基于入血成分的金铁锁药材质量标准研究

基于入血成分的金铁锁药材质量标准研究
采用高效液相色谱法建立了金铁锁药材中尿囊素的含量测定方法。

金铁锁药材经乙醇提取后，取续滤液进行分析。

采用ZORBAX NH2色谱柱（4.6 mm ×150 mm，5 μm），检测波长220 nm，柱温40 ℃，流动相为乙腈-水（93∶7），流速1.0 mL·min-1。

结果表明，尿囊素线性关系良好，具有较好的精密度和重复性。

在0.010 4 ～0.166 g·L-1，尿囊素的线性相关系数R2=0.999 4（n=5）；RSD （n=6）小于2.1%；平均回收率为95.47%～100.9%。

该方法具有良好的灵敏度、回收率和重复性，可为金铁锁药材的质量控制提供参考。

标签：金铁锁；入血活性成分；尿囊素；高效液相色谱
中药是一个复杂的化学体系，它对人体的作用通常也被认为是多成分和多靶点综合效应的结果，因此中药材的质量标准的制定与西药有着跟本的区别。

目前，从化学物质基础的角度来制定中药材的质量标准方法主要有色谱法、光谱法以及质谱法等。

然而不管选取哪种方法作为中药材的质量控制方法，都必须先选择好合适的对照品。

通常对照品的选择大部分都是药材中含量相对较大的特征化合物或者是有效成分。

前者虽然是中药材中所含有的主要化合物，但是并不一定是中药材发挥药效作用的化合物，因此选择这样的化合物作为指标性化合物制定的中药材质量标准不能从根本上控制中药材的质量。

后者是中药材中具有一定生物活性的化合物，用它来制定中药村的质量标准有一定的理论意义和实践意义。

传统中药多为口服给药，其有效物质必须以血液为介质输送到靶点，从而产生作用，因而给药后的血清才是真正起作用的“制剂”，血清中含有的成分才是中药的体内直接作用物质，入血后的活性成分才是真正的有效成分[1-2]。

金铁锁Psammosilene tunicoides为石竹科金铁锁属植物的干燥根，主要分布在贵州、云南、四川、西藏等中国西南地区，是我国西南地区特有的单属种植物，也是贵州民间常用药物，现已作为稀有濒危物种列于《中国植物红皮书》中，属国家二级保护植物。

金铁锁以根入药，具有散瘀定痛、止血、消痈排脓之功，用于跌打损伤、风湿痛、胃气痛、创伤出血等的治疗[3-5]。

金铁锁被收录于《中国药典》2010年版中，但在该标准中没有用其化学成分为指标的质量标准项。

本研究以金铁锁中的入血化学成分（尿囊素）为指标，建立了金铁锁药材中尿囊素HPLC含量测定方法，该方法的精密度高，重复性好，稳定性好，回收率高，测定结果准确，可为控制金铁锁药材的质量提供科学依据，同时为以化学成分为指标的中药材质量标准的制定提供参考。

1 材料
高效液相色谱仪Ultimate300高效液相色谱仪（包括四元泵，在线脱气机，自动进样器，二极管阵列检测器，柱温箱），1/10万电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），KQ5200E型超声波清洗（昆明市超声仪器有限公司）。

色谱乙腈；水（重蒸水，临用前制备）；无水乙醇；尿囊素对照品（中国食品药品检定研究院，1501-200001）；金铁锁药材经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为金铁锁P. tunicoides（6个不同产地）。

2 方法与结果
2.1 样品前处理
2.1.1 血浆样品前处理取干燥、粉碎后的金铁锁药材2.0 g，用30 mL 20%乙醇进行超声提取2次，合并提取液，减压浓缩回收溶剂后得金铁锁提取物。

取适量金铁锁提取物用水溶解，配成浓度为20 g·L-1的溶液，通过灌胃给药方式给大鼠（210 g）金铁锁提取物水溶液3 mL，分别在10，30，60，120 min后对大鼠进行采血，将血液离心后取上层血浆100 μL用乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀后离心，将上层清液于氮吹仪上吹干，取93%乙腈100 μL进行溶解，离心后待测。

空白血浆按同样方法处理。

2.1.2 药材前处理取金铁锁药材2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶或三角瓶中，加入20%乙醇30 mL，称定质量，超声提取40 min，补重后取续滤液进行测定。

2.2 标准溶液的配制
精密称取适量尿囊素对照品1.66 mg，加20%乙醇制成每1 mL含0.166 mg 的标准储备液，根据需要用20%乙醇稀释成不同质量浓度的标准工作液，即用即配。

2.3 高效液相色谱条件
ZORBAX NH2色谱柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（93∶7）；流速1.0 mL·min-1；检测波长220 nm；柱温40 ℃；进样量5 μL。

2.4 入血实验结果
将处理好的血浆样品经高效液相色谱仪测定，通过尿囊素对照品及空白血浆样品的高效液相色谱图的比较，确定尿囊素为金铁锁药材中的1个入血化学成分，其结果见图1。

2.5 提取条件的选择
分别采用回流和超声2种提取方式进行提取，发现超声提取效果较好。

对不同浓度的乙醇以及溶剂用量、提取时间和次数进行了考查，最终确定提取条件为30 mL 20%乙醇超声提取40 min。

2.6 检测波长的选择
根据文献[6-7]以及多次实验考察，发现检测波长为220 nm时效果较好。

2.7 柱温的选择
考察了不同柱温对尿囊素分离效果的影响，结果发现，柱温为40 ℃时，峰形较好，分离度较好。

2.8 线性关系的考察
精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的尿囊素1.66 mg于10 mL量瓶中，加20%乙醇配成0.166 g·L-1的对照品储备液。

分别制备得0.010 4，0.020 8，0.041 5，0.083，0.166 g·L-1 5个质量浓度的溶液，分别精密吸取该对照品系列溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，并以对照品的峰面积（X）为横坐标，浓度（g·L-1）Y为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程Y=0.013 7X+0.001 2，R2=0.999 4（n=5），结果表明，尿囊素在0.104～1.66 mg线性关系良好。

2.9 精密度试验
吸取尿囊素对照品溶液5 μL，按上述色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算日内精密度，RSD为0.46%，说明该方法具有良好的精密度。

吸取尿囊素对照品溶液5 μL，按上述色谱条件，每天进2次，连续测定3 d，计算日间精密度，RSD为0.95%，说明该方法具有良好的精密度。

2.10 重复性试验
取同一批金铁锁药材各2.0 g，共6 份，按照2.1样品前处理方法制备供试液。

精密吸取供试品溶液5 μL，注入高效液相色谱仪，按照2.3色谱条件测定尿囊素的峰面积积分值，计算含量，求相对标准偏差。

结果表明，此方法测定尿囊素的重复性良好，RSD 2.1%。

2.11 稳定性试验
取同一批金铁锁药材2.0 g，按2.1制备供试液，在室温下分别于0，2，4，8，12，24 h精密吸5 μL进样，测定尿囊素的峰面积积分值，计算含量，求相对标准偏差。

结果表明尿囊素在24 h内基本稳定，RSD 1.6%。

2.12 准确度试验
采用加样回收法，取已知含量的样品，精密称定，分别精密加入一定量的尿囊素，按照2.1制备供试液，按上述测定方法进行测定，计算回收率，结果见表1。

2.13 样品测定结果
按照2.1和2.2制备供试品溶液和对照品溶液，分别进样，记录色谱图，计算尿囊素的含量，结果见表2，图2。

3 讨论
文献[8]报道尿囊素具有抗刺激物、麻醉镇痛和消炎抑菌等作用，常用于治疗手足皲裂、鱼鳞病、多种角化皮肤病。

此外，尿囊素还被用作糖尿病、肝硬化及癌症治疗剂的重要成分，还可用于治疗骨髓炎等。

首先确定尿囊素为金铁锁药材中的一个入血化学成分，且尿囊素具有一定的生物活性，然后以该入血成分为指标，建立了金铁锁中的尿囊素含量测定方法。

本方法的精密度高，重复性好，稳定性好，回收率高，测定结果准确，可有效控制金铁锁药材的质量。

同时可为中药材质量标准的制定提供一种新的思路及参考。

[参考文献]
[1] 雷志丹，雷志钧，夏新华.川芎血清药物化学的初步研究[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（12）：96.
[2] 王本祥，周秋丽.关于中药活性成分的认识及其研究方法[J].中国中药杂志，2001，26（1）：10.
[3] 中国药典. 一部[S]. 2010：205.
[4] 国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草.苗药卷[M].贵阳：贵州科技出版社，2005：372.
[5] 王垄，龚小见，周欣，等.金铁锁化学成分及抑菌活性研究[J].中国中药杂志，2012，37（23）：3577.
[6] 李明静，宋爱新，史会齐，等.高效液相色谱法测定山药样品中尿囊素的含量[J].化学研究，2003，14（1）：66.
[7] 张芳芳，李伟东，杨光明，等.HPLC法测定麸炒山药饮片中尿囊素的含量[J].南京中医药大学学报，2010，26（2）：146.
[8] 孔晓朵，白新鹏.山药的活性成分及生理功能研究进展[J].安徽农业科学，2009，37（13）：5979.
Study on quality standard of Psammosilene tunicoides based on
absorbed active components in rat plasma
GONG Xiao-jian1，2 ，ZHOU Xin1，2* ，CHEN Hua-guo1，2 ，ZHAO Chao1，2 ，ZHAO Yang1，2 ，YANG Shi-lin1，2
（1.The Research Center for Quality Control of Natural Medicine，Guiyang 550001，China；
2.Key Laboratory for Information System of Mountainous Areas and Protection of Ecological Environment，Guiyang 550001，China）
[Abstract] A method for determintion of allantion in Psammosilene tunicoides was established by HPLC. Using alcohol as the extraction solvent，the subsequent filtrate of P. tunicoides was analysed by HPLC. Allantoin was successfully detected and separated by ZORBAX NH2 column （4.6 mm × 150 mm，5 μm）at wavelength of 220 nm and column temperature of 40 ℃，with acetonitrile-water （93∶7）as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL·min-1. The results showed that it had a good linear relationship between the concent ration of allantion and chromatographic peak area. The linear correlation coefficient of allantion was 0.999 5 in 0.010 4-0.166 g·L-1. The relative standard deviation of six parallel injections was less than 2.1%. The average recoveries were ranged from 95.47% to 100.9%. This method was sensitive and accurate for the determination of allantion in P. tunicoides.
[Key words] Psammosilene tunicoides；absorbed active components in rat plasma；allantion；HPLC
doi：10.4268/cjcmm20131323。