生物显微技术 第四章 免疫组化
免疫组化步骤总结
免疫组化步骤总结免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和定位特定分子在组织和细胞中的表达情况。
本文将对免疫组化的步骤进行总结，以帮助读者更好地了解和应用这一技术。
免疫组化步骤主要包括样本制备、抗原修复、阻断非特异性结合、一抗孵育、二抗孵育、信号放大、显色与染色、显微镜观察和结果分析等环节。
下面将对这些步骤进行详细介绍。
1. 样本制备：首先，需要选择合适的组织样本或细胞，可以通过切片、细胞培养等方法获得。
然后，将样本固定在载玻片上，常用的固定剂有福尔马林和乙醛等。
固定后，需要进行脱水和透明化处理，使样本适合于免疫组化的进一步步骤。
2. 抗原修复：有些抗原在固定和加工过程中可能会丧失免疫反应性，需要进行抗原修复。
常用的方法有热处理、酶解等，目的是使抗原恢复其免疫原性，提高抗体的特异性和敏感性。
3. 阻断非特异性结合：在进行免疫反应之前，需要阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。
可使用一些蛋白质，如牛血清蛋白、牛血清、小鼠血清等，进行预处理，将其涂覆在样本上，阻断不特异性结合位点。
4. 一抗孵育：将特异性抗体（一抗）与样本接触，孵育一定的时间，使抗体与靶分子发生特异性结合。
一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体，具体选择要根据实验需求和抗体的特异性来确定。
5. 二抗孵育：一抗与抗原结合后，需要加入与一抗来源物种不同的二抗。
二抗是与一抗来源物种的免疫球蛋白发生反应的抗体。
二抗可以标记有荧光物质、酶物质等，以便于后续的信号放大和显色。
二抗的选择要根据一抗的来源物种和实验需要来确定。
6. 信号放大：为了增强免疫反应的信号，可以使用一些信号放大的技术。
常用的信号放大方法有生物素-链霉亲和素系统(Biotin-Streptavidin System)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。
这些方法可以使目标物质的信号增强，提高实验的灵敏度和准确性。
7. 显色与染色：信号放大后，需要进行显色与染色步骤。
这一步骤可以根据实验需要选择适当的染色剂，如荧光染料、酶标记物等。
免疫组化操作方法
免疫组化操作方法免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测和定位细胞或组织中特定蛋白质的表达。
它结合了免疫学和生化学的原则和技术，可以提供对细胞或组织中不同蛋白质的分子特征、活动状态和相互作用的信息。
本文将详细介绍免疫组化的操作方法，包括材料和试剂的准备、标本的制备和固定、抗原检测和可视化等步骤。
材料和试剂的准备1.活体或固定的细胞或组织标本。
2.组织培养基和适当的培养器具。
3.PBS(磷酸缓冲盐溶液)或其他细胞/组织冲洗缓冲溶液。
4.组织切片刀、显微刀片、显微镊子、镊子等操作工具。
5.细胞/组织固定剂，如乙醛、甲醛、乙酸乙酯等。
6.可溶性和固相抗原检测试剂，如抗体、蛋白质等。
7.染色试剂，如荧光染料、酶底物等。
8.实验室耗材和设备。
标本的制备和固定1.如果使用活体标本，如细胞培养物，应先将其转移到无菌培养器皿中，并在适当的培养条件下培养至合适的生长期。
2.对于组织标本，可以通过切片或切块的方式进行制备。
切片时要求切片薄而均匀，一般为5-10μm。
切块时要求尽量保持组织完整性。
3.制备好的细胞或组织标本需要尽快进行固定，以保持其形态和蛋白质的天然状态。
常用的细胞/组织固定剂有乙醛、甲醛和乙酸乙酯。
不同的固定剂选用方法有一定差异，具体应根据实验要求和文献建议进行选择。
抗原检测和可视化1.固定后的标本需要进行脱水和透明化处理，以便于抗原检测的进行。
可以使用乙醇或队列进行脱水处理，然后用透明化溶剂进行透明化处理。
2.抗原检测需要使用抗体识别目标蛋白质。
对于免疫组织化学，常用的抗体类型包括一抗和二抗。
一抗为直接与目标抗原反应的抗体，二抗为与一抗结合并由可视化标记物进行信号产生的抗体。
一抗和二抗的选择应根据目标抗原和实验要求进行合理选择。
3.免疫染色前，可进行一些前处理步骤以增强染色效果，如抗体预处理、抗原修复、背景消除等。
4.免疫染色操作中，需要逐层进行抗体处理、洗涤和可视化标记物处理。
一般步骤包括：一抗与标本结合、一次洗涤、二抗与一抗结合、二次洗涤、可视化标记物与二抗结合、最终洗涤。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的存在和定位。
其步骤包括样本制备、抗原去原、阻断试验、一次抗体处理、二次抗体处理、显色和镜检。
下面将详细介绍每个步骤：1.样本制备：收集需要检测的样本，可以是细胞、组织或体液。
样本收集后，需要进行固定和切片处理，以保持细胞和组织结构的完整性。
2.抗原去原：蛋白质在组织中可能会被结构和其他因素影响，使其在免疫组化实验中难以被检测到。
因此，需要进行抗原去原处理。
常用的方法有热处理、酸碱处理、酶解处理等。
3.阻断试验：细胞和组织常常会存在非特异性结合位点，会使得后续的免疫反应变得模糊不清。
为了减少这种非特异性结合，需要进行阻断试验。
常用的阻断试验方法有牛血清白蛋白（BSA）、动物血清等。
4.一次抗体处理：在一次抗体处理步骤中，需要准备与目标蛋白质特异性结合的一次抗体。
将制备好的一次抗体加入样本中，使其与目标蛋白质发生反应，并形成抗原抗体复合物。
5.二次抗体处理：一次抗体只能与抗原结合，无法提供光学信号。
因此需要加入与一次抗体结合的二次抗体，该二次抗体与荧光物质或酶偶联，可以提供可视化信号。
常见的二次抗体有HRP（辣根过氧化物酶）、荧光染料等。
6.显色：通过加入合适的显色底物，可以使得与二次抗体结合的酶产生可见的颜色反应。
常用的显色底物有DAB（3,3'-二氨基联苯），其在酶的作用下会产生棕色的显色产物。
7.镜检：最后一步是使用光学显微镜对样本进行观察和分析。
通过镜检可以确定抗原存在的位置和分布情况，并对结果进行定量分析。
总结：免疫组化是一种确定蛋白质存在和分布的重要实验技术。
通过以上步骤的顺序操作，可以获得可靠的结果。
实验人员需要熟悉每个步骤的操作方法，并根据实验样本的要求进行调整和优化，以获得准确和可重复的结果。
免疫组化实验方法
免疫组化实验方法免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用特异性抗体与组织或细胞特定抗原结合的方法，以此可以检测细胞或组织中蛋白质的表达和分布情况。
IHC技术已广泛应用于病理学、癌症诊断、生物医学研究等领域。
以下是免疫组化实验的常用方法：1.样本处理：通常以石蜡包埋切片作为实验样本。
首先，从固定的组织或细胞中取得标本，然后进行脱水、透明化和浸蜡等处理。
接下来，使用切片机将组织或细胞切割成厚度为3-5μm的切片。
2.抗原恢复：由于样本的固定和包埋可能导致抗原的损伤，因此需要对切片进行抗原恢复处理。
常见的抗原恢复方法包括热处理、酶解法和酸性水解法。
热处理是将切片置于缓冲液中，在高温下进行退火。
酶解法是使用胰蛋白酶等酶对切片进行消化。
酸性水解法则使用盐酸或酶进行酸性处理。
3.抗体结合：选择特异性的一抗体与目标抗原结合。
一抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以经商业采购或自家制备。
将一抗体加入待检测切片上，让其与目标抗原结合。
4. 第二抗体结合：待检测切片上结合了一抗体的抗原后，需要添加第二抗体与一抗体结合。
第二抗体通常是反相应物免疫球蛋白（Secondary Antibody），如反人IgG，反兔IgG等。
第二抗体上常会标记有发光物质、酶标记物或荧光染料，用于可视化结果。
5.可视化和显色：根据选择的第二抗体，可以选择显色方法。
例如，辣根过氧化物酶（HRP）结合的第二抗体可以使用3,3'-二氨基联苯思（DAB）作为底物，呈棕色或棕黄色；荧光标记的第二抗体可以用荧光显微镜进行观察。
6.伪染色：为了辅助观察和识别目标组织或细胞，可以进行伪染色。
常见的伪染色方法有对比染色、核染色和细胞质染色等。
7.阴性对照和阳性对照：为了确保实验结果的准确性和可靠性，同时进行阴性对照和阳性对照实验。
阴性对照是在实验中将第一抗体替换为非特异性抗体或缺少抗体的处理组织或细胞组织；阳性对照是在实验中使用已知表达目标蛋白的组织或细胞进行处理。
免疫组化实验原理及其步骤
免疫组化实验原理及其步骤大家好，今天咱们聊聊免疫组化实验，这是一个听起来有点高大上的实验，但实际上，它可以用简单的话来解释清楚。
免疫组化实验，简单来说，就是通过抗原抗体反应来识别细胞或组织中的特定蛋白质。
听上去是不是有点神秘？别担心，我们一步步来解开这个谜团。
1. 什么是免疫组化实验免疫组化实验其实就是一种用来观察细胞或组织中特定蛋白质的技术。
想象一下，你在大海里找宝藏，免疫组化实验就像是你用来找宝藏的那把神奇的探测器。
它能帮助我们在复杂的组织中找到目标蛋白，就像在沙滩上找到了隐藏的珍珠一样。
这个过程可以分为几个关键步骤，每一步都至关重要。
2. 实验步骤2.1 准备工作首先，你得准备好样本。
无论是组织切片还是细胞涂片，都要处理得当。
就像是做菜前，你得把所有的食材都准备齐全一样。
样本处理得当，才能保证接下来的实验顺利进行。
2.2 固定和切片接下来是固定。
固定的目的是让样本中的蛋白质不变形，保持原有的状态。
这一步就像是给样本穿上保护衣，确保它们在实验过程中不会跑偏。
然后，将样本切成非常薄的片，这样才能方便后续的操作。
这就像是做蛋糕时，你要把蛋糕切成薄片，好让每一片都能均匀上色。
2.3 阻断非特异性结合在这一步，咱们需要阻断样本上那些可能干扰实验的东西。
这就好比你在派对上，得先处理好背景噪音，才能好好享受音乐。
这里用一些阻断液体，确保后续的抗体只会和目标蛋白结合，不会出现误会。
2.4 加入抗体这是整个实验的核心部分。
我们要用到的抗体，就像是侦探寻找线索。
首先加入一抗，这是一种能特异性识别目标蛋白的抗体。
然后加入二抗，这个二抗就像是给目标蛋白贴上了一个显眼的标签，能帮助我们看到它。
二抗一般会和一种显色剂结合，这样我们就能通过显微镜看到目标蛋白的存在了。
2.5 显色和观察最后，我们要显色。
显色的过程就像是把照片上的黑白图案变成彩色，让一切都变得清晰可见。
通过显微镜观察样本，看看那些我们感兴趣的蛋白质在哪里，就像在寻找隐藏的宝藏一样。
生物显微技术：有关于免疫细胞化学和免疫组织化学
• 切片必须保持切片刀锐利，切片要薄而平整、无皱摺、无刀 痕，如有上述问题的切片在进行免疫组化染色都将出现假阳 性现象，切片厚度一般为3~4μm，切好的切片在60℃温箱中 过夜，注意烤片的温度不宜过高，否则易使组织细胞结构破 坏，而产生抗原标记定位弥漫现象。
• （三）切片
• 组织得到很好处理后在进行切片之前还应对玻璃片 进行处理，由于我们检测抗原是多种多样的，因染 色操作程序复杂，时间较长，有些抗原要进行各种 抗原修复处理，如微波、高压、水溶酶等，玻片如 果得不到很好的处理，将易造成脱片，为保证免疫 组化实验的正常进行，要求在贴片前对载玻片作适 当处理，必须在清洗干净的玻片上进行粘合剂的处 理以防脱片。
第四章 免疫细胞化学和免疫组织化学
第一节 免疫组织化学概述
• 应用免疫学及组织化学原理，对细胞标本或 组织切片中的某些化学成分进行原位的定性、 定位或定量研究，这种技术称为免疫细胞化 学技术(immunocytochemistry)或免疫组织化 学技术(immunohistochemistry) 。
• 现实市场销售的一抗多为即用型，对抗体的滴度无 须摸索，但对于浓缩型一抗，则应摸索出最佳的工 作滴度。
• 灵敏度高而极易控制背景的检测系统试剂盒是最为 理想也是免疫组化染色优劣的关键，根据免疫组化 技术发展至今第三代SP试剂盒更优于其它试剂盒 (ABC、PAP等)。
• 但应注意检测系统应与一抗来源相匹配，否则检不 出目的物。
• 对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受 性来选择相应的固定液，但很难做到这一点，10%的 中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积 进行组织固定，但组织固定时间最好在l2h内，一般 固定时间不应超过24h。
免疫组化详细步骤
免疫组化步骤取组织、固定、制片(脱水、透明、浸蜡、包埋）、切片、烤片、抗原修复、滴加抗体一、取组织二、固定三、制片1、脱水透明的酒精梯度和时间70％酒精20min 80%酒精1h90%酒精1h 95％酒精Ⅰ2h95％酒精Ⅱ2h 无水乙醇Ⅰ15min无水乙醇Ⅱ15min 无水乙醇Ⅲ15min二甲苯酒精1：1 15min 二甲苯Ⅰ25min二甲苯Ⅱ25min 二甲苯Ⅲ15min2、浸蜡:石蜡融化后，在石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各浸蜡1h3、包埋四、切片烤片用切片机切片，取完整组织切片放于37℃温水中展片，取完整组织于载玻片上，并放入到60℃的烤箱中烤6个小时五、脱蜡至水六、抗原修复配置柠檬酸抗原修复液于微波中煮沸，在高压锅内放入自来水煮沸(不盖锅盖），将装有煮沸的抗原修复液的烧杯置于高压锅内，将水化后的玻片放入煮沸的抗原修复液中，盖上锅盖，待其压力达到最大时维持三分钟七、取出玻片，水浴逐渐降温直至完全冷却八、将玻片放置于塑料板上，滴加3％的过氧化氢室温孵育10min，以阻断内源性过氧化氢酶，10min过后PBS冲洗2次×3分钟九、除去PBS（甩干或者吸水纸吸干），每张切片滴加第一抗体（稀释相应倍数），4℃过夜十、PBS冲洗3次×2分钟，除去PBS液,每张切片滴加聚合物增强剂，室温孵育10min十一、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加酶标抗兔聚合物，室温孵育10min十二、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加新配制的DAB（二氨基联苯胺)，室温孵育2～10分钟，显微镜观察十三、苏木精复染:苏木精复染5min，水洗3min，0。
1%HCl浸提两次,水洗3min，反蓝液数秒，水洗十四、脱水透明：70％酒精3min、80％酒精3min、90％酒精3min、无水乙醇3min、二甲苯Ⅰ3min、二甲苯Ⅱ3min十五、封片。
免疫组化
抗原修复
热处理后应注意自然冷却（至少半小时）； 热处理液不要让其煮干； 不要任何抗原的检测都使用该方法； 同一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。
实验步骤
二甲苯 梯度酒 精
石蜡切片
脱蜡、水化
ddH2O或PBS洗 抗原修复
冰冻切片
37度烤片
预 处 理
3%H2O2孵育原修复
抗原修复(Antigen Retrieval，AR)是以高温、高压对常规 固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消 化，以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。
修复介质： ①0.01M pH6.0柠檬酸盐缓冲液(CB)；②
EDTA pH9.0。
修复方式：①微波96℃±10min×2；②直接加温100℃， 15min；③水浴锅100℃，10/20min；④高压锅/消毒锅 120℃，3min；⑤真空加热10min；⑥直接烤片法。
孵育一抗 即 用 型 二 步 法 孵二抗试剂1 37度20分钟 孵二抗试剂2 37度30分钟 梯度酒精 二甲苯 DAB显色 复染 脱水、透明 封片 血清封闭（试剂A）室温2 h 孵一抗 孵生物素偶联二抗 （试剂B）室温2 h 孵ABC液（试剂C） 37度40分钟 ABC
放 大 法
去除内源性过氧化物酶
色结果是不可信的。
抗原表达必须在特定部位。如人白细胞共同抗原
LCA和上皮膜抗原EMA应定位在细胞膜上；肌酸激
酶 CK应定位在细胞浆内；PCNA 及p53 蛋白应定位
在细胞核内，等等。不在抗原所在部位的阳性着色， 一概不能视为阳性。
尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞
的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这类阳性
免疫组化法
免疫组化法免疫组化法是一种利用特异性抗体与细胞内实体形成特异性结合来研究细胞上特定分子的分布方法。
这种技术比其他技术更具灵敏度、准确度和可靠性。
它可用于研究细胞内分子的表达和组织，广泛应用于生物学、医学等多个科学领域。
本文旨在对免疫组化法的基本原理、操作步骤、应用范围以及可能存在的问题进行系统的介绍。
1.疫组化法的基本原理免疫组化法是利用特异性抗体与细胞内实体形成特异性结合来研究细胞上特定分子的分布。
它的基本原理是，抗体首先结合细胞内的抗原，而后这种特异性结合将被放大以便显微镜下观察。
抗体可以是免疫动物免疫产生的单克隆特异性抗体，也可以是合成的多克隆抗体。
一旦抗体与目标抗原结合，它们便可以被以多种方式检测出来，可以在细胞或组织中就地检测，也可以把细胞拆散后重新检测。
2.疫组化法的操作步骤免疫组化法首先要确定目标抗原，然后根据抗原特性选择抗体。
接下来，将抗体和细胞或组织结合起来，通常需要表面活化物，如胶原、硅胶等材料。
接下来可以引入环境因子，如氧化剂、衰老因子等，调控动物细胞的生长和代谢。
随后可以根据需要采用细胞固定、免疫丝切片技术等方法来分析细胞结构和分子的分布。
最后，可以采用活性染色法、免疫荧光技术、共沉淀反应等技术来定量检测抗原的表达和结构分布。
3.疫组化法的应用范围免疫组化法可以用来定量衡量细胞内有毒物质的积累和分布，可检测细胞内蛋白质、脂质、DNA等物质，也可以用来比较不同细胞或不同组织、不同器官之间的分子表达量和组织分布，以及细胞成分的变化情况。
它可以用来研究物质的重组、修饰及转移方向，也可用来研究突变基因在细胞或组织上的表达情况，以及对不同病症的发病机制等。
4.能存在的问题免疫组化法具有良好的特异性和灵敏性，能够检测细胞和组织中的分子表达及结构分布，但不同抗体之间存在特异性差异，可能存在抗体偏聚、抗原取代等问题，需要进行抗体验证才能确保试验结果的可靠性。
此外，固定细胞的方法也是一个可能的问题，一般来说，固定的细胞很难保留原始的细胞结构和分子分布，或者可能存在过度固定的情况，可能会影响结果可靠性。
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理和步骤实验原理：抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。
先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。
由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。
实验步骤：（一）脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1、组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟。
2、无水乙醇中浸泡五分钟。
3、95%乙醇中浸泡五分钟。
4、75%乙醇中浸泡五分钟。
（二）抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：1、抗原热修复（1）高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m柠檬酸钠缓冲溶液（ph6.0）。
盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。
此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（2）沸热修复电炉或水浴锅加热0.01柠檬酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
（3）微波炉加热在微波炉里加热0.01柠檬酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。
适用的抗原Bcl-2、ax、AR、PR、C-fos、x-jum、z-kit、c-myc、E-cadherin。
ChromograninA、Cyclin、ER、Heatshock、Protein、HPV、Ki-67、MDMZ、P53、P34、P15、P-glycoprotein、PKC、PCNA、ras、Rb等2、酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)是一种利用抗体与组织中的抗原特异性结合的技术。
它是一种重要的研究方法，可以用于检测和定位组织中的特定蛋白质和其他生化分子。
以下是免疫组织化学实验的一般操作步骤：1.样本处理：a.固定：将待检测的组织样本进行固定处理，以保持其形态结构并保留组织内的抗原。
b.切片：将固定的组织样本切成非常薄的切片（通常为3-5微米厚），并将其放置在载玻片上。
2.抗原解蓝（抗原恢复）：a.对于不同类型的组织样本，选择适当的抗原解蓝方法。
b.抗原解蓝可以通过加热、酶解或其他方法来恢复组织样本中的抗原。
3.阻断非特异性结合：a. 使用一种非特异性的蛋白质来阻断载玻片上未特异性结合的位点，例如牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)或小鼠免疫球蛋白(Mouse IgG)。
b.加入适当浓度的阻断剂，并孵育片玻片上的切片，以阻断非特异性结合位点。
4.主抗体孵育：a.加入含有特定抗原的主抗体溶液，其可以与组织样本中特定的抗原结合。
b.孵育片玻片上的切片，使主抗体与待检测的抗原结合。
5.洗涤：a.用缓冲液或PBS等洗涤溶液洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的主抗体。
6.二抗孵育：b.孵育片玻片上的切片，使辅助抗体与主抗体结合。
7.洗涤：a.再次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的辅助抗体。
8.信号放大：a.可根据需要，使用染色剂或底物来增强或显色识别待检测抗原的结合位置。
b.例如，使用荧光染料或酶底物，通过显微镜观察或光镜观察，可使抗原可视化。
9.洗涤：a.最后一次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的染色剂或底物。
10.封片：a.加入适当的封片剂，如富含丙酮的溶液，将载玻片上的切片封装起来，以保护切片和保存染色结果。
免疫组织化学是一种复杂的实验技术，需要仔细的操作和精确的控制条件才能得到准确的结果。
免疫组化原理和步骤(精)
免疫组化原理及步骤免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜 (包括荧光显微镜、电子显微镜的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质 (如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等。
二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 :9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至 1000 ml;1000 ml 0.2M PB (pH 7.4=5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O+58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或=190 ml A + 810 ml B(A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O:15.6 g in 500 ml ddH 2 O; B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O:71.632 g in1000 ml dH 2 O。
2. Citrate Buffered Saline(0.01 M 柠檬酸缓冲液, PH6.0:28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O(A.Citrate acid (柠檬酸 :10.5 g 加双蒸水至 1000 ml ; B.Citrate sodium(柠檬酸钠:29.41 g 加双蒸水至 1000 ml。
3. 细胞通透液:由终浓度分别为 0.3%双氧水和 0.3%Triton X-100 混合而成。
配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS, 再接着加 120 ul TritonX-100,并加热一儿,冷却至临用前加 0.4 ml30%H 2 O 2 。
免疫组化过程及原理
免疫组化过程及原理免疫组化，是一种通过特异性抗体和荧光素等探针对组织切片中的分子进行定位和鉴定的技术。
这种技术广泛应用于生物医学研究和医学诊断中。
本文将介绍免疫组化的过程和原理。
一、样品制备样品制备是免疫组化技术的第一步。
样品主要包括组织切片、胞液、细胞培养物等。
制备样本主要方法有固定、切片、脱水等步骤。
在进行免疫组化之前，必须使用固定剂对样本进行固定。
固定剂的选择应根据不同的样品以及需要检测的分子性质而定。
通常，使用含有甲醛或戊二醛的固定剂。
二、抗体选择和标记选择适当的抗体和相应的探针是免疫组化技术的关键。
抗体是能特异性与靶分子结合的蛋白质，可通过季节性生产、杂交瘤融合技术等方法制备。
标记技术有荧光标记、酶标记、金粒子标记等。
取决于使用的抗体和探针类型，所使用的技术将会是不同的。
三、特异性识别将标记好的抗体溶液滴到固定后的组织切片表面，然后进行特异性识别，即特异性抗体与分子特异性结合的过程。
在该步骤中，选定的抗体只与需要检测的分子特异性的表达区域结合。
四、荧光检测使用荧光显微镜检测标记分子特异性抗体对组织切片上分子特异性结合的情况。
在免疫组化的过程中，荧光探针的特异性荧光信号为明显的标记。
荧光显微镜能够捕捉到这些信号，并将它们转化成清晰可见的图像。
通过荧光检测可以确定细胞表达、蛋白质定位、蛋白质互作等。
五、数据记录和结果分析将荧光显微镜的图像记录下来，并通过图像分析软件进行数据处理和结果分析。
对比对照组、干预组与实验组数据，确定显著的差异。
进行加权平均、标准差、方差等数学方法，基于统计学得出可靠的结论。
六、检测标准化免疫组化技术在不同实验室或者不同操作者之间具有高度可变性。
为了在不同的实验室、不同的操作者不同的样品下得出相同的结果，需要标准化免疫组化的流程。
标准化流程包括选择合适的抗体、标准化抗体稀释度、制剂及品质检测，检测标准的制定等。
标准化流程的制定保证了实验之间的准确性和可重复性，提高了免疫组化技术的可靠性。
免疫组化实验原理及其步骤
免疫组化实验原理及其步骤免疫组化实验原理及其步骤，听起来好像很高大上，让人有点儿望而生畏。
但是别担心，我来给你讲讲，保证让你轻松理解！我们来说说什么是免疫组化。
免疫组化是一种检测蛋白质的方法，它通过将特定的抗体加上到细胞样本上，然后再用一种叫做“荧光素”的物质来标记这些抗体。
这样一来，只要有我们需要检测的蛋白质存在，它们就会被荧光素染成绿色或者红色。
那么，免疫组化实验的步骤又是怎样的呢？其实也很简单，可以分为以下几个部分：第一步，准备样品。
这个步骤很重要哦！我们需要确保我们的样品是干净的、新鲜的，并且没有受到任何污染。
如果有必要的话，我们还可以对样品进行一些处理，比如染色或者浓缩等等。
第二步，选择合适的抗体。
这个步骤就像是我们在超市里面购物一样，需要根据我们需要检测的蛋白质类型来选择合适的抗体。
不同的抗体有不同的特异性和灵敏度，所以我们需要根据实际情况来进行选择。
第三步，进行免疫组化反应。
这个步骤就像是我们在做一道美食一样，需要将我们选择好的抗体加上到样品上，并且等待一段时间让它们相互结合。
在这个过程中，我们还需要加入一些辅助剂来帮助我们完成反应。
第四步，检测结果。
这个步骤就像是我们在看一部电影一样，需要观察荧光素的颜色来判断是否有我们需要检测的蛋白质存在。
如果有的话，我们就可以根据颜色深浅来判断它们的含量和分布情况。
第五步，分析结果。
这个步骤就像是我们在做一道数学题一样，需要对检测结果进行分析和解释。
我们可以根据荧光素的颜色和数量来推断出蛋白质的存在和分布情况，并且得出相应的结论。
免疫组化实验虽然看起来比较复杂，但是只要掌握了其中的原理和步骤，就能够轻松地完成实验并得到准确的结果。
希望大家都能够在学习免疫组化的过程中取得好成绩哦！。
免疫组化操作步骤及原理
免疫组化操作步骤及原理嘿，咱今儿就来唠唠免疫组化这档子事儿！免疫组化啊，就像是一场神奇的探秘之旅。
先来说说操作步骤吧。
就好比要做一道特别的菜，得先精心准备食材一样。
第一步呢，得把要研究的组织标本准备好，这就像是挑选出最好的食材。
然后呢，要给这些标本进行固定，让它们乖乖地保持住形态，就跟给食材定个型似的。
接下来，就是切片啦，把组织切成薄薄的一片片，这就好像把食材切成合适的大小和形状。
切好片后，就得进行抗原修复啦，这就像是给食材来个特别的处理，让它能更好地展现出自己的特点。
再然后就是孵育一抗，这一抗就像是专门去找目标的小侦探，能准确地找到我们想要研究的那个东西。
孵育完一抗，还得洗一洗，把多余的去掉，就跟洗菜一样。
接着孵育二抗，这二抗就像是小侦探的助手，能让我们更清楚地看到小侦探找到的目标。
最后呢，进行显色，哇哦，这一步就像是魔法一样，让我们能清楚地看到结果啦！再说说原理吧。
免疫组化就像是一场精准的追踪游戏。
我们身体里的各种蛋白质啊，就像是隐藏在大森林里的各种小动物。
而抗体呢，就是专门去寻找这些小动物的猎人。
一抗就是那个最厉害的猎人，能准确地找到目标。
二抗呢，就是帮助一抗更好地发挥作用的伙伴。
通过这样的配合，我们就能在显微镜下清楚地看到我们想要研究的那些蛋白质啦，是不是很神奇呢？你想想啊，要是没有免疫组化，我们怎么能知道身体里这些小小的蛋白质在搞什么名堂呢？它就像是一把钥匙，能打开我们了解身体奥秘的大门。
比如说，医生要判断一个肿瘤是良性还是恶性，免疫组化就能帮上大忙啦！它能告诉医生这个肿瘤里都有哪些蛋白质，从而帮助医生做出更准确的诊断。
这可太重要了，关系到病人的治疗方案和未来呢！免疫组化还能帮助科学家们研究各种疾病的发生机制，就像是在黑暗中点亮一盏明灯，让我们能看清疾病的真面目。
这可不是一般的厉害呀！总之呢，免疫组化是个非常重要的技术，它让我们对身体的了解更加深入，也为医学和科学的发展做出了巨大的贡献。
免疫组化实验步骤及原理
免疫组化实验步骤及原理嘿，咱今儿就来聊聊免疫组化这档子事儿！免疫组化啊，就像是一场微观世界里的奇妙探险。
先来说说这第一步，那就是标本的准备啦。
这就好比要去远行，得先把行李收拾好呀。
标本得处理得妥妥当当，不然怎么能开启这场精彩之旅呢。
接着呢，就是切片啦。
这切片就像是给微观世界开了一扇小窗，让我们能更清楚地看到里面的奥秘。
要切得薄厚均匀，可不能马虎哟。
然后，就是抗原修复啦。
这一步可重要啦，就好像给沉睡的宝藏解开封印。
让那些隐藏起来的抗原能重新现身，乖乖地让我们去发现它们。
再接下来，就是封闭啦。
这就像是给我们的微观世界拉起一道防护帘，把那些不相干的干扰都挡在外面。
然后就是一抗孵育啦。
这一抗就像是一把神奇的钥匙，专门去寻找那些它对应的抗原。
嘿，你说这是不是很奇妙呀。
等一抗孵育好了，就得洗去多余的一抗啦，这就好比把用过的工具清理干净，好迎接下一步呀。
接下来就是二抗孵育啦。
二抗就像是一抗的小跟班，跟着一抗一起去探索，一起去发现。
然后又是一轮清洗，把那些不需要的都洗掉。
最后就是显色啦！哇哦，这就像是微观世界里绽放出了绚丽的色彩，让我们能清楚地看到那些抗原的位置。
这免疫组化的原理呢，其实也不难理解。
就好像是在一个大宝藏里，我们通过特定的钥匙去找到我们想要的宝贝。
抗体就是那把钥匙，抗原就是宝贝。
我们用抗体去找到抗原，然后让它们显现出来，这样我们就能知道它们在哪里啦。
你想想看，通过这么一系列的操作，我们就能在微观世界里发现那么多神奇的东西，这多有意思呀！免疫组化就像是给我们打开了一扇通往微观奥秘的大门，让我们能更深入地了解生命的奥秘。
所以啊，可别小看了这免疫组化实验，它可是有着大用处呢！总之呢，免疫组化实验就是这么一个神奇又有趣的过程，需要我们一步一步地细心操作，才能发现那些隐藏在微观世界里的秘密呀！。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理大家好，今天咱们聊聊免疫组化这门技术。
它可是生物医学研究中的一把好手，能让细胞和组织的秘密无所遁形。
咱们先从免疫组化是什么说起。
首先得明白，免疫组化是一种研究方法，它通过给样品加上抗体，让它们跟细胞里的蛋白质或分子“亲密接触”，然后通过染色来观察这些蛋白质或分子的位置和分布。
听起来是不是挺高大上的？不过别急，咱们慢慢来，一步步揭开它的神秘面纱。
1.1 准备工作开始之前，你得确保所有材料都是新鲜的、高质量的，还有那试剂啊，得是实验室里常用的那种。
别忘了准备一个显微镜，这可是观察的关键哦！1.2 固定和包埋接下来就是让细胞和组织固定在一块，这个步骤叫做固定。
把样本放到甲醛溶液或者丙酮里面一泡，就能把它们牢牢地锁住，防止它们移动。
之后呢，把固定好的样本放进树脂里，这样它们就能稳稳当当的了。
这一步是为了保护细胞和组织的结构不被破坏，方便后续的切片和染色工作。
1.3 切片把处理好的样本切成薄片，这就是切片。
切片的时候得小心，别让样本碎掉或者变形。
切片后，还得把那些乱七八糟的东西去掉，比如蜡质啊、气泡啊，这样才能让下面的染色工作顺利进行。
1.4 染色染色可是个技术活。
你得选对染料，颜色要鲜艳，还要能穿透细胞膜，把里面的物质找出来。
染色的方法有很多种，比如直接法、间接法和免疫荧光法等等。
每种方法都有它的特点，就像不同的人有不同的爱好一样。
1.5 观察染色完成后，就可以用显微镜来观察啦！看看细胞和组织里的蛋白质、分子是怎么分布的。
有时候，你还能发现一些有趣的现象，比如某些细胞里藏着很多糖，还有些地方有抗体的“家”。
这些观察结果可是非常宝贵的，能帮助我们更好地理解生物体内的奥秘。
2.1 注意事项做免疫组化实验的时候，可不能马虎哦。
记得要戴好防护眼镜和手套，避免接触到有毒有害物质。
操作时要轻柔，不要破坏样本的结构。
还有啊，处理完样本后得洗手，保持实验室的清洁和卫生。
2.2 常见问题及解决方案有时候会遇到一些问题，比如样本太干或者太湿，这时候可以试试加一点水或者甘油来调整。
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免疫组织化学
免疫细胞化学又称免疫组织化学、其主要原 理是用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织 内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或 定量检测，经过组织化学的呈色反应之后， 用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。
免疫细化学的基本理论
抗原抗体反应 标记化学反应 显色化学反应
免疫酶细胞化学
预先将抗体与酶连结，再使其与组织内特异 抗原反应，经细胞化学染色后，于光镜或电 子显微镜下观察分析的形态学研究方法。
酶的种类
辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase , HRP）
碱性磷酸酶（Alkaline phasphotase, ALP） 葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOD）
桥抗生物素—生物素技术（Bridged Avidin –Biotin technique, 简称BRAB技术）
一抗：生物素标记的特异性抗体 二抗：卵白素 三抗：生物素标记的酶
操作步骤
固定： 生物素标记的第一抗体，室温孵育15min。 PBS洗5min，更换3次。 第二抗体卵白素，孵育15min。 PBS洗5min，更换3次。 生物素标记的酶孵育作用15min 。 PBS洗 5min，更换3次。 显色。 复染封片、观察。
阴性对照
没有信号出现的检测结果。当待检标本呈阳性结果 时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。 用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果； 用没有交叉反应的抗体代替特异性抗体进行实验。 用特异性抗体的抗血清与特异性抗体与切片共同孵 育；
免疫细胞化学结果的判断
判断特异性染色和非特异性染色。 要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴 性结果，必须严格对照实验。 重复
抗体制备
酶标抗体 酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体 上，制成酶标抗体。再借酶对底物的特异 化作用显色。 非标记抗体酶法
酶桥法
抗过氧化物酶法（ PAP ）
PAP法的评价
抗体活性高 灵敏度高：灵敏度是指ICC方法所能发现最 少数量抗原而言。 背景染色低：
亲和免疫细胞化学技术
基本原理 生物素 （Riotin）：是一种小分子的维生素 卵白素（Avidin）：又名亲合素，鸡蛋白中一种碱 性蛋白。 生物素与卵白素之间有很强的亲合力，较之抗体对 抗原的亲合力要高出100万倍，能够彼此牢固结合而 不影响彼此的生物学活性。 生物素与卵白素都具有与其它示踪物质如荧光素、 铁蛋白和过氧化酶等相结合的能力。
免疫组织化学特点
1.高度特异性 2.敏感性高 3．方法步骤统一 4．形态、机能和代谢密切结合
基本技术方法
抗体的制备 组织材料的处理 免疫染色 对照试验 显微镜观察
免疫组织化学分类
根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为: 免疫荧光细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术 亲和免疫细胞化学技术 免疫电子显微镜技术
设计对照实验
设计对照实验目的： 证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异 性疑问。主要是针对第一抗体对照。 ①阳性对照； ②阴性对照；
阳性对照
用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行 免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果， 称为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤 其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为 重要。
标记生物素—抗生物素技术（Labelled Avidin—Biotin technique, LAB技术）
一抗：生物素标记的特异性抗体 二抗：酶标记抗生物素
切片在含有25～50μ g/ml生物素标记抗体 （PBS液稀释）中孵育1h，室温。 PBS洗2次，每次5min。 用20～50μ g/ml过氧化物酶标记的抗生物素 液孵育90min，水洗。 酶呈色反应。
酶的要求
1. 2. 3. 4. 5. 6.
酶催化的底物必须是特异、容易观察； 定位效果好； 易获得，最好有商品出售； 酶的催化活性（Turnover）高并且稳定； 酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者的活性； 背景低：被检测组织中，不应存在与标记酶相同的 内源性酶或类似物质。
基本步骤
组织及切片制备 抗体的制备 切片封闭：血清等 与抗体孵育 加入显色底物显色 复染 观察
抗原抗体反应
抗体是免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。 人类免疫球蛋白有五类，即IgG 、IgA、 IgM、 IgD 及IgE。 人体内的五类 Ig之间的区别就在于其各自重 链的氨基酸组成和抗原性不同。用小写希腊 字γ（Gamma）、α(Alpha)、μ(Mu)、 δ(Delta)、ε(Epsilon),分别表示IgG 、IgA、 IgM、IgD 与IgE的两条重链。
抗生物素—生物素染色法
1．抗生物素—生物素—过氧化酶复合物技术 （Avidin Biotin –Peroxidase Complex technique, 简称ABC技术） 2．桥抗生物素—生物素技术（Bridged Avidin –Biotin technique, 简称BRAB技术） 3．标记生物素—抗生物素技术（Labelled Avidin—Biotin technique, LAB技术）
免疫组化检测action蛋白在大鼠卵巢组织中的表达。 请选择抗体组合，设计实验。
人抗大鼠action（同种型IgG ） 大鼠抗人action （同种型IgG ） 兔抗大鼠action （同种型IgG ） 生物素标记的兔抗人IgG 生物素标记的兔抗人IgM 生物素标记的人抗兔IgG 生物素标记的人抗兔IgM 碱性磷酸酶标记的卵白素 碱性磷酸酶标记山羊抗人IgG 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG
物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础 。
抗原与抗体
植物凝集素和糖类
生物素与抗生物素 葡萄球菌A蛋白与IgG 阳离子与阴离子 激素和受体等
亲和免疫细胞化学技术特点
亲合细胞化学引入免疫细胞化学后使其敏感 性得到进一步提高，因此更有利于微量抗原 （或抗体 ）在细胞或亚细胞水平的定位。
抗生物素—生物素免疫细胞化学染色法