生物显微技术 第四章 免疫组化
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免疫组织化学 Immunocytochemistry ICC
免疫组织化学
免疫细胞化学又称免疫组织化学、其主要原 理是用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织 内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或 定量检测，经过组织化学的呈色反应之后， 用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。
免疫细化学的基本理论
抗原抗体反应 标记化学反应 显色化学反应
桥抗生物素—生物素技术（Bridged Avidin –Biotin technique, 简称BRAB技术）
一抗：生物素标记的特异性抗体 二抗：卵白素 三抗：生物素标记的酶
操作步骤
固定： 生物素标记的第一抗体，室温孵育15min。 PBS洗5min，更换3次。 第二抗体卵白素，孵育15min。 PBS洗5min，更换3次。 生物素标记的酶孵育作用15min 。 PBS洗 5min，更换3次。 显色。 复染封片、观察。
wk.baidu.com 设计对照实验
设计对照实验目的： 证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异 性疑问。主要是针对第一抗体对照。 ①阳性对照； ②阴性对照；
阳性对照
用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行 免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果， 称为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤 其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为 重要。
阴性对照
没有信号出现的检测结果。当待检标本呈阳性结果 时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。 用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果； 用没有交叉反应的抗体代替特异性抗体进行实验。 用特异性抗体的抗血清与特异性抗体与切片共同孵 育；
免疫细胞化学结果的判断
判断特异性染色和非特异性染色。 要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴 性结果，必须严格对照实验。 重复
物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础 。
抗原与抗体
植物凝集素和糖类
生物素与抗生物素 葡萄球菌A蛋白与IgG 阳离子与阴离子 激素和受体等
亲和免疫细胞化学技术特点
亲合细胞化学引入免疫细胞化学后使其敏感 性得到进一步提高，因此更有利于微量抗原 （或抗体 ）在细胞或亚细胞水平的定位。
抗生物素—生物素免疫细胞化学染色法
基本原理 生物素 （Riotin）：是一种小分子的维生素 卵白素（Avidin）：又名亲合素，鸡蛋白中一种碱 性蛋白。 生物素与卵白素之间有很强的亲合力，较之抗体对 抗原的亲合力要高出100万倍，能够彼此牢固结合而 不影响彼此的生物学活性。 生物素与卵白素都具有与其它示踪物质如荧光素、 铁蛋白和过氧化酶等相结合的能力。
标记生物素—抗生物素技术（Labelled Avidin—Biotin technique, LAB技术）
一抗：生物素标记的特异性抗体 二抗：酶标记抗生物素
切片在含有25～50μ g/ml生物素标记抗体 （PBS液稀释）中孵育1h，室温。 PBS洗2次，每次5min。 用20～50μ g/ml过氧化物酶标记的抗生物素 液孵育90min，水洗。 酶呈色反应。
免疫组化检测action蛋白在大鼠卵巢组织中的表达。 请选择抗体组合，设计实验。
人抗大鼠action（同种型IgG ） 大鼠抗人action （同种型IgG ） 兔抗大鼠action （同种型IgG ） 生物素标记的兔抗人IgG 生物素标记的兔抗人IgM 生物素标记的人抗兔IgG 生物素标记的人抗兔IgM 碱性磷酸酶标记的卵白素 碱性磷酸酶标记山羊抗人IgG 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG
抗生物素—生物素染色法
1．抗生物素—生物素—过氧化酶复合物技术 （Avidin Biotin –Peroxidase Complex technique, 简称ABC技术） 2．桥抗生物素—生物素技术（Bridged Avidin –Biotin technique, 简称BRAB技术） 3．标记生物素—抗生物素技术（Labelled Avidin—Biotin technique, LAB技术）
抗原抗体反应
抗体是免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。 人类免疫球蛋白有五类，即IgG 、IgA、 IgM、 IgD 及IgE。 人体内的五类 Ig之间的区别就在于其各自重 链的氨基酸组成和抗原性不同。用小写希腊 字γ（Gamma）、α(Alpha)、μ(Mu)、 δ(Delta)、ε(Epsilon),分别表示IgG 、IgA、 IgM、IgD 与IgE的两条重链。
酶的要求
1. 2. 3. 4. 5. 6.
酶催化的底物必须是特异、容易观察； 定位效果好； 易获得，最好有商品出售； 酶的催化活性（Turnover）高并且稳定； 酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者的活性； 背景低：被检测组织中，不应存在与标记酶相同的 内源性酶或类似物质。
基本步骤
组织及切片制备 抗体的制备 切片封闭：血清等 与抗体孵育 加入显色底物显色 复染 观察
免疫酶细胞化学
预先将抗体与酶连结，再使其与组织内特异 抗原反应，经细胞化学染色后，于光镜或电 子显微镜下观察分析的形态学研究方法。
酶的种类
辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase , HRP）
碱性磷酸酶（Alkaline phasphotase, ALP） 葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOD）
免疫组织化学特点
1.高度特异性 2.敏感性高 3．方法步骤统一 4．形态、机能和代谢密切结合
基本技术方法
抗体的制备 组织材料的处理 免疫染色 对照试验 显微镜观察
免疫组织化学分类
根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为: 免疫荧光细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术 亲和免疫细胞化学技术 免疫电子显微镜技术
抗体制备
酶标抗体 酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体 上，制成酶标抗体。再借酶对底物的特异催 化作用显色。 非标记抗体酶法
酶桥法
抗过氧化物酶法（ PAP ）
PAP法的评价
抗体活性高 灵敏度高：灵敏度是指ICC方法所能发现最 少数量抗原而言。 背景染色低：
亲和免疫细胞化学技术
免疫组织化学
免疫细胞化学又称免疫组织化学、其主要原 理是用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织 内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或 定量检测，经过组织化学的呈色反应之后， 用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。
免疫细化学的基本理论
抗原抗体反应 标记化学反应 显色化学反应
桥抗生物素—生物素技术（Bridged Avidin –Biotin technique, 简称BRAB技术）
一抗：生物素标记的特异性抗体 二抗：卵白素 三抗：生物素标记的酶
操作步骤
固定： 生物素标记的第一抗体，室温孵育15min。 PBS洗5min，更换3次。 第二抗体卵白素，孵育15min。 PBS洗5min，更换3次。 生物素标记的酶孵育作用15min 。 PBS洗 5min，更换3次。 显色。 复染封片、观察。
wk.baidu.com 设计对照实验
设计对照实验目的： 证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异 性疑问。主要是针对第一抗体对照。 ①阳性对照； ②阴性对照；
阳性对照
用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行 免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果， 称为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤 其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为 重要。
阴性对照
没有信号出现的检测结果。当待检标本呈阳性结果 时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。 用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果； 用没有交叉反应的抗体代替特异性抗体进行实验。 用特异性抗体的抗血清与特异性抗体与切片共同孵 育；
免疫细胞化学结果的判断
判断特异性染色和非特异性染色。 要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴 性结果，必须严格对照实验。 重复
物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础 。
抗原与抗体
植物凝集素和糖类
生物素与抗生物素 葡萄球菌A蛋白与IgG 阳离子与阴离子 激素和受体等
亲和免疫细胞化学技术特点
亲合细胞化学引入免疫细胞化学后使其敏感 性得到进一步提高，因此更有利于微量抗原 （或抗体 ）在细胞或亚细胞水平的定位。
抗生物素—生物素免疫细胞化学染色法
基本原理 生物素 （Riotin）：是一种小分子的维生素 卵白素（Avidin）：又名亲合素，鸡蛋白中一种碱 性蛋白。 生物素与卵白素之间有很强的亲合力，较之抗体对 抗原的亲合力要高出100万倍，能够彼此牢固结合而 不影响彼此的生物学活性。 生物素与卵白素都具有与其它示踪物质如荧光素、 铁蛋白和过氧化酶等相结合的能力。
标记生物素—抗生物素技术（Labelled Avidin—Biotin technique, LAB技术）
一抗：生物素标记的特异性抗体 二抗：酶标记抗生物素
切片在含有25～50μ g/ml生物素标记抗体 （PBS液稀释）中孵育1h，室温。 PBS洗2次，每次5min。 用20～50μ g/ml过氧化物酶标记的抗生物素 液孵育90min，水洗。 酶呈色反应。
免疫组化检测action蛋白在大鼠卵巢组织中的表达。 请选择抗体组合，设计实验。
人抗大鼠action（同种型IgG ） 大鼠抗人action （同种型IgG ） 兔抗大鼠action （同种型IgG ） 生物素标记的兔抗人IgG 生物素标记的兔抗人IgM 生物素标记的人抗兔IgG 生物素标记的人抗兔IgM 碱性磷酸酶标记的卵白素 碱性磷酸酶标记山羊抗人IgG 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG
抗生物素—生物素染色法
1．抗生物素—生物素—过氧化酶复合物技术 （Avidin Biotin –Peroxidase Complex technique, 简称ABC技术） 2．桥抗生物素—生物素技术（Bridged Avidin –Biotin technique, 简称BRAB技术） 3．标记生物素—抗生物素技术（Labelled Avidin—Biotin technique, LAB技术）
抗原抗体反应
抗体是免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。 人类免疫球蛋白有五类，即IgG 、IgA、 IgM、 IgD 及IgE。 人体内的五类 Ig之间的区别就在于其各自重 链的氨基酸组成和抗原性不同。用小写希腊 字γ（Gamma）、α(Alpha)、μ(Mu)、 δ(Delta)、ε(Epsilon),分别表示IgG 、IgA、 IgM、IgD 与IgE的两条重链。
酶的要求
1. 2. 3. 4. 5. 6.
酶催化的底物必须是特异、容易观察； 定位效果好； 易获得，最好有商品出售； 酶的催化活性（Turnover）高并且稳定； 酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者的活性； 背景低：被检测组织中，不应存在与标记酶相同的 内源性酶或类似物质。
基本步骤
组织及切片制备 抗体的制备 切片封闭：血清等 与抗体孵育 加入显色底物显色 复染 观察
免疫酶细胞化学
预先将抗体与酶连结，再使其与组织内特异 抗原反应，经细胞化学染色后，于光镜或电 子显微镜下观察分析的形态学研究方法。
酶的种类
辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase , HRP）
碱性磷酸酶（Alkaline phasphotase, ALP） 葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOD）
免疫组织化学特点
1.高度特异性 2.敏感性高 3．方法步骤统一 4．形态、机能和代谢密切结合
基本技术方法
抗体的制备 组织材料的处理 免疫染色 对照试验 显微镜观察
免疫组织化学分类
根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为: 免疫荧光细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术 亲和免疫细胞化学技术 免疫电子显微镜技术
抗体制备
酶标抗体 酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体 上，制成酶标抗体。再借酶对底物的特异催 化作用显色。 非标记抗体酶法
酶桥法
抗过氧化物酶法（ PAP ）
PAP法的评价
抗体活性高 灵敏度高：灵敏度是指ICC方法所能发现最 少数量抗原而言。 背景染色低：
亲和免疫细胞化学技术