色谱峰,色谱柱及参数(精制知识)
色谱图和峰参数
色谱图和峰参数色谱图和峰参数Ø色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。
Ø基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴。
Ø噪音(noise)——基线信号的波动。
通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
Ø漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。
主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
Ø色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。
流出曲线上的突起部分。
正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。
不对称色谱峰有两种:前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。
前者少见。
Ø拖尾因子(tailing factor，T)——T,，用以衡量色谱峰的对称性。
也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。
《中国药典》规定T应为0.95~1.05。
T,0.95为前延峰，T,1.05为拖尾峰。
Ø峰底——基线上峰的起点至终点的距离。
Ø峰高(peak height，h)——峰的最高点至峰底的距离。
Ø峰宽(peak width，W)——峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。
W,4σØ半峰宽(peak width at half-height，W)——峰高一半处的峰宽。
Wh/2h/2,2.355σØ标准偏差(standard deviation，σ)——正态分布曲线x,?1时(拐点)的峰宽之半。
正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。
色谱柱基础知识的总结
色谱柱基础知识简介一、色谱柱工作原理当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。
由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出二、色谱柱的分类2.1 色谱柱主要分为填充柱和毛细管柱注：此外，还有一些综合了填充柱和毛细管柱特点的特殊色谱柱，例如Alltech 公司采用专利技术生产的集束管毛细管柱。
2.2 填充柱与毛细管柱的比较表1 填充柱与毛细管柱的比较色谱柱内径/mm 长度/m柱材料柱容量载气流速填充柱2-50.5-3玻璃或金属材质mg20-30mL/min毛细管柱0.10-0.810-100熔融石英或不锈钢、聚酰亚胺涂层ng1-10mL/min注：毛细管柱外层为聚酰亚胺，可修补柱子缺陷（即增强柔韧性）并且增加强度。
三、填充柱3.1 填充柱的构成3.1.1 填充柱的柱管填充柱可以使用任何类型的柱管，只要它对样品是清洁,、惰性的, 以及能够承受GC 的柱箱温度，像：不锈钢管、玻璃管、铜管、聚四氟乙烯管、聚合物管等。
3.1.2固体载体（颗粒）和固定相近距离观察一个填充颗粒,会发现它是由一个固体载体（颗粒）和在它上面均匀涂渍的涂敷物（叫做固定相）所组成。
固体载体即液态固定相附着的载体，其细小、均匀、多孔，增加与样品接触的表面积。
常用的固体载体为硅土。
固体载体也有不同大小的颗粒度，颗粒度是指“目数大小”。
一般是根据柱径来选择固体载体的粒度，保持载体的直径为柱内径的1/20 为宜。
常用60-80目及80-100目。
表 2 直径大小与目号的关系四、毛细管柱4.1 毛细管柱的构成毛细管色谱柱由两个主要部分组成：管身和固定相。
4.1.1 管身毛细管柱的管身一般使用熔融二氧化硅或不锈钢作为基本材质。
熔融二氧化硅即高纯度合成石英（以下通称熔融石英），通常在其表面涂上一层聚酰亚胺做为保护层。
有关色谱保留的基本术语及参数
固定相的粒径
固定相的粒径大小影响色谱分离的效 率和分离度，粒径越小，分离效率越 高，但同时也会增加柱压和减少柱寿 命。
流动相的性质
流动相的选择
流动相的选择对色谱分离效果也 有重要影响，需要根据不同物质 的性质选择合适的流动相。
流动相的极性
流动相的极性影响物质的溶解度 和在固定相上的吸附力，极性强 的流动相有利于极性物质的分离 。
优化分离时间的方法
可以通过提高流速、减少进样量、选择合适 的色谱柱和检测器等方法来缩短分离时间。
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峰宽
峰宽（Peak Width）
色谱峰的高度与基线之间的距离，用于衡量色谱峰的宽度。
峰宽计算公式
$W = frac{H}{2sqrt{2ln 2}}$，其中$H$为色谱峰的高度。
塔板数
塔板数（Number of Plate）：用于衡量色谱柱对物质的分 离能力。
塔板数计算公式：$N = frac{16pi^2mu L}{E^2Delta t}$， 其中$mu$为流动相流速，$L$为色谱柱长度，$E$为扩散系 数，$Delta t$为保留时间差。
03
在实际应用中，可以通过实验条件优化，如调整温度、流速等
，来提高分离效果和分离速度。
03
色谱参数
分离度
分离度（Resolution，R）
相邻两色谱峰之间距离与峰底宽度的比值，用于衡量色谱峰的分离程度。
分离度计算公式
$R = frac{2(t_{2} - t_{1})}{W_{1} + W_{2}}$，其中$t_{2}$和$t_{1}$分别为相邻 两峰中后峰和前峰的保留时间，$W_{1}$和$W_{2}$分别为相邻两峰的峰底宽度 。
后延峰
液相色谱的结构原理和基本知识 液相色谱操作规程
液相色谱的结构原理和基本知识液相色谱操作规程液相色谱(HPLC)法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的固定相的柱色谱分离技术。
液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。
在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用液相色谱来分析。
液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。
液相色谱分析原理(1)、液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在佳条件下得以分离。
(2)、液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。
色谱柱参数
色色谱谱柱柱的的参参数数
载碳量
硅胶表面键合相的比例 与比表面积，键合覆盖度等有关 对ODS，载碳量从7-18%（ODS-100Z为20%）不等 ODS的载碳量高， 则保留增加，适合分析非极性化合
物。制备色谱的上样量也可以增加 载碳量通常影响选择性
色色谱谱柱柱的的参参数数
硅胶表面性质-纯度
Super-ODS为2 μm 填料，UPLC为1.7 μm填料 3cm以下的制备色谱柱通常使用5-10 μm填料 更大内径的制备色谱柱通常使用更大的粒径，如10 μm, 或20 μm
色色谱谱柱柱的的参参数数
孔径
孔径小，含孔率高，则 比表面积大，载碳量高
化合物在孔内分离 孔径大小必须和分子大小相匹配，分子必须能进入孔内，一般小分
CH3
monomeric bonding
柱效高, 平衡快
OH
CH3
+ X Si (CH2)17CH3
OH
X
稳定性好， 制备上样量大
polymeric bonding
R Si (CH2)17CH3 R
O
CH3
Si
O
(CH2)17CH3
色色谱谱柱柱的的参参数数
ODS柱的特征结构
色色谱谱柱柱的的参参数数
强极性化合物使用AQ色谱柱(ODS-100V) 高比表面积和载碳量可以提高制备色谱的上样
量
TTSSKKGGEELL反反相相色色谱谱柱柱选选择择一一览览表表
硅胶填料：
TSK-GEL
固定相
ODS-100V
C18
ODS-100Z
C18
ODS-100S
C18
ODS-120T
C18
色谱柱名词解释
色谱柱是色谱分析中使用的一种关键设备，用于将混合物中的成分分离并进行定性和定量分析。
以下是一些与色谱柱相关的常见名词解释：
1. 固定相（Stationary Phase）：色谱柱中的固定涂层或填料，具有特定的化学性质和分离能力。
样品在固定相中发生相互作用，导致不同成分以不同速度移动并被分离。
2. 流动相（Mobile Phase）：用于携带样品通过色谱柱的流体，可以是气体（气相色谱）或液体（液相色谱）。
流动相的选择取决于分析目标和色谱柱类型。
3. 柱效（Plate Number）：用于描述色谱柱分离能力的度量。
柱效越高，表示色谱柱的分离效果越好。
4. 保留时间（Retention Time）：在色谱柱中，样品组分从进样到检测器出现的时间。
保留时间可以帮助确定化合物的特征和纯度。
5. 色谱峰（Chromatographic Peak）：色谱图中呈现出的高度峰值，表示在特定保留时间内检测到的样品成分。
6. 柱温（Column Temperature）：色谱柱的操作温度，可以对分离效果和分析速度产生影响。
某些分析方法需要在特定的温度下进行。
7. 柱寿命（Column Lifetime）：色谱柱使用期限，取决于使用条件和期间的保养和维护。
柱寿命的结束通常由分离性能下降或峰形变得不规则来决定。
色谱参数及色谱图方面的术语
（一）色谱参数1、死时间：不被固定相滞留的组分，从进样到出峰最大之所需的时间。
2、保留时间：组分从进样到出峰最大之所需的时间。
2.1调整保留时间：减去死时间保留时间。
2.2校正保留时间：用压力梯度校正因子修正的保留时间。
2.3净保留时间：用压力梯度校正因子修正的调整保留时间。
3、死体积：不被固定相滞留的组分，从进样到出峰最大之所需的载气体积。
4、保留体积：组分从进样到出先峰最大之所需的载气体积。
4.1调整保留体积：减去死体积的保留体积。
4.2校正保留体积：用压力梯度校正因子修正的保留体积。
4.3净保留体积：用压力梯度校正因子修正的调整保留体积。
5、比保留体积：每克固定液校正到273K时的净保留体积。
6、相对保留值：在相同操作条件下，组分与参比组分的调整保留值之比。
7、分配系数：在平衡状态下，组分在固定液与流动相中的浓度比。
8、容量因子在平衡状态时，组分在固定液与流动相中的质量之比。
9、柱效能：色谱柱在色谱分离过程中主要由动力学因素所决定的分离效能。
通常用理论板数，理论板高或有效板数表示。
9.1理论板数：表示柱效能的物理量。
9.2理论板高：单位理论板的长度。
9.3有效板数：减去死时间后表示柱效能的物理量。
10、分离度：两个相邻色谱峰的分离程度，以两个组分保留值之差与其平均峰宽值之比表示。
11、灵敏度：通过检测器的物理量变化时响应信号的变化率。
12、检测线：随单位体积的载气或在单位时间内进入检测器的组分所产生的信号等于基线噪声二倍时的量。
13、线性范围：检测信号与被测物质的量呈线性关系的范围。
14、载气流速：在色谱柱出口的温度和压力下测得并校正到柱温时的载气体积流速。
（二）色谱图及其他1、色谱图：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或载气流出体积的曲线图。
2、色谱峰：色谱柱流出组分通过检测系统时所产生的响应信号的微分曲线。
3、峰底：从峰的起点与终点之间连接的直线。
4、峰高：从峰最大值到峰底的距离。
如何选择正确的气相毛细管色谱柱型号及规格
气相毛细管柱是气相色谱柱中最常见，使用频率最多的色谱柱，常规的测试应用基本以此为主。
想要实验顺利选择合适的柱子非常重要。
一根合适的柱子才能保证我们能得到想要的色谱分离结果，错误的选择柱子可能会导致色谱峰间的分离度或者理论塔板数无法达到我们的测试要求。
选择合适的柱子第一要素是我们需要了解色谱柱的规格参数。
毛细管柱的规格参数是什么呢？那就是长度、内径和膜厚，以及固定相种类。
当拿到一根柱子，首先会看到一个CD-5，30m*0.25mm*0.25um类似这样的标识。
它表示：这些参数是固定的吗？当然不是，格式是固定的，但是里面的型号是可以改变的。
柱子长度关于毛细管柱，商品化柱子长度可以从5米至100米不等，我们可以根据自己的实验需求选择合适的长度规格，选择依据一般是组分越简单柱长越短，所以100米规格的色谱柱并不多，除一些专用柱除外。
最常见的色谱柱长度规格是30m。
长度会影响色谱柱的分析时间，快速分析时建议选择短柱子（5米、10米、15米）。
在内径和膜厚相同的情况下，一般长柱子可以提高分离度，当然分析时间也会相应增加。
例如60米柱子与30米柱子相比，分离时间可能是其两倍。
另外色谱柱越长也会增加柱流失、影响柱惰性。
内径规格关于毛细管柱，商品化柱子内径规格有0.1毫米、0.15毫米、0.18毫米、0.2毫米、0.25毫米、0.32毫米、0.45毫米、0.53毫米、0.8毫米。
色谱柱内径的大小对分离效果的影响非常明显，内径越小色谱柱的塔板数就越高，柱效越高。
但是载样量会减少。
使用细柱子需要关注载样量，过载就会导致柱效降低。
经过专家和学者以及实验人员长期的实验摸索，累计的经验是：痕量级杂质的分析多选用0.53毫米内径的色谱柱。
0.32毫米色谱柱可以相对兼顾到进样量和柱效。
实验室最常用的规格是0.25mm内径色谱柱。
一般GC/MS中使用的柱子大多是0.25mm内径。
此外，对于快速分析来说，0.1mm和0.2mm最有优势。
3种色谱参数的详细说明
3种色谱参数的详细说明
1、色谱柱柱效参数：
色谱柱的柱效通常是用理论塔板数或有效理论塔板数来衡量，而它们的大小又与区域宽度有直接关系。
区域宽度：这个色谱流出曲线上的一个重要参数，它的大小反映色谱柱与所选色谱条件的好坏，从色谱分离的角度着眼，希望区域宽度越窄越好，通常度量色谱区域宽度有三种方法：标准偏差，峰宽以及半峰宽。
2、色谱的分离参数：
塔板数和塔板高度：色谱分析的前提是待测组分的分离，而无论柱效参数还是选择性参数均反映不出分离效能的高低，为此引入了一个衡量色谱柱综合分离能力的指标-分离度。
分离度又称分辨率，它是以组分的分离情况来制定的，当两组分色谱峰之间的距离足够大，两峰不互相重叠，即保留值有足够的差别，且峰形较窄时，才可以仍为两组分达到了较好的分离，因此色谱图上相邻两峰的保留时间之差与峰宽均值的比值称为分离度，其定义式为：
式中tR1,tR2分别组分1.2的保留时间；W1,W2分别为组分1.2的峰宽，分离度作为两相邻色谱峰分离程度的量度，其值也大，表明两组分的分离情况越好，对于等面积的两色谱峰，当R=1时，两峰有5％的重合，两峰的分开程度为95％，而当R=1.5时，两峰的分离程度达99.7％，可认为两峰完全分离，如图所示，因此R=1.5可作为两峰完全分离的标志。
不同分离度时两峰分离情况
用色谱图上得到的信息，利用定义式可直接计算分离度，但并不能提现出影响分离度的因素，其影响因素将在色谱方程式中做具体阐述。
3、相平衡参数：
在色谱分离过程中，混合物中的两个组分要达到完全分离，其中重要的一点是两组分色谱峰间的距离必须足够大，也就是说两组分保留值的差别要足够大。
以上关于色谱的三种参数介绍，更多内容后期会更新，如果需要可以关注或者查
阅更多资料。
高效液相色谱基础知识总结
（LC-MS），有效的弥补了色谱法定性分析特征性差的弱 点，成为最重要的分离分析方法之一， LC-MS在选择性、 灵敏度、分子量测定和提供结构信息方面具有明显的优 势，能够同时获得可靠的定性定量结果，因而被广泛应 用于药物的质量控制（杂质、副产物、降解产物等的鉴 定和测定）、药物在生物体内的吸收、分布和代谢研究 （包括代谢物的结构确定及定量）和临床医学研究（如 蛋白异常的研究）。 LC-MS已成为新药研究必不可少的 手段。20世纪70年代，高效液相色谱法崛起克服了
高效液相色谱基础知识总结
二、基本概念和术语
一、色谱图和峰参数 1、色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器， 所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 2、基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到 平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行 于时间轴。基线反映仪器及操作条件的恒定程度，主要 由流动相中的杂质等因素决定。
键合相色谱法是将类似于气相色谱中的固定液的液 体，通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。
高效液相色谱基础知识总结
采用化学键合固定相的色谱法称为键合相色谱。若采用 极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非 极性键合相、极性流动相，则称为反相色谱。这种分离 的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子 间作用力的大小。
高效液相色谱基础知识总结
气相色谱法不能直接用于分析难挥发、热不稳定及高分 子化合物等的弱点，大大扩大了色谱法的应用范围，把 色谱法推进到一个新水平。
高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）是一种高效、快速的分离分析 技术，具有灵敏度高、选择性好的特点。HPLC具有的同 时分离和分析的功能对于体内药物分析和体内内源性物 质的分析及成分复杂的中药分析尤其重要。 HPLC的分离 功能还广泛用于药物的纯化和制备，如用制备色谱分离
色谱基本理论
色谱基本理论第一节色谱图及基本参数一、谱图：色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵标为信号强度(mv)，横坐标为保留时间(min)。
二、关术语：色谱峰(Peak)：色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线。
峰底(Peak Base)：峰的起点与终点之间连接的直线。
峰高h(Peak Height)：峰最大值到峰底的距离。
峰(底)宽W(Peak Width)：峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离.就是从色谱峰两侧的转折点(拐点)作切线，在基线上的截距叫峰底宽；简称峰宽；峰高一半处色谱峰的宽度叫半峰宽。
由于色谱峰顶呈圆孤形，色谱峰的半峰宽并不等于峰底宽的一半半(高)峰宽W1/2(Peak Width at Half Height)：通过峰高的中点作平行于峰的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离。
峰面积(Peak Area)：峰与峰底之间的面积，又称响应值。
标准偏差(σ)(Standard Error)：峰高的0.607倍处所对应峰宽的一半。
拖尾峰(Tailing Peak)：后沿较前沿平缓的不对称峰。
前伸峰(Leading Peak)：前沿较后沿平缓的不对称峰。
鬼峰(Ghost Peak)：不是试样所产生的峰，亦称假峰。
基线(Baseline)：在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号的曲线。
基线飘移(Baseline Drift)：基线随时间定向的缓慢变化。
基线噪声(N) (Baseline Noise)；由各种因素所引起的基线波动。
谱带扩展（Band Broadening）：由于纵向扩散，传质阻力等因素的影响，使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象。
三、保留值的基本参数保留时间(t R)(Retention time)：组分从进样到出现峰最大值所需的时间。
死时间(t M)(Dead time)：不被固定相滞留的组分从进样到出现峰最大值所需的时间调整保留时间(t’R )：t R’= t R-t M，即扣除了死时间的保留时间。
高效液相色谱法基本原理
高效液相色谱法基本原理
1．基本概念
色谱峰参数：峰高或峰面积(用于定量)，峰位(保留值表示，用于定性)，峰宽(用于衡量柱效)
保留值：保留时间、死时间、调整保留时间
峰宽：标准差、半峰宽、峰宽（色谱峰展宽是指由于柱内外各种因素引起的色谱峰变宽或变形，从而造成柱效降低）
2.塔板理论：把组分在两相间的连续转移过程，分解为间歇的在单个塔板中的分配平衡过程
理论塔板数 n=5.54(tr/wh/2)2
色谱柱的理论塔板数越多，柱效越高；同样长度中塔板高度越小，柱效越高。
3.速率理论：主要说明使色谱峰扩张而降低柱效的因素
范氏方程 h=a b/μ cμ
a为涡流扩散项。
采用适当粒度、均匀的填料并填充均匀可减小涡流扩散
b为纵向扩散系数。
流动相为液体，柱温为室温，b/μ可忽略不计
c为传质阻抗系数。
在能完全覆盖载体表面的前提下，应适当减少固定液用量。
色谱柱基础知识的总结
色谱柱基础知识的总结色谱柱是色谱分析中的重要工具，它是用来分离混合物中不同化合物的设备。
色谱柱的选择和使用对于色谱分析结果的准确性和灵敏度起着至关重要的作用。
下面将对色谱柱的基础知识进行总结。
色谱柱的种类主要包括气相色谱柱（GC柱）和液相色谱柱（LC柱）。
GC柱使得样品在高温下蒸发成为气态，然后通过柱子的分离效应进行分离。
LC柱是将可溶于液相的样品通过柱子的分离效应进行分离。
色谱柱的工作原理是样品分离的基础。
色谱柱的分离效应由固定填充物和流动相的选择决定。
固定填充物是色谱柱中的重要组成部分，分为填充型和包袋型。
填充型色谱柱常用的填充物有硅胶、氧化铝、氮化硅等。
填充型色谱柱适用于对极性物质的分离。
包袋型色谱柱通常是指薄层涂布型的液相色谱柱，常见的包袋型色谱柱有C18、C8、C4等。
包袋型色谱柱适用于对非极性以及中等极性物质的分离。
流动相的选择也是色谱柱分离效应的关键因素。
在GC柱中，通常使用气体作为流动相，常用的有氢气、氦气等。
在LC柱中，流动相一般是有机溶剂和缓冲液的混合物，常见的有甲醇、乙腈等。
流动相的选择要根据要分离的物质的属性，如极性、溶解度等进行合理选择，以提高分离效果。
色谱柱的选择要根据需要分离的物质的性质进行。
对于GC柱的选择，常见的指标有极性、温度范围、长度和内径等。
相对于液相色谱柱，GC柱的选择范围较窄，通常根据物质的极性选择合适的GC柱。
液相色谱柱的选择相对较为复杂，常见的指标有固定相类型、粒径、孔径、长度和内径等。
固定相的选择要根据样品的性质进行，如极性的物质选择极性固定相，非极性物质选择非极性固定相。
粒径和孔径的选择会影响柱子的分离效果和分析时间。
总之，色谱柱是色谱分析中的重要工具，其选择和使用对于色谱分析结果至关重要。
合理选择柱子的类型和填充物，以及优化流动相的组成和条件，能够提高色谱分离效果和分析灵敏度。
同时，良好的色谱柱的使用与保养也是保证色谱分析质量的重要环节。
只有不断深入了解和熟悉色谱柱的基础知识，才能更好地进行色谱分析工作。
色谱柱常识
因此，对于不同的被分析物要按实际情况选择封端或不封端的填料。
硅胶的化学性质—碳覆盖率
碳覆盖率（键合度）：与基体物质相连的键合相的量。
填料的选择性决定于键合的密度，尤其是在分离碳水化合物时，不同键合密度表现出不同的选择性。
碳覆盖率对色谱分离的影响：
* 双体键合：增加色谱柱稳定性，增加色谱柱的载样量
硅胶的化学性质—封端
封端：键合步骤之后，用小分子硅烷将裸露的硅羟基键合，以便获得更大的覆盖率。
封端多用于反相色谱键合中。
封端可消除或减少可能发生的二级反应。
没有封端的反相色谱填料通常比封端的有复杂多样的选择性。
碱性物质在不封端的填料上，容易产生拖尾。
色谱柱填料形状与粒径
基质：硅胶、二氧化铝、聚合物填料等
形状：球形和无定形
* 无定形：易制备、价格低；但涡流扩散大，渗透性差， 比较难填装出稳定的柱床，一般用来做制备柱。
* 球形：涡流扩散小，渗透性好，可填装出稳定的柱床。
* 高碳覆盖率：提高分辩率，分析时间长
* 低碳覆盖率：缩短运行时间
色谱柱分类
反相色谱柱：C18、C8、C3等
正相色谱柱：硅胶柱、氨基柱、氰基柱等
离子交换柱：有强阴、强阳、弱阴、来自阳之分 体积排阻柱：凝胶渗透色谱柱与凝胶过滤色谱柱
疏水作用柱
手性柱
宽径柱（3-21.2mm）-载样量高
柱的内径决定了流速：
流速F2=F1*(ID2/ID1)2
硅胶纯度
硅胶的硅醇基与离子型化合物之间可能进行二级反应
硅胶中的痕量金属会增加硅醇的酸性和峰的不对称性，有利于二级反应的发生，容易引起峰的拖尾。硅胶越纯，金属含量越低时，可以降低表面游离硅胶基的酸性，消除或减少可能发生的二级反应。
色谱峰,色谱柱及参数
死时间(dead time，t0)--不保留组分的保留时间。
即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。
在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
死体积(dead volume，V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。
它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。
其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。
为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。
V0＝F×t0（F为流速）梯度方法的建立：)1(N a 1-a 41Rs --+=k k ）（ )15.1/(∆Φ=-m G V F t kRs ：分离度，表示两峰分离程度的物理量。
k ：容量因子，表示某溶质在固定相和流动相中物质的量的比，在等度洗脱中。
一种物质的k 值是恒定不变的。
上面两试针对的是梯度洗脱，k 表示的平均容量因子。
a ：分离因子，两个溶质的容量因子的比。
通常k 大的作为分子。
表示两物质分离能力的大小。
N ：理论塔板数，表示柱子的分离能力，也就是柱效。
G t ：梯度时间；F ：流速；m V ：死体积；∆Φ：梯度变化范围。
常见问题和维护：整个液相系统最值得关注的常数：压力除体系受到污染之外，几乎所有柱前的问题都能在压力变化上表现出来。
压力来源：泵上的压力传感器最常见的问题：压力小（几乎为零）：说明没有流动相流过柱子。
可能原因：柱前漏夜流速设为0了流动相干了吸滤头没有放流动相液面之下流路中有大段气泡处理方法：漏液：从泵的出口到柱子的前端接口（柱后漏液几乎不会影响压力值）顺次检查。
泵上有自己的漏液传感器。
检测到漏液。
会停止工作并蜂鸣，变红。
同时显示错误信息：ERROR ：LEAK DETECTED 。
发现漏液点，先停泵，重新接好。
将漏液擦干。
有的漏液不明显，这时压力的也不会太小，检查时要注意，可用手仔细摸各个接口，感觉是否湿冷。
流路中有大段气泡：通过大流速（如5ml/min ）冲洗可以去除泵体内气泡。
色谱峰的三个主要参数
色谱峰的三个主要参数
色谱峰是在色谱分析中观察到的图形，它可以提供相应物质化学特性的信息。
在色谱分析中，色谱峰一般由三个主要参数来描述。
1. 保留时间（Retention Time）
保留时间是指色谱分离过程中，样品溶液中某一组分在色谱柱中停留的时间。
不同的化合物在不同的色谱柱和不同的流动相中具有不同的保留时间，因此保留时间可以用来区分和识别不同的化合物。
此外，还可以根据保留时间来计算分离效率等指标。
2. 峰面积（Peak Area）
峰面积是指色谱峰下的总面积，它直接反映了分析样品中某个组分的相对含量。
峰面积大小与样品中该物质的浓度成正比，因此可以根据峰面积来定量分析样品中该物质的浓度。
3. 峰高（Peak Height）
峰高是指色谱峰的最高点到基线的距离。
峰高大小可以表征样品中某一组分的浓度级别，但是由于流动相、柱和检测器等因素的不同，不同化合物的峰高也会有不同的大小。
总之，色谱峰的保留时间、峰高和峰面积等参数提供了对样品中不同组分进行分离、鉴定、定量等分析的依据。
在实际的色谱分析中，还需要综合考虑样品性质、仪器条件等因素，综合分析多个参数来得出准确的分析结果。
气相色谱基本理论知识
气相色谱基本理论知识气相色谱理论可分为热力学和动力学理论两方面。
热力学理论是从相平衡观点来研究分离过程，以塔片理论为代表。
动力学理论是从动力学观点来研究各种动力学因素对柱效的影响，以Van Deemter 方程式为代表。
在叙述这两个理论前先介绍有关基本概念。
一、基本概念l.色谱峰(流出峰) 由电信号强度对时间作图所绘制的曲线称为色谱流出曲线。
流出曲线(图2-2)上的突起部分称为色谱峰。
正常色谱峰为对称形正态分布曲线，曲线有最高点，以此点的横坐标为中心，曲线对称地向两侧快速、单调下降。
不正常色谱峰有两种：拖尾峰及前延峰。
前沿陡峭，后沿拖尾的不对称色谱峰称为拖尾峰(tailing peak)，前沿平缓，后沿陡峭的不对称色峰与不正常色谱峰可用对称因子f s(symmetryfactor)或叫拖尾因子来衡量(图20-3)。
对称因子在0.95～1.05之间为对称峰，小于0.95为前延峰，大于1.05为拖尾峰。
f s = W0.05h/2A = (A+B)/2A (2.1)一个组分的色谱峰可用三项参数即峰高或峰面积(用于定量)、峰位(用保留值表示、用于定性)及峰宽(用于衡量柱效)说明。
2.基线在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线称为基线。
稳定的基线应是一条平行于横轴的直线。
基线反映仪器(主要是检测器)的噪音随时间的变化。
3.保留值(滞留值) 是色谱定性参数。
(1)保留时间(t R)：从进样开始到某个组分的色谱峰顶点的时间间隔称为该组分的保留时间(retention time)，即从进样到柱后某组分出现浓度极大时的时间间隔。
图2-2中t R1及t R2分别为组分l及组分2的保留时间。
(2)死时间(t 0)：分配系数为零的组分的保留时间称为死时间(dead time)。
通常把空气或甲烷视为此种组分，用来测定死时间。
(3)调整保留时间(R t ')：某组分由于溶解(或被吸附)于固定相，比不溶解(或不被吸附)的组分在柱中多停留的时间称为调整保留时间(adjusted retention time)，又称为校正保留时间。
液相色谱柱基础知识
球形（Spherical）
– 目前流行的分析填料 – 更好的性能，重现性
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对色谱柱填料的了解(二)
键合相化学 –影响化合物的分离度：α –不同键合相对不同种类的化合物分离不同 –可能导致色谱的分离机理不同 –如：C18、C8、CN
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对色谱柱填料的了解(六)
硅胶的活性 –主要影响碱性化合物的保留行为：k' –生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同 –是选择性差异的主要来源 硅胶的杂质含量 –重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 –是色谱柱质量好坏的重要标志
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– 不锈钢（普通/可换柱芯） – 玻璃 – 聚合物（径向加压）、PEEK
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色谱柱的规格
内径
– 检测的灵敏度 – 样品的容量
长度
– 分离度，理论塔板数 – 速度 – 样品的容量 – 检测的灵敏度
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Waters色谱柱的内径
填料的热稳定性 –普通硅胶填料
柱温:≤60℃
–聚合物填料(高温GPC)
柱温:≤150℃
–杂化硅胶填料(XTerra)
柱温:≤90℃
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色谱填料的热稳定性
温度
pH
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填料基质物理性质的影响
填料基质的物理性质对色谱柱的影响
液相色谱填料的合成（2）
色谱柱技术
一柱子上的分配系数之比，分配系数越大，表示该溶质在柱子上的保留越强。由于α = κ A ，
B
κ
′ ′ VRA = κΑ VS ; VRB = κΒ VS ,所以α =
κΑ V′ RA
κΒ V′ RB
=
.分离因子与柱子的其它参数无关，仅取决于溶质在
两相中的分配系数及温度。 4.死体积 V0 通常认为，在柱中不保留的组分或是杂质的峰，他所需的的流动相的体积即能代表死体积， 一般可用硝酸钠、硝普钠、硫代硫酸钠和硅胶来测定死体积。一根运行中的色谱柱内部体积 由流动相体积、固定相体积和载体体积三部分组成，即VC = Vm + Vs + Vsi 。结果显示，在色 谱柱中，流动相占柱内总体积约 68%，在流动相体积中，粒间隙体积约占 2/3，孔内体积约 占 1/3；在间隙中真正流动的流动相占总间隙体积的 2/3 左右。因此柱中的流动相仅有 50% 是流动的，而余下的，孔内及粒子间隙中接近粒子接触点的流动相是静止的。由此就可见， 色谱柱中的流动相处于很复杂的状态，柱子的死体积很难简单的统一的加以处理。 5.色谱峰的对称性 一般假设色谱峰服从高斯分布，都应呈现对称的峰形。但实际却经常出现拖尾峰或是“伸舌 头峰” ，不对称峰的出现，意味着溶质普带在柱床中移动速度的不均匀。假设谱带移动速度 为 Z，则Z = t = V = V
m
VLeabharlann 为溶质的分配系数。则有k =
V′
ΚVs Vm
，由于 Vr′=KVs，Vm（流动相的体积）=V0（死体积）-Ve
（柱外体积） ，则有k = V r ；实际测量中，保留因子 k 是指某一溶质峰值至死体积之间的距
0
离除以死点至原点的距离，其前提条件是柱外体积必须足够小。 3.分离因子α 分离因子α用来描述两种不同溶质在柱子中的分离过程，故分离因子被定义为两种溶质在同
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常见问题和维护：
整个液相系统最值得关注的常数：压力
除体系受到污染之外，几乎所有柱前的问题都能在压力变化上表现出来。
压力来源：泵上的压力传感器
最常见的问题：
压力小（几乎为零）：说明没有流动相流过柱子。
可能原因：
柱前漏夜
流速设为0了
流动相干了
吸滤头没有放流动相液面之下
频繁出现的气泡会影响到流路的延续性，应该注意。吸滤头堵，管路脏（通常是水相）有可能带来频繁出现的气泡。可以先A，B的溶剂瓶调换一下。PURGE三五次。后换回来，再PURGE两次。清洗一下管路。
压力过大：说明流路堵了
逐段排查，先从柱（预柱）前接口（因为柱子最易堵某一段堵了（通常是柱子）。换柱子（或预柱）。
换针：
调针位：
调针位：
设定洗针体积：
一些小概念：
PEEK：聚醚醚酮
色谱管道，外径多为1/16inch，1inch=2.54cm，1/16in=2.54cm，内径大小以颜色标准，红色（我们用的）最小，为0.13mm（应该是国际统一标准）
PEEK接头手紧即可
不锈钢接头要用工具紧
接头分一体的和分为主体和压紧环两部分的。后者在拧紧的过程中，不易带动管道扭曲变形。
可能原因：泵体内有气泡，泵头单向阀坏。
先确认是哪一台泵有问题。先走100%A相。看是否压力还是波动大，还大则说明A泵有问题。压力正常则说明A泵正常。再走100%的B相，过程如上。
确认好泵之后，先purge一下，以驱赶气泡。Purge两次后，还是压力波动大，这有可能单向阀坏了，需要清洗或更换。
Ctc自动进样器的常用维护操作（实验室现场操作）：
也可能进样过程有问题，注意观察进样针活塞是否推到底。可能由于流通阀堵塞，造成压力大，进样针没法推到底。
重现性不好：
内标波动大，可能喷雾针脏了，使得喷雾不均匀。可能是液相方法没有开发好。峰型差，峰太宽都有可能造成面积不重复（不会差别太大）。
注意观察重现性不好的那几针，是否峰型比较特殊，保留时间也有较大变化，如果是，很有可能是由于pump里进了气泡，造成流速不稳，这点可以从压力变化得到确认，但是好像没法记录压力曲线。
梯度方法的建立：
Rs：分离度，表示两峰分离程度的物理量。
k：容量因子，表示某溶质在固定相和流动相中物质的量的比，在等度洗脱中。一种物质的k值是恒定不变的。上面两试针对的是梯度洗脱， 表示的平均容量因子。
a：分离因子，两个溶质的容量因子的比。通常k大的作为分子。表示两物质分离能力的大小。
N：理论塔板数，表示柱子的分离能力，也就是柱效。
= W
W=1.70
=0.7则W=0.7*1.70=1.19
差不多刚好实现单位质荷比的分离
线性范围：
信号强度与样品浓度的关系可用如下关系式表示：R=ARCX。R为信号强度大小，AR为响应因子。C为样品浓度，X为指数。X=1，表示在线性范围之内，考虑到实验误差等因素。一般只要X在0.98-1.92之间，就认为还在线性范围之内。线性范围是一个浓度范围，下限比较难测。通常就以最小检测量或最小检测浓度作为线性范围的下限。
不锈钢的压紧环是一次性的
单位换算：
1MPa=10bar=7500.6torr=14.5psi
Psi：pound per square inch (psi)
Torr：托里彻利，标准大气压的1/760。也就是mmHg（毫米汞柱）
其它问题：
残留大：
很可能是洗针过程有问题，注意观洗针时有没有抽上液体，抽上来的液体是否有很多气泡。出现过由于转子磨损，洗针液不能顺畅流出进样口。造成洗针不充分。清洗或更换转子。
流路中有大段气泡：
通过大流速（如5ml/min）冲洗可以去除泵体内气泡。也就是常说的PURGE。按下泵的面板上的purge键即可。每次PURGE的时间和流速可以在面板上设定。通常不改。初始值应该是5ml/min，3min。
但有时候泵体内空气太多，purge都不可以，或者很难抽上流动相，这是可以在purge的同时，用注射器，在泵的废液出口处抽。直到没有气泡。
死时间(dead time，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
死体积(dead volume，V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速）
质谱检测器的色谱图：chromatogram，强度和时间的图。等同于紫外检测的色谱图。
质谱检测器的光谱图：spectrum，某一时间点（段时间内平均）的强度相对质荷比的图
下图上半为一色谱图，下半部为图是灰色方块（2.5min左右）内，平均强度相对质荷比的光谱图。类似于紫外中的全波长图。
分辨率：unit分辨率定义为半峰宽为0.7。其意义如下：
流路中有大段气泡
处理方法：
漏液：从泵的出口到柱子的前端接口（柱后漏液几乎不会影响压力值）顺次检查。泵上有自己的漏液传感器。检测到漏液。会停止工作并蜂鸣，变红。同时显示错误信息：ERROR：LEAK DETECTED。发现漏液点，先停泵，重新接好。将漏液擦干。
有的漏液不明显，这时压力的也不会太小，检查时要注意，可用手仔细摸各个接口，感觉是否湿冷。
压力还高：说明是柱前某段堵了。
这时再将进样器出口（接柱子）的peek管接头拧下：
压力正常：说明是这段peek管堵了。换peek管。
压力还高：说明是进样器之前的部分堵了。通常是进样器六通阀堵了。反冲或清洗流通阀。
其它部分依次类推。
压力波动大：说明流路中的液流不平稳，这时色谱图通常保留时间不稳定，峰型也不好。得到的线性，重复性也不会好。
关于偶尔出现的气泡，不用太过在意，因为：
1.有脱气机在。
2.在purge时，由于流速太大，难免会出现气泡。尤其是在purge阀开超过180度，废液出口处出现气泡就跟平常了。
3.只要气泡不在泵腔内堆积，就几乎不会影响到分析结果。只要出了泵口，在高压下会
被压缩的很小。不影响流路的延续性。
所以，只要观察压力变化，如果压力没有异常波动，就行。在泵体内有气泡堆积时，压力波动会变大。什么样的波动算正常，需要大家注意观察。根究经验，在以恒定流速，梯度不变时，面板上以MP为单位的显示值应该几乎不变。