺激剂化合物 48/80(com pound48/80,C48/80)来刺激R B L-2H3细胞脱颗粒成为活化R B L-2H3细胞。

本研究通过S A处理后的R B L-2H3细胞上清作 用于软骨细胞，观察软骨细胞的增殖及分化情况，来 研究资木瓜S A通过减少R B L-2H3细胞脱颗粒对软 骨细胞的影响，以为资木瓜的临床应用提供实验 基础。

1材料和方法
1.1材料
DMEM培养基、P B S和胰蛋白酶购自吉诺生物 医药技术有公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技 有限公司；n型胶原蛋白酶购自北京索莱宝科技有 限公司；苏木精和二氨基联苯胺（diaminobenzidine, DAB)显色试剂盒、苏木精购自武汉博士德生物工程 有限公司；ECL显影液购自碧云天生物技术有限公 司；048/80购自Sigma公司；甲苯胺蓝（toluidine blue,T B)、甲基噻唑基四唑蓝（m ethyl thiazolyl tetrazolium,MTT)粉末、二辛可宁酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白质定量试剂盒、Triton X-100细胞裂解液购自武汉科瑞生物技术有限公司；基质金属蛋白酶 13 (m atrix m etalloproteinase13 , MMP13) ELISA试剂盒购自Elabscience公司；大鼠 可溶,性RANKL(soluble receptor activator for nuclear factor-k B ligand,sRANKL)检测试剂盒购自 Cusabio 公司；二甲基亚甲蓝（dimethylmethyl blue,DMB)比色法大鼠GAG试剂盒购自Chondrex公司；兔抗Col2 抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；山羊抗 X型胶原蛋白（collagen type X，CollO)多克隆抗体 购自Santa Cruz Biotechnology公司。

兔抗(5肌动蛋白 (p-actin)抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG购自武汉 谷歌生物科技有限公司；二甲基亚砜(bimethylsulfoxide，DMS0)购自天津市科密欧化学试 剂有限公司；HRP标记的兔抗山羊IgG购自爱必信 (上海)生物科技有限公司；RBL-2H3细胞购自武汉 大学细胞保藏中心；S D大鼠等级为无特定病原体 (specific pathogen free,SPF)级，购自三峡大学实验 动物中心。

1.2方法
1.2.1原代大鼠关节软骨细胞的分离及鉴定选取新生24 h的大鼠乳鼠脱臼处死，置于预冷的750 m iyL酒精中浸泡3 min。

沿着鼠的前、后大腿骨 上缘用剪刀进行整肢分离，浸入无菌条件下的含 750 m!7L酒精的无菌玻璃培养皿中。

超净台中进行 软骨分离，将分离出的软骨转移至含有PB S的玻璃 培养皿中。

PBS冲洗3次，使用手术刀将软骨切成碎 块；加入5 m L胰蛋白酶后，将培养皿封口。

置于 37弋恒温箱中缓慢振摇30 min,转移至15 mL离心 管中800 r/min离心3 min，弃上清。

加入2 g/L II型胶原蛋白酶5 mL转移至原玻璃培养皿中，再次封 口。

置于37T恒温箱中，缓慢振摇1 ~2 h;消化结 束后，加人完全培养基5 mL并转移至原15 mL离心 管中800 r/min离心3 min;弃上清，加人适量完全 DMEM培养基重悬；转移至新无菌培养皿中，置于 37T培养箱孵育。

24 h后，将碎块及培养基转移至 2个培养皿中，并补充新的完全培养基适量，原培养 皿中直接补充适量新完全培养基；24 h后，有组织碎 块的两个培养皿中更换新培养基，弃组织块。

待细 胞汇合至80%以上时，进行胰蛋白酶消化，细胞传 代。

倒置显微镜下观察细胞形态；采用T B染色法检 测软骨细胞形态及功能；免疫组织化学染色法观察 C〇12的表达鉴定软骨细胞:14]。

将软骨细胞悬液接种 于含无菌盖玻片的小培养皿上，置于37T恒温箱中 孵育，待细胞融合后用PBS洗3次，加人40 g/L多聚甲醛，室温固定30 min,滴加1g/L T B工作液，室 温放置2 h,双蒸水洗涤后置于显微镜下观察并采集 图片。

用40 g/L多聚甲醛分别将第一、二、三代的 软骨细胞爬片室温固定30 min,PBS清洗3次，封闭 液封闭2 1加入兔抗（：〇12抗体（1:200)，4<€过夜，PBS清洗3次，再加人HRP标记的山羊抗兔IgG (1:1000)，室温放置1h;使用DAB试剂盒显色，室 温孵育15 min后，双蒸水冲洗；滴加苏木精复染，脱 水、透明、封片后，显微镜下观察并拍照。

1.2.2 S A处理后RBL-2H3细胞培养上清液的收集
取对数生长期的RBL-2H3细胞，调整细胞数为4 x105个/mL，24孔板每孔接种细胞1mL。

次日，吸弃旧培养液，加人C40/80(终剂量为80 pg/rnL)与等体积含（〇、3、10、30) |xg/mL SA 的Tyrode 缓冲 液；继续培养1h后，收集上清，-80丈储存备用。

1.2.3 MTT法检测单纯SA、S A处理后RBL-2H3培 养上清液对软骨细胞的毒性作用将细胞数为4 x104个/m L的软骨细胞分别接种于％孔板中，将 (0、3、10、30 W m L S A和前述不同剂量S A处理 后收集的细胞上清液分别作用于软骨细胞，设置
5个复孔。

置于37T培养箱中培养20h，加入M TT 处理4 h;弃液后，各孔加入200 DMSO溶解结晶。

在酶标仪570 mn波长处，检测吸光度（A)值。

1.2. 4 W estern blot 法检测 SA 处理后 RBL-2H3 细胞 培养上清液对软骨细胞C〇12和CollO的蛋白表达 收集S A处理后的RBL-2H3细胞培养上清液，继续培养细胞收集处理过的软骨细胞蛋白，采用 BCA蛋白定量法检测蛋白浓度。

常规电泳、转至 PVDF膜，20 mL 50 g/L脱脂牛奶封闭1h。

分别加 兔抗p-actin抗体（1 : 1000 )、兔抗Col2抗体 (1:1000)、山羊抗CollO抗体（1:1000),于4尤摇床 孵育过夜；洗涤后，分别加HRP标记的山羊抗兔IgG 或HRP标记的兔抗山羊IgG(l:3000),室温摇床孵 育1h;洗膜3次后，加入ECL显影液，置于显影仪 中显影。

1.2.5免疫组织化学染色法检测SA处理后RBL-2H3 细胞培养上清液对软骨细胞CollO蛋白的表达收集SA处理后的RBL-2H3细胞培养上清液，处理 软骨细胞爬片24 h，用40 g/L多聚甲醛室温固定 30 min;PBS轻轻洗涤3次，5 m in/次，滴加5 mL/L Triton X-100室温处理15 min;P B S清洗，加人 30 mL/L H202室温处理10 min;PBS清洗3次，滴 加50 m L/L的羊血清封闭液，371静置封闭30 min;弃液不清洗，直接加人即用型山羊抗CollO抗体 (1:200)，4丈孵育过夜；PBS洗3次，滴加HRP标记 的兔抗山羊IgG(l:1000),室温孵育1h;PB S洗 3次，甩干，根据DAB试剂盒说明书方法进行显色。

镜下观察至棕色后双蒸水冲洗，苏木精复染10 m in 左右，大量自来水冲洗使得胞核返蓝，脱水、透明和 封片，镜下观察、采集图片。

1.2.6 DMB比色法检测S A处理的活化RBL-2H3 细胞培养液对软骨细胞中GAG含量的影响将对数
生长期的软骨细胞，以1x104个/m L的细胞数接种 于24孔板中进行培养。

细胞融合70%时，设置空白 对照组、C48/80活化RBL-2H3模型组、（3、10、30) pg/mL SA处理组。

作用48 h后，弃掉含药培养 基，加人细胞裂解液至细胞完全裂解，分别移取各组 细胞裂解混合物1〇〇 (x L至GAG测定试剂盒的孔板 中。

按照GAG试剂盒的说明书要求进行操作，在规 定波长450 rrni处测定标准浓度和各组的吸光度值，根据标准曲线，计算GAG含量。

1.2.7 EU SA检测S A处理后的RBL-2H3细胞培养 上清液对软骨细胞MMP13、RANKL及0P G的含量将第3代对数生长期的软骨细胞，细胞数调整为1x104个/mL,每孔接种1mL细胞悬液于6孔板。

细胞汇合至70%时，设软骨细胞对照组、C48/80活化RBL-2H3细胞上清液处理组、SA处理的RBL-2H3 细胞上清液组。

将收集的各组细胞上清液分别处理 软骨细胞，继续培养48 h。

收集各组细胞上清液，-80T保存，采用ELISA检测相关蛋白水平，操作 步骤按照试剂盒各对应的说明书进行严格操作。

1.2.8统计学分析采用SPSS18.0统计软件对所 有实验数据进行统计学分析，数据以5 表示，以单因素方差分析进行多组间比较，P<〇.〇5为差异有 统计学意义。

2结果
2.1原代大鼠关节软骨细胞培养及鉴定
从软骨组织块中消化下来的细胞，培养48 h后 换液。

随着细胞数的增加，逐渐呈“铺路石”状，细胞大而饱满，形态多为多角形、星形、圆形，部分呈 三角形，含少量的梭形，胞核为圆形；T B染色可见 软骨细胞核呈蓝色，细胞基质呈紫蓝色；C〇12免疫组 织化学染色分别对软骨细胞第1 ~3代进行染色，可见随着代数的增加软骨细胞胞质被染成棕黄色越深，胞核被染成蓝色；两种染色结果与文献鉴定描述一 致，则认为已成功建立原代软骨细胞培养体系(图 1)。

A:正常软骨细胞（相差显微镜）；B:细胞形态（T B染色）；C:第一代
细胞C〇12表达（免疫组织化学染色）；D:第二代细胞C〇12表达（免疫
组织化学染色）；E:第三代细胞C〇12表达（免疫组织化学染色）.
图1原代大鼠关节软骨细胞培养及鉴定（X200)
2.2单纯S A处理及S A处理后的RBL-2H3细胞培养上清液对软骨细胞毒性的影响
SA、活化后的RBL-2H3细胞以及S A处理的 RBL-2H3细胞上清液分别作用于软骨细胞24 h，MTT法检测软骨细胞的活性。

结果显示，（0~ 10〇W m L S A对软骨细胞无毒性作用（图2A);同时，与正常对照组比较，活化后HBL-2H3细胞和SA 处理的细胞上清液对软骨细胞活性变化不明显，差 异无统计学意义（P>0.05,图2B)。

以此证实，可
选用此优化条件进行后续其他相关实验的验证。

A : MTT 法检测S A 对软骨细胞活性的影响；
B : MTT 法检测不同剂量 S A 作用后RBL -2H 3细胞上清液对软骨细胞活性的影响.1:正常软骨细胞
对照组；2: C 48/80活化RBL -2H 3细胞培养上清液处理组；3: 3
SA
处理后的RBL -2H 3细胞上清；4: 10 pg/mL S A 处理后的RBL -2H 3细 胞上清；5: 30 pg/rnL S A 处理后的RBL -2H 3细胞上清.
图2不同剂量SA 及SA 处理后RBL -2H 3细胞培养上清液对
软骨细胞增殖的影响
2.3 S A 处理的RBL -2H 3细胞培养上清液抑制软骨 细胞CollO 蛋白表达，增加Col 2蛋白表达
各处理组作用于软骨细胞24 h 后，收集细胞， 提取蛋白，进行蛋白含量的测定，Western blot 法检 测。

结果显示，与软骨细胞对照组比较，随着S A 剂 量的增加能够显著增加C 〇12蛋白表达，而与活化后 的R B L -2H 3细胞上清液处理组比较，S A 剂量越大, C o l l O 蛋白表达降低越明显（图3A 、B )。

不同处理组 分别作用于软骨细胞爬片24 h ,然后进行C o l l O 免疫 组织化学染色。

结果显示，正常组有少许C o l l O 蛋白 的表达；与正常组相比较，活化R B L -2H 3细胞培养 上清液处理组的软骨细胞显著合成C o l l O ;与活化 R B L -2H 3细胞培养上清液处理组相比，随着S A 剂量 的增加，软骨细胞表达的C o l l O 逐渐减少，差异有统 计学意义（P <〇.〇5,图3C 、D )。

活化R B L -2H 3细胞 培养上清液处理的软骨细胞C o l l O 的表达增加，提示 上清液对软骨细胞具有刺激作用，可诱导软骨细胞 向肥厚软骨细胞分化，而S A 处理可抑制该作用。

2.4 S A 处理的活化RBL -2H 3细胞培养液促进软 骨细胞GAG 分泌
经D M B 试剂盒检测上清液G
A G
含量。

与空白
10
30
SA 削■ (ng/mL)
A
12〇 r
对照组相比，S A 活化的R B L -2H 3细胞模型组显著降
低软骨细胞内G A G 的含量，与C 48/80活化
R B L -2H
3细胞模型组相比，随着S
A
剂量的增加，显
著促进软骨细胞内G
A G
的合成（表1)。

A : Western blot 法检测软骨细胞Col 2和CollO 的蛋白表达；
B :软骨细
胞Col 2和CollO 蛋白水平的半定量分析；C :软骨细胞CollO 的表达 (免疫组织化学染色法，x 200); D :软骨细胞CollO 表达量的半定量 分析.1:正常软骨细胞；2:活化RBL -2H 3细胞培养上清液处理组; 3 : 3 pg/mL S A 处理后活化RBL -2H 3细胞培养上清液处理组; 4: 10 p g /m L S A 处理后活化RBL -2H 3细胞培养上清液处理组; 5 : 30 pg/mL S A 处理后活化RBL -2H 3细胞培养上清液处理组.
aP <0.05, bP <0.01 i;s 1； C P <0.05, dP <0.01 vs 2.
图3软骨细胞C 〇12和CollO 蛋白的表达及半定量分析
表1 DMB 法检测SA 处理的活化RBL -2H 3细胞培养液对软骨细胞中GAG 含量的影响
(u =3，a ;±s )
分组
GAG C( jjLg/mL)正常软骨细胞对照组
C 48/80活化RBL-2H3细胞培养上清液处理组 3 mL S A 作用后的活化RBL-2H3细胞培养上清液处理组 10 ^ mL S A 作用后的活化RBL-2H3细胞培养上清液处理组 30以
mL S A 作用后的活化RBL-2H3细胞培养上清液处理组
87.27 ±5.09 53.22±3.28b 56. 67 ±4. 19 65.78 ±4. 13c 85.24±3.47d
4<0.01 w 正常软骨细胞对照组；7<0.05, dP <0.01仍C 48/80活
化RBL -2H 3细胞培养上清液处理组.
(
％)32v --a 5
80
(％r 5E a s
604020
三
三£
=1
311
1
_
參k
I
A
B
c
D
懈 O I O
U
A : ELISA 检测软骨细胞培养上清液MMP 13含量；
B : ELISA 检测软骨
细胞培养上清液sRANKL、OPG 含量；C : sRANKL/OPG 比值的半定 量分析.1:正常软骨细胞对照组；2: C 48/80活化RBL -2H 3细胞培养 上清液处理组；3: 3 pg/mL S A 处理后活化RBL -2H 3细胞培养上清液 处理组；4: 10 jxg/mL S A 处理后活化RBL -2H 3细胞培养上清液处理 组；5: 30 pg/mL S A 处理后活化RBL -2H 3细胞培养上清液处理组. bP < 0.01 v s \； CP < 0.05, d P <0.01 v s 2.
图4 ELISA 检测软骨细胞上清液MMP 13、sRANKL 及OPG
的含量
2.5 S A 处理的RBL -2H 3细胞培养上清液抑制软骨 细胞 MMP 13、sRANKL 表达，降低 sRANKL/OPG 比值
S A
处理的活化R B L -2H 3细胞培养液作用软骨
细胞48 h 后，收集软骨细胞上清液，用对应E U S A 试剂盒进行相关蛋白的检测。

检测结果显示，与软 骨细胞对照组相比较，C 48/80活化的R B L -2H 3细胞 培养液能够显著增加M M P 13和s R A N K L 的表达， 0P
G
也有所升高，但
s R A N K I V O P G
比值明显增加;
与活化R B L -2H 3细胞培养液处理组相比，随着S A
浓度的增加明显降低M M P 13和s R A N K L 的表达同时 降低s R A N K L /O P G 比值（图4)。

3讨论
R A
由多种病因引起，是一种复杂的自身免疫性
疾病包括软骨和骨组织的损伤。

目前，现代医学还 未寻找到最佳防治R A 软骨和骨破坏的方法，因此， 防治软骨和骨破坏是目前研究治疗R A 的重点。

近 年来R A 的治疗取得了突破性进展，随着对改善病 ‘倩抗风湿药（disease modifying antirheumatic drugs , D M A R D
)包括非留体抗炎免疫药（non-steroidal anti ­inflammatory-immune drugs ， N S A I I D )、 生 物制剂 、慢
作用抗风湿药（slow acting anti-rheumatic drugs , S A A R D )和激素类药物等的合理应用M5]，绝大多数 R A 患者的病情进展能够得以控制依据大量基础研究 和临床应用，但由于目前的R
A
治疗药物易使病症
反复、不良反应多、价格较高、患者依从性差等缺 点，需要找寻新的高效、毒副作用小的药物。

中药在 R A 治疗方面具有显著的疗效。

随着植物提取剂大多 因具有抗炎、镇痛和免疫调节等作用而被应用于防 治
R A
药物的研发，且取得了一定的成果。

据中国
药典记载，木瓜可被用于湿痹拘挛，腰膝关节炎疼痛 等。

近年来对木瓜成分和药理作用的研究越来越深 人，其多种成分如木瓜乙酸乙酯[16]、木瓜三萜1171、 S A [3]均表现出抗炎作用。

由于资木瓜的活性成分尚 不清楚，在抗R A 中的作用机制尚无法清楚阐明，使 得还未研发出与资木瓜相关的高效治疗R A 的中药 新药。

深入研究资木瓜成分，探讨其成分对抗R A 的作用机制，为中药新药的研发提供实验基础。

近来有研究表明，M C 对各类细胞及疾病都有一 定的影响，如M C 可以促进辅助T (T helper ，T h )细 胞在脑膜中聚集，细胞因子分泌增加可提高脑炎的 风险[18]; M C 和嗜碱性粒细胞的相互作用会引发过 敏性炎症反应[19]; M C 在一定刺激下被激活发生脱 颗粒反应，释放P 己糖胺酶（P - hexosaminidase )、组 胺、肿瘤坏死因子 a (tumor necrosis factor a ，T N F -ot )、 类胰蛋白酶等炎症介质[2°]，释放多种生物活性介质 与对应受体相互结合，会引发某些病理变化，进而导 致一些疾病的发生，如R A 、皮炎[21]、牙周炎[22]等疾 病。

而越来越多研究发现，M C 在R A 的早期发挥作 用[12],影响着R A 的全过程。

S A 是从资木瓜中提取 的有机酸成分之一，现代药理研究显示，其在抗菌、 抗炎、抗病毒及心脑血管系统等方面发挥较强的药 理作用[23]。

此外，软骨细胞分泌M M P 家族等蛋白 水解酶导致软骨降解[24]。

研究表明，M M P 家族与骨 侵蚀关系密切，是R A 关节破坏的重要因素，其水平 影响R A 的预后，是预测关节破坏的重要指标[25]。

M M P 家族几乎可以降解细胞外基质的所有成分，尤
6
4
A
(-J E/SUKIdi
B
(
1E /S 3T 9a .o -i ->l z v a :s
s lo d o /l-M N
—
其是Col2和G A G。

R A N K i y R A N K/O P G系统是联系 免疫系统紊乱与骨破坏的一个重要通路，S R A N K I7 O P G比值是骨破坏的经典指标[26]。

软骨细胞的功能 异常可能是R A关节软骨和骨破坏的主要原因，这暗 示M C与软骨细胞有着密不可分的潜在关系。

目前在M C到软骨细胞引发R A方面研究甚少，导致其相互作用机制不清，同时相关药物开发也没 有突破，基于这一现状，前期研究发现，S A对 R B L-2H3细胞以及原代大鼠腹腔肥大细胞（rat peritoneal mast cells,R P M C)具有显著的抑制脱颗粒 作用，但是并未深入探究S A对软骨细胞的影响，也 没有研究S A是通过何种机制作用软骨细胞的。

因此，本研究从抑制软骨组织损伤角度考虑，基于M C 与A C相互作用，探讨资木瓜活性成分S A抗R A的作用机制，为S A治疗R A提供有价值的实验依据。

本研究采用M T T法检测S A单独及S A处理后 R B L-2H3细胞的培养上清液对软骨细胞毒性的影响，结果显示S A单独及S A处理后R B L-2H3细胞培养上 清液对软骨细胞活性无显著影响，从而选择合适剂 量的S A及S A处理后R B L-2H3细胞培养上清液作用 于软骨细胞。

结果发现S A不直接参与影响软骨细胞 的活性，但活化后的R B L-2H3细胞上清液作用于软 骨细胞中，结果显示活化的上清液能够显著性增加 sR A N K L/0P G的比值和M M P13的含量，且C o l l O的表达显著性增加，C〇12和G A G表达降低，而S A处 理后的活化R B L-2H3细胞上清可显著减弱这种抑制 作用，阳性组中O P G的含量较正常组有所增加，而 未低于正常组其原因可能是软骨细胞过表达R A N K L 的同时刺激分泌相应的0P G保护软骨细胞。

即M C 与软骨细胞之间存在相互依赖关系，提示M C可能加 速增殖软骨细胞向肥厚软骨细胞的分化，而S A可以 逆转这一作用。

参考文献：
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Shikimic acid extracted from Chaenom eles speciosa reduces chondrocyte differentiation by inhibiting RBL-2H3 cell degranulation
CHEN Guiting,ZHENG Qianqian,YU Jie,YAN Mengzhen,ZHOU Tingting,CAO Houping,LI Shigang*
Three-Level Laboratory for Traditional Chinese Pharmacologic (Tumor) Research, Medical College, China Three Gorges University, Yichang 443002, China
* Corresponding author, E-mail：**************
[A b s tr a c t] Objective To investigate the reducing effects of shikimic acid from the total extract of Chaenomeles speciose on the differentiation of chondrocytes into hypertrophic chondrocytes by inhibiting RBL-2H3 cell degranulation. Methods The chondrocytes were identified by toluidine blue staining and tryptase immunohistochemical staining. The chondrocytes were divided into normal chondrocytes control group, C48/80 activated RBL-2H3 cell culture supernatant treatment group, 3, 10 and 30 pg/mL SA activated RBL-2H3 cell culture supernatant treatment groups. The toxicity of SA and RBL-2H3 cell supernatant were detected by MTT assay. Western blotting was used to detect the expression of collagen type n (Col2) and collagen type X(CollO) in chondrocytes. The levels of matrix metalloproteinase 13 (M M P13), soluble nuclear factor B receptor activated protein ligand ( sRANKL) and bone protective factor (〇PG ) were determined by ELISA, and glycosaminoglycan polysaccharide (GAG) were tested by dimethylmethylene blue (DMB) colorimetry. Results (0 〜30) pg/mL SA had no significant effects on the growth of chondrocytes. Compared with the C48/80 activated RBI-2H3 cell supernatant treatment group, the expression of Col2 and GAG proteins increased significantly, while the expression of CollO and MMP13 and the ratio of sRANKl_/OPG decreased significantly in the SA treatment groups in a dose-dependent manner. Conclusion SA can effectively reduce the differentiation of chondrocytes into hypertrophic chondrocytes by inhibiting RBL-2H3 cell degranulation. [Key words] Chaenomeles speciosa；shikimic acid (S A) ；RBL-2H3 cells；chondrocytes；differentiation。