ELISA检测的干扰因素与方法
ELISA检测的干扰因素与方法
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ELISA检测的干扰因素与方法ELISA应用最广,但这种固相测定技术非完美无缺,把握实验过程中每一个可能出现差错的关键性问题,采取相应的举措,才有可能使实验性误(漏)诊减少到最低限度。
1. 表面效应首先必须明确指出的是,:“固相”ELISA与传统的“液相”血清学试验的最大.最本质的区别是有一个预先固相抗原或抗体到载体表面的步骤,以及抗原与抗体结合反应由液态环境移到了固相载体表面进行。
蛋白质分子在吸附过程中,为了克服与固相载体之间的排斥力,需要重新分布其表面的功能性基因,使疏水性基因充分暴露,然后,局部接触区域的偶极分子脱氢,再通过范德瓦尔斯力吸引而固相到载体表面。
表面效应可直接影响抗原,抗体的构象和功能。
此外,表面效应亦影响抗原和抗体结合反应的动力学过程。
(1)固相导致抗原的变化为了测定抗体水平,需预先将抗原固相(包被)到极性和水性的聚苯乙烯(PS)或聚氯乙烯(PVC)酶标板上。
用直接物理吸附方法固相蛋白抗原及DNA等,导致的变化是多方面的,可引起分子构象和抗原性发生改变。
酶活性测定时可消失。
牛血清白蛋白固相之后,其抗原价可由5价降为1价。
此外,发现被动吸附方法固相铁蛋白,呈团串状,不均一的随机分布,这种影响质控的情况具有普遍性。
最后,大多数小分子半抗原不易直接吸附到载体表面。
解决这一难题的方法,一般是采用在小分子抗原上,先偶联上葡聚糖,明胶等手臂后再进行固相包被。
对于有多重表达抗原决定簇的大分子抗原,用抗体桥式包被法可避免表面效应的影响。
将蛋白抗原吸附于胶体AI(OH)3后再固相也可以避免蛋白变性。
用Y射线辐照(400GY)PS板,不但可增加蛋白抗原吸附能力,而且还有降低抗体测定本底的作用。
(2)固相对抗体的影响直接吸附固相抗体(Igs)分子,除了呈团串状,不均分布和易解吸等一般不利因素之外,Igs分子摊开在载体表面,不但构象发生改变,而且影响抗体的活性,如IgG的结合价减少,可由2价变为1价,甚至完全失活。
Elisa影响因素及措施整理
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一、①一般检测试剂盒或检测试剂从冷藏或冷冻状态拿到室温使用需先在室温下平衡30~60 min,各试剂在使用前充分混匀。
②酶标仪测定结果,准确性决定于ELISA板底的平整与透明度、酶标仪的质量和软件的算法。
二、操作不当导致1、加样多、操作持续时间长,尤其是环境温度高时会导致个板孔间反应进程差异;2、除包被外,都宜采取45°加样,且要避免加到侧壁上;3、加样器不稳定、枪头不均一、试剂溅出、操作习惯不好等造成空间加样量不均一会对结果造成较大影响。
4、孵育时间过长,会导致非特异性反应增强;5、显色和终止加液时应避免气泡产生,以免影响检测读数;6、酶标板不宜叠放以减少受热不均,可采取水浴;7、贴密封膜,防止污物浸入和液体蒸发。
8、Elisa实验用的各试剂都要妥善配置和保存、避免污染,不合格的蒸馏水都可导致空白值或背景值升高。
三、检测样品处理不当引起溶血或污染1、血清或血浆标本分离不好或发生溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色;2、待检标本污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应;3、在冰箱中保存过久的标本,在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性;4、标本凝固不完全:血液通常在采集后半小时后开始凝固,18~24h完全凝固。
如果在血液未凝固时即离心分离血清,则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。
为了缩短标本处理时间,可以在离心前将血液标本置于温箱中温育或者采用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂以加速血清的分离。
5、标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用,使抗体效价跌落从而引起假阴性结果,所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测,宜少量分装冻存。
此外,标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩,分布不均,因此重新融解的标本必须混匀,但不要进行剧烈振荡,反复颠倒即可,产生泡沫或样品的过度混合将引起血清蛋白的变性。
ELISA检测方法
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ELISA检测方法ELISA(酶联免疫吸附实验)是一种常用的免疫学检测方法,广泛应用于医学、生物科学及环境科学等领域。
该方法利用抗体和酶的相互作用,能够检测和测定特定抗原或抗体的存在和浓度。
下面将详细介绍ELISA的原理、步骤、应用以及优缺点。
ELISA的原理主要基于抗原-抗体结合的原理。
首先,在固体表面(晶髓酶标板等)上吸附或共价结合抗原,形成抗原固相。
然后,将待测样品加入酶标板孔中与固定的抗原发生反应,形成抗原-抗体复合物。
随后加入特异性的酶标记抗体,使其与复合物形成二抗三重复合物。
最后,通过添加底物,酶催化底物产生可检测的色变反应,测定抗原或抗体的浓度。
1.抗原固定:将已知浓度的抗原加入酶标板中,并使其吸附在固体表面,形成抗原固相。
固相吸附通常通过物理吸附或共价结合实现。
2.试样加入:将待测样品加入酶标板中与固定抗原发生反应,形成抗原-抗体复合物。
通常需要对样品进行初步处理,如稀释、加入染色剂等。
3.二抗加入:将特异性酶标记的二抗加入酶标板中,与复合物发生特异性反应,形成二抗三重复合物。
4.清洗:通过洗涤剂将非特异性结合物洗去,以减少干扰。
5.基质加入:加入特定底物,如TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯二胺)或ABTS(2,2'-联氨基二(2-甲基丙酰氧)乙烷磺酸铵),酶催化产生彩色反应。
6.反应停止:用酸、碱或金属离子等停止反应,阻断底物的氧化反应,维持产色稳定。
7.反应测定:使用光度计测定产生的色素的吸光度或荧光。
ELISA具有广泛的应用。
在医学领域,ELISA常用于检测血液中的抗体和抗原,从而诊断传染病、自身免疫疾病等。
在生物科学研究中,ELISA可用于测定细胞因子、蛋白质等生物大分子的浓度。
此外,ELISA也可以用于检测环境样品中的污染物,如重金属、农药等。
1.灵敏度高:ELISA可以检测到较低浓度的抗原或抗体,常常超过其他方法的敏感度。
2.特异性强:ELISA利用特异性抗体进行识别,可准确检测特定的抗原或抗体。
ELISA法检测的影响因素及其对策
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ELISA法检测的影响因素及其对策酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前临床实验室检测免疫学指标最受欢迎、应用范围最广泛的方法之一,广泛应用于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病以及结核等传染类疾病的诊断及激素的检测,具有灵敏度高、特异性强、快速简便、重复性好、成本低、环保且适合大批量人群筛查等优点,虽然操作简单,但是一些影响因素不容小觑,临床待检标本常受溶血、黄疸、脂浊、类风湿因子、高浓度非特异性免疫球蛋白、药物、血液抗凝剂及细菌污染等因素的影响,导致检测结果判断错误。
酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是一种特殊的试剂分析方法,在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,其试剂易于保存、结果判断较为客观,是目前实验室检测抗原抗体最经济、最普遍的试验诊断方法。
其原理是将抗原(抗体)结合到固相载体表面,再将待测抗体(抗原)、酶标抗原(抗体)与固相抗原(抗体)结合形成免疫复合物,经洗涤使免疫复合物与待测抗体(抗原)呈比例,加入酶反应底物使其与固相上的酶反应变色,根据颜色做定性或定量分析,得出检测结果。
ELISA 法步骤包括标本的采集、保存、加样、温育、洗板、显色、比色以及结果判断,临床采集待检样本过程中常出现溶血、黄疸、脂浊,类风湿因子、高浓度非特异性免疫球蛋白、药物及血液抗凝剂等亦对结果产生一定影响。
虽然操作简单,但还是需要注意一些因素的影响,试剂的选择、正确的操作、优良的仪器都与检测结果密切相关。
本文根据样本的影响因素及操作流程中可能出现的相关问题展开笔述,对ELISA法检测的影响因素及相应对策作一综述,希望提高ELISA法检测的准确性。
1 样本的影响因素临床采取空腹抽取静脉血清作为ELISA 检测标本,标本采集过程中很多因素可能导致检测结果不准确,如溶血、脂浊、类风湿因子、甲胎蛋白、高浓度非特异性免疫球蛋白、药物、血液抗凝剂及细菌污染等。
ELISA检测的影响因素的分析
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ELISA检测的影响因素的分析【关键词】 ELISA检测;影响因素;分析ELISA即酶联免疫吸附试验,是一种常用的固相酶免疫测定方法。
Engvall 和Perlmann于1971年最先应用该法进行了IgG定量测定,并命名为“enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)”。
由于ELISA方法灵敏,特异性强不需要特殊设备,所以被广泛应用于各种抗原和抗体测定[1]。
如乙肝、丙肝抗体等等。
但ELISA测定中影响因素较多,而且其操作中有一定的技术要求,在临床检验中除正常反应外,有时常可见到一些错误结果(即假阳性或假阴性结果)。
本文就ELISA检测的影响因素做如下讨论。
1 标本的影响1.1 溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性可能是溶血血清中含有过氧化酶物质(红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素),在洗涤过程中往往难以完全洗脱,它可使H2O2释放出原生态氧(O),从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质,即显蓝色,产生假阳性[2]。
所以严重溶血标本禁用。
1.2 标本受细菌污染因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶,因此,被细菌污染的标本同溶血标本一样,亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。
1.3 标本保存不当在冰箱中保存过久的标本,在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性;为克服上述干扰,ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集;如不能立即测定,5 d内测定的血清标本可存放于4℃,1周后测定的血清标本应低温冻存;冻存后融解的标本,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混合后再测定,但混匀时应轻柔,不可强烈振荡。
1.4 塑料试管能吸附抗原物质,样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性最好使用真空采血管;并使用非抗凝标本,肝素抗凝血浆会增加OD值,EDTA、酶抑制剂(如NaN3)可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性。
1.5 标本凝固不全在工作中,有时为了争取时间快速检测,常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清,使血清中仍残留部分纤维蛋白原,在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块,易造成假阳性结果;因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清。
浅谈ELISA的影响因素
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浅谈ELISA的影响因素ELISA即酶联免疫吸附试验,ELISA是一种敏感性高、重复性好的固相酶联免疫测定广泛用于各种抗原抗体的检测,但影响因素较多,有时易出现假阳性或假阴性,本文重点针对内源性、外源性因素对ELISA测定结果的影响进行探讨。
标签:酶联免疫吸附试验(ELISA);测定结果;影响因素如今病毒性疾病的诊断主要依赖对其抗原、抗体的检测。
而检测方法大多采用酶联免疫吸附试验(ELISA),如何保证实验结果的准确性,现结合自己的实际工作经验,总结了下列影响因素,希望对检验工作者有所帮助。
1内源性干扰因素1.1类风湿因子(RF)在类风湿患者、其他自身免疫性疾病及正常人的血清中,常含有较高或不同浓度的RF,RF一般为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。
用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可以充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应。
1.2补体补体易激活C1q起到铰链作用,结果易出现假阳性。
1.3嗜异性抗体人类血清中含有天然的嗜异性抗体,将ELISA系统中一抗和二抗连接起来,造成假阳性。
1.4自身抗体由于B细胞的超反应性,患者血清中常出现一些自身抗体,能与靶抗原结合形成复合物。
1.5溶菌酶可致假阳性。
2外源性干扰因素2.1标本溶血,分离不完全、加有血球。
2.2标本被细菌污染。
2.3标本储存时间过长。
2.4标本凝固不全。
2.5冰冻保存标本反复冻融。
2.6试剂在室温下平衡<30分钟,配洗液的水不符合要求。
2.7加样速度过快,加样时加在孔壁上或产生气泡。
2.8温育时关键因素之一,尽量选择温度低的,温育时间长的试剂盒。
2.9洗涤要彻底。
2.10双波长比色可减少容器上的划痕和指印等造成的光干扰。
2.11试剂质量的影响。
选用高质量的试剂是保证结果准确的关键因素之一。
3高值鉤状效应(HOOK效应)在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时出现钩状效应。
过量抗原分别和固相抗体和酶标抗体结合,而不再形成“夹心复合物”类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同,如按常规法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应,因为标准曲线到达高峰后钩状弯落。
ELISA检测过程影响因素及操作注意事项
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3 温 育
E L I S A检测 中抗原 、 抗体反应的完成需要一定的温度 和时间, 这一保温过程称为温育 。不 同的试剂盒采取的温
育 温 度 可 能会 有 差 异 , 有4 3 ℃、 3 7 ℃、 室温和 4 ℃等 , 温 育
中 图分类 号 : ¥ 8 5 2 . 4 5 文献 标识 码 : B 文章 编号 : 1 0 0 4 — 5 0 9 0 2 0 1 4 0 1 — 0 0 4 6 — 0 2
酶联免疫 吸附法 ( E L I S A ) 是将 已知 的抗原或抗体结 合在 固相载体上 , 然后加入待测样本和酶标记的抗体或抗 原, 使其与预先包被在 固相载体上的抗原或抗体发生特异 性反应, 用洗液洗去多余的游离成分和干扰物质后滴加底
中很 难 保证 质 量完 全 一 致 , 为避 免结 果 差 异 , 应 尽 量选 择 同一批 次 的试剂 对样 本进 行 检测 。 试 剂 盒 应在 有 效 期 内使 用 , 尽量 做 到 随用 随 买 , 一般
吸光度值进行定量分析 。它是在免疫酶技术 的基础上发 展起来 的一种新型免疫测定技术 , 兼具抗原抗体反应的特 异性 和酶催化 的高效性 , 具有灵敏性 、 特异性高 , 重复性 好, 检测速度快及适宜大批量检测等优点 , 成为 目前应用 最为广泛的酶免疫测定技术 。被广泛应用于临床医学 、 环 境污染控制 、 食品质量安全监测 、 动物疫病诊断及畜产 品 药物残留等领域 。E L I S A检测操作简单 , 但人为因素对实 验结果影响较大。样本 、 试剂 、 加样 、 洗板等过程都会对结
定的干扰, 产生非特异性反应 , 使检测结果不准, 可离心沉 淀后取上清液检测 。冷藏或冷冻的样本检测时需回温至
影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法
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影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用,但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大,如不注意,有可能导致显色不全、花板等结果。
我将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下,以期给同行带来一些启发,提高试验质量。
操作步骤可能原因解决办法选择试剂选择质量优良的检测试剂,严格按照试剂说明书进行操作,操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。
加样1.血清或血浆标本分离不好即进行加样;2.手工操作中,加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时);3.加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。
1.标本为血清:最好将血液先自然存放1-2小时后,再用3000rmp离心15分钟;标本为血浆:必须使用含抗凝剂的血液标本收集管,采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次,放置一段时间后,3000rpm离心15分钟;若在几天内检测,可放在2-8℃冰箱中,若要贮存,则置于-20℃的低温冰箱内。
2.加样后及时放入孵箱。
3.加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。
4.如果采用AT或其他全自动加样,最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。
5.标本较多时,请分批操作。
孵育1.孵育时未贴封片或加盖,使标本或稀释液蒸发,吸附于孔壁,难于清洗彻底;2.孵育时间人为延长,导致非特异性结合紧附于反应孔周围,难以清洗彻底。
1.贴封片或加盖;2.按说明步骤严格控制操作时间。
洗板1.采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。
2.采用半自动洗板机洗板时,洗液量不足,导致洗板不彻底;洗板针堵塞,抽吸不完全;洗板不畅,导致洗板效果差。
3.反应板过多造成洗板等待时间长。
1.保证洗液注满各孔,洗板针畅通,洗完板后最好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干;2.合理安排,或多用几台洗板机。
显色1. 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂;2. 加显色剂时溅出孔外造成液体回流。
影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法
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三.血型常见问题分析
1.关于效价的问题: 目前公司内部质量规程规定A,B细胞均需达到1:128 O细胞需达
到1:8。 2.关于凝集的问题:
A , B细胞 1:128 + O细胞 1:8 + 此处的“+”为肉眼可见清 晰的凝集颗粒。 3.关于变色及溶血的问题: ①当细胞近效期时,有可能出现细胞浊液颜色发暗红,属正常现象。 ②正常细胞沉淀后,颜色鲜红色,摇匀后细胞浊液颜色鲜红。 ③当细胞受污染或细胞破碎,细胞沉淀后颜色暗红甚至发黑。细胞 浊液暗红或发黑。当细胞本身衰老或破碎后,有可能引起效价偏低, 凝集不实。
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问题6:单次实验中出现假阳性
处理意见:注意实验过程中的影响因素,特 别是实验中的洗板应设置浸泡 30---60秒时间。
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问题7:临床实验中出现假阳性偏高。
处理意见:A注意检查洗涤液中结晶部份是否
完全溶解。
B注意检查实验中所使用的仪器设
备是否定期校准 。
C注意检查实验中所用的板、酶标
D注意检查实验中所用的板、酶标 试剂的批号是否相同,不同批号 试剂不得混用。
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问题4:质控品灵敏度偏高 。
处理意见:卫生部临检中心的质控品存在 批间批内差异。 实验室相关条件改变导致质控变化,
看阳性对照品是否有明显变化。
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问题5:多次实验灵敏度一直偏低。
处理意见:A保存环境不规范。 B孵箱温度不足。 C温育时间不足。
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问题3:日常使用中出现弱阳性标本漏检。
处理意见:A标本本身由于各种因素影响而表现
浅谈影响ELISA结果因素分析
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浅谈影响ELISA结果因素分析ELISA法即酶联免疫吸附测定法,该方法的检测原理主要是通过待测物和酶连接,使得抗原与抗体发生特异反应,通过观察底物和酶颜色的变化得出检测结果,ELISA法根据种类和变化能够分成双抗体夹心法、间接法、竞争法以及捕获法,其中双抗体夹心法主要用于抗原的检测,间接法主要用于抗体的检测,竞争法可用于抗原与抗体的检测,捕获法则用于测定血清中某种抗体亚型的成分[1]。
酶联免疫吸附测定法具有灵敏性高以及特异性高的特点,在临床上应用十分广泛,发挥出十分积极的临床价值,然而存在诸多因素诸如试剂、标本、操作方法以及环境等方面会影响检测结果的准确性,本文主要对影响ELISA结果因素进行分析,并给出针对性的解决措施,具体信息如下。
1 试剂方面的因素ELISA法的检测结果直接受到试剂质量优劣的影响,试剂盒的生产厂家和质量、标记物的免疫活性、抗原抗体的纯度、试剂是否有效与试剂的储存方式等方面均会对ELISA法的检测结果有程度不一的影响[2]。
为避免上述情况影响检测结果的准确性,①在检测过程中需要确保ELISA 试剂盒中阴性对照的质量,从而避免假阴性与假阳性的出现;②抗原的中和必须准确滴定,防止由于抗原浓度过低或者过高影响试剂盒的敏感性而导致假阴现象的发生;③重视试剂的质量,给予完善的室内质控与定期开展室间质量评估;④根据试剂盒的开封时间与保存的状况来实施全点定标,进而保障检测结果的准确性;⑤有研究显示ELISA法的检测结果不准确很大程度上是受到试剂质量的影响,因此生产厂家必须重视试剂的质量,有必要时可通过人新鲜标本方法学来评估试剂的质量。
2 标本方面的因素实验标本对ELISA法的检测结果也具有很大的影响[3],主要包括内源性与外源性物质干扰。
内源性物质干扰主要包括药物、嗜异性抗体、人抗动物抗体、代谢产物、类风湿因子以及补体等,然而在ELISA法的检测过程中可通过下述方法处理标本来降低内源性物质干扰:①通过将抗原结合片段取代免疫球蛋白(IgG),将结晶片段(即Fc片段)消除,这样能够很大程度降低类风湿因子、嗜异性抗体以及人抗动物抗体对检测结果的干扰;②通过热处理的手段(56℃处理30min,63℃处理10min)与应用乙二胺四乙酸(EDTA)对标本进行稀释与2一巯基乙醇对标本进行稀释,以降低补体与类风湿因子对检测结果的干扰;③在标本中添加阻断剂如10%正常人血清和1%正常动物血清;④若检查发现标本中存在血红蛋白、胆红素以及血脂等成分时,必须重新采血检查[4]。
ELISA结果影响因素
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样本保存不当
01
保存温度
样本保存的温度过高或过低,可能会影响ELISA结果。一些蛋白质成分
可能会因为温度变化而发生变性,导致其与抗原或抗体的结合能力改变。
02
保存时间
样本保存时间过长,可能会导致某些成分降解或发生变化,从而影响
ELISA结果。
03
保存介质
用于保存样本的介质,如某些化学物质或防腐剂,可能会与待检测成分
01
仪器设备故障可能导致ELISA实验 结果不准确,如加样器、洗板机 、酶标仪等出现故障,影响实验 的重复性和准确性。
02
故障可能导致加样不准确、洗板 不彻底或酶标仪读数不稳定等问 题,进而影响实验结果。
仪器设备未校准
仪器设备在使用前需要进行校准,以确保实验结果的准确性 。
未校准的仪器可能导致加样量不准确、吸光度读数偏差等问 题,进而影响ELISA结果的判定。
详细描述
实验室湿度应控制在40%-60%之间,以避免实验材料受潮或过度干燥。如果实验室湿度不稳定,可 能会导致抗体和抗原的变性,从而影响实验结果。因此,实验室应安装湿度计,并定期检查以确保湿 度的稳定性。
实验室清洁度
总结词
实验室清洁度对ELISA结果的影响不容忽视。灰尘、污渍和微生物污染可能影响实验结果,导致假阳性或假阴性。
详细描述
实验室应保持清洁,每天清洁台面、地面和仪器表面,每周进行一次全面清洁。实验操作过程中,应避免交叉污 染,使用一次性手套和实验服。此外,实验室应定期进行微生物检测,以确保环境卫生符合标准。
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加样量不准确
温育时间不足或过长
温育时间对ELISA实验结果影响较大, 温育时间不足或过长均可能导致抗原 抗体反应不充分,降低实验敏感性。
ELISA试剂影响因素和常见问题分析
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ELISA试剂影响因素和常见问题分析1.标本及采集、运输因素 (2)2.试剂的影响 (2)3.操作技术的影响 (4)4.显色和比色 (5)5.HOOK效应影响 (6)6.干扰物质的影响 (6)7.药物的影响 (6)8.抗原自身因素 (6)9.异常结果分析 (7)9.1白板 (7)9.2显色弱、灵敏度低 (7)9.3灵敏度过高、板底高、背景高 (8)9.4假阳性 (9)9.5重复性差 (9)由于ELISA(酶联免疫实验)具有灵敏度高、特异性好的特点,已广泛应用于各种传染性疾病的筛查如肝炎、艾滋病、优生优育等。
虽然洗板只是ELISA实验重要环节中的一个,但作为专业的洗板机生产厂家,我们必须对影响ELISA实验结果各因素有一定的认识。
优质的试剂、良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。
如不注意,就容易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。
尤其是花板现象(就是空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常,而标本孔的OD值却明显偏高)是各个厂家洗板机调试中经常遇到的问题。
现将ELISA实验操作中注意事项总结如下,以期给大家带来一些启发,以改善洗板机的安装调试水平,提高临床检测质量。
1.标本及采集、运输因素严重溶血,以HRP为标记的ELISA测定中,残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶催化活性,催化底物显色造成假阳性;混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯内不易洗净;如有细菌污染,军体内可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应;标本凝固不全,有时为了争取时间快速检测,常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清,使血清中仍残留部分纤维蛋白原,在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块,易造成假阳性结果;采血试管洗涤不干净、反复使用易交叉污染;塑料试管能吸附抗原物质,样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。
血清标本宜在新鲜时检测,严重溶血标本禁用。
一般来说,在5天内测定的血清标本可放置在4℃,标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG聚合,使间接法的试剂本底加深。
ELISA原理、方法、操作及影响因素
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(二)抗体测定
①间接法
1)将抗原包被在固相载体上,加入待测样本,使样本中待测抗体 与固相载体上的抗原结合,加入酶标二抗(抗抗体物),在固相载 体上形成固相抗原—待测抗体—酶标抗抗体复合物,加入底物显色 2)常用于:丙型肝炎抗体、人免疫缺陷病毒抗体等
(二)抗体测定
②双抗原夹心法
1)双抗原夹心法适用于大分子抗体 2)形成固相抗原—待测抗体—酶标抗原复合物 3)常用于测定乙型肝炎表面抗体等
一、原理
(二)ELISA原理 1) ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫活性,酶标记的抗 原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性
2)在测定时,受检标本(测定其中的抗原或抗体)与固相载体表 面的抗原或抗体反应,用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体 复合物与液体中其他物质分开
二、酶免疫测定操作步骤
(一)标本的收集、运送和保存 (二)试剂准备 (三)加样 (四)温育 (五)洗板 (六)显色 (七)比色 (八)结果判读
操作示意图
(一)标本的收集、运送和保存
ELISA法中主要以血清为标本,血清标本按常规方法采集,应注意 避免溶血,因红细胞溶解释放出的具有过氧化物酶活性的物质对结 果有影响。
(二)试剂准备
三个必备试剂: 1)固相抗原或抗体 2)酶标抗原或抗体 3)酶反应底物
(三)加样
在ELISA中一般有3次加样步骤,即加标本、加酶结合物、加底物。 在加入血清标本后,可在微型振荡器上振荡1分钟以保证混匀,加 入酶结合物时,应使加液过程迅速完成。
(四)温育
目前常用的温育时间和温度为37℃ 30分钟—1小时,温育时间过短 或温度不够可影响反应物结合,从而影响结果
ELISA试验中常出现的问题及解决方法
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2.将反应板放入恒温箱时,反应板不能叠放,以保证反应板受热均匀,温度能迅速达到平衡。
四、洗板
1.要按照试剂说明书上的说明配制好洗涤液,配制洗涤液用水最好为新鲜的蒸馏水,配制倍数准确。
2.洗板时要按照试剂说明书上的洗涤方法洗涤,不能随意改变洗涤方法,洗涤时间,洗涤次数。
3.不同厂家,不同批次试剂的洗涤液不能混用。
4.配制洗涤液用水的质量很重要,关系试验成败,准确与否,洗涤用水最好用新鲜合格的蒸馏水。
五、OD值测定
显色完成,加终止液后将反应板放入酶标仪检测OD值。
1.在反应结束前应将酶标仪开启,预热10~20 min,仪器放置应
鸡新城疫(New Castle disease)又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟,是由副黏病毒科的新城疫病毒引起的急性高度接触性传染病,传播迅速,对鸡养殖业造成严重危害和巨大的经济损失。
对该病的防治目前没有特别有效的手段,主要通过接种疫苗来进行预防。
最近的研究表明,新城疫的流行表现出一些新的趋势,即在目前普遍采用疫苗免疫的情况下,。
酶联免疫吸附试验的常见影响因素及处理方法
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酶联免疫吸附试验的常见影响因素及处理方法酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)是一种常用的实验技术,用于测定样品中特定蛋白质或抗原的浓度。
然而,在进行ELISA实验时,存在许多可能影响实验结果的因素。
本文将介绍一些常见的影响因素及如何处理这些问题。
1.样品质量:样品质量是影响ELISA实验结果的一个重要因素。
如果样品质量不合格,可能会导致错误的实验结果。
处理方法包括:-选择合适的样品储存条件,避免样品的变性、降解等问题。
-对样品进行适当的纯化和浓缩处理,以提高样品的纯度和浓度。
2.抗体选择:在ELISA实验中,正确选择适合的抗体也是非常重要的。
处理方法包括:-确保抗体的特异性和亲和力,避免与其他非特定蛋白结合。
-对抗体进行亲和纯化,以提高抗体的纯度和活性。
3.反应条件:ELISA实验中的反应条件包括温度、时间、pH等,这些条件的选择直接影响到实验结果的准确性。
处理方法包括:-对反应条件进行优化,确定最佳的温度、时间、pH等参数。
-控制反应时间,避免反应过长或过短而引起实验结果的偏差。
4.检测方法:ELISA实验中常用的检测方法有酶标记物检测、放射性同位素检测、荧光检测等。
不同的检测方法对实验结果的影响也不同。
处理方法包括:-选择合适的检测方法,根据实验的目的和需要进行选择。
-对检测方法进行优化和标准化,以提高检测的准确性和灵敏性。
5.交叉反应:ELISA实验中,样品中的其他成分可能会引起交叉反应,导致实验结果的误差。
处理方法包括:-使用对特定抗原具有高度特异性的抗体,避免与其他非特定抗原结合。
-对样品进行适当的稀释,以减少交叉反应的可能性。
6.数据分析:ELISA实验的数据分析是实验结果的重要环节。
处理方法包括:-使用适当的统计方法对实验数据进行分析,确定浓度或活性的可靠性。
-进行实验重复和平行实验,以确保实验结果的可重复性和准确性。
ELISA测定结果的影响因素及其排除方法
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【专家讲座】EL ISA 测定结果的影响因素及其排除方法候小玲1,孙圣明2作者单位:1.湖南省石门县人民医院检验科415300;2.湖南省常德市第三人民医院检验科415000作者简介:候小玲(19562),女,湖南石门人,主管检验师。
研究方向:免疫学检验。
【主题词】 酶联免疫吸附测定 方法【中图分类号】 R 446.63 【文献标识码】 A 【文章编号】 100926647(2007)1623712202 目前酶联免疫吸附试验(Enzym e 2L inked I mm uno so rbent A ssay ,EL ISA ,简称酶免)是临床实验室最常用的一种标记免疫方法。
EL ISA 在基础研究和常规的临床实验室中有着广泛的适用性,具有操作简便,灵敏度较高,试剂成本低,环保,适于大批量人群抗原抗体筛查等优点,已广泛应用于肝炎病毒,艾滋病毒筛查,癌胚抗原,甲胎蛋白和激素等项目的检测。
但EL ISA 法测定结果的影响因素较多,影响因素主要有:(1)试剂因素;(2)标本因素;(3)实验原理或操作方法;(4)环境因素等。
因此在临床检验工作中,除正常反应外,还常会出现一些假阳性和假阴性等异常结果。
总结如下。
1 试剂因素试剂质量是影响检测结果的直接因素,对于生产厂家出品的试剂盒,其抗原抗体的纯度,标准品定值的准确性,抗体的亲和力、滴度和特异性,标记物的比活性或免疫活性等[1],均对测定结果产生直接影响。
还有试剂盒的稳定有效期,运输条件及储存方式等也均会对结果产生一定程度影响。
在EL ISA 试剂盒中阴性对照的质量也显得尤为重要,当阴性对照吸光度(OD 值)较高,夹心法易产生假阴性,而竞争抑制法易产生假阳性。
还有竞争抑制法中,EL ISA 检测结果与实验用中和抗原浓度和含量有极大关系[2],这也最为我们所忽视。
中和抗原必须严格滴定,如果中和抗原浓度过高,试剂盒敏感性下降,检出率低,假阴性增多[2]。
试剂盒整体上,试剂灵敏度主要取决于抗体亲和常数(K 值)和抗体的滴度,还取决于标准曲线的斜率和零标准管的重复性两个因素[1]。
elisa结果影响因素
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类地高辛、类AFP样物质等,是与靶抗原有交叉反应的物质。在用多抗 测定抗原时对测定结果影响不大,但在用单克隆抗体测定抗原时 ,假如交叉 抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时,也会出现假阳性结 果。
整理课件
结果影响因素——标本因素
外源性物质:
(1)标本溶血
红细胞溶解释放的血红蛋白具有过氧化物酶活性,在以辣根过氧化物酶 为标记的 ELISA测定中,会导致非特异性显色,故标本采集时应避免溶血。
(5)标本管中添加物质的影响
抗凝剂(如肝素,EDTA)、酶抑制剂(如NaN3可抑制ELISA系统中辣根 过氧化物酶活性)及分离胶等均对ELISA测定有一定干扰作用。
整理课件
结果影响因素——标本因素
表 1 内外源物质的干扰
[1].许斌等.ELISA检测HBsAg影响因素的探讨. 临床检验整理杂课志件.2000.VoI.18.No.4
结果影响因素——标本因素
(4)嗜靶抗原的自身抗体
抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体,有时能与靶抗原结 合形成复合物,在ELISA方法中均可干扰抗原抗体测定结果。 解决的办法: 测定前用理化方法将其解离。
(5)医源性诱导的抗鼠Ig ( s )抗体
鼠源性CD3等单克隆抗体治疗,用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像 诊断及靶向治疗等新技术,均有可能使病人体 内产生抗鼠抗体;另外,被鼠 等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠Ig ( s )抗体。这些病人ELISA测 定时均可产生假阳性。解决的办法是:测定抗原时,在标本中加入足量的正 常鼠Ig ( s ) 。
+
-
双抗体夹整心理课法件 测抗原
ELISA结果判定
1.定性测定
影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法
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(4)洗板过程中易出现的几点情况
1. 采用手工洗板 , 孔与孔之间液体容易交叉,切 不可随意洗板。 2. 采用洗板机洗板时,洗液注入孔中量不足, 导致洗板不彻底,造成本底高。 3. 由于血液中纤维原蛋白,造成洗板针堵塞, 抽吸不完全,造成洗板不畅,导致洗板效果差, 直接影响本底。 4. 反应板过多,不能保证及时洗板,造成洗板 等待时间过长,影响结果。
问题7:临床实验中出现假阳性偏高。 处理意见:A注意检查洗涤液中结晶部份是否 完全溶解。
B注意检查实验中所使用的仪器设
备是否定期校准 。
C注意检查实验中所用的板、酶标
试剂的批号是否相同,不同批号
试剂不得混用。
处理意见:D假阳性标本表现在临界值附近较 多,通常与当时实验的水平有关, 注意检查实验条件的波动 。 E避免加样时间过长 。
5.洗板前先将孔内液体甩出包被板。
(5)显色过程中易出现的问题
1. 显色剂配制后放置时间过长或使用已经 变色失效的显色剂; 2. 用排枪加A、B混合液时,加样槽不够干 净,造成花板 。
3. 不同厂家试剂的显பைடு நூலகம்液混用。
(6)终止和读数时的注意事项
1.加完终止后30分钟内读取数据。 2.读板时板底如果不清洁,就会导致所读的 数据不准确,所以在读数前尽量保证酶标板的 底部是清洁的。
F由于试剂盒灵敏度过高而造成临
床假阳性偏高的结果。
问题8:多次实验重复性差。 处理意见:A加样后充分混均。 B尽可能使用同一加样器,装紧
枪头。
C测量波长保持一致。
D加样量、加试剂量保持一致。
三.血型常见问题分析
1.关于效价的问题: 目前公司内部质量规程规定A,B细胞均需达到1:128 O细胞需达 到1:8。 2.关于凝集的问题: A , B细胞 1:128 + O细胞 1:8 + 此处的“+”为肉眼可见清 晰的凝集颗粒。 3.关于变色及溶血的问题: ①当细胞近效期时,有可能出现细胞浊液颜色发暗红,属正常现象。 ②正常细胞沉淀后,颜色鲜红色,摇匀后细胞浊液颜色鲜红。 ③当细胞受污染或细胞破碎,细胞沉淀后颜色暗红甚至发黑。细胞 浊液暗红或发黑。当细胞本身衰老或破碎后,有可能引起效价偏低, 凝集不实。
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ELISA检测的干扰因素与方法
ELISA应用最广,但这种固相测定技术非完美无缺,把握实验过程中每一个可能出现差错的关键性问题,采取相应的举措,才有可能使实验性误(漏)诊减少到最低限度。
1. 表面效应
首先必须明确指出的是,:“固相”ELISA与传统的“液相”血清学试验的最大.最本质的区别是有一个预先固相抗原或抗体到载体表面的步骤,以及抗原与抗体结合反应由液态环境移到了固相载体表面进行。
蛋白质分子在吸附过程中,为了克服与固相载体之间的排斥力,需要重新分布其表面的功能性基因,使疏水性基因充分暴露,然后,局部接触区域的偶极分子脱氢,再通过范德瓦尔斯力吸引而固相到载体表面。
表面效应可直接影响抗原,抗体的构象和功能。
此外,表面效应亦影响抗原和抗体结合反应的动力学过程。
(1)固相导致抗原的变化
为了测定抗体水平,需预先将抗原固相(包被)到极性和水性的聚苯乙烯(PS)或聚氯乙烯(PVC)酶标板上。
用直接物理吸附方法固相蛋白抗原及DNA等,导致的变化是多方面的,可引起分子构象和抗原性发生改变。
酶活性测定时可消失。
牛血清白蛋白固相之后,其抗原价可由5价降为1价。
此外,发现被动吸附方法固相铁蛋白,呈团串状,不均一的随机分布,这种影响质控的情况具有普遍性。
最后,大多数小分子半抗原不易直接吸附到载体表面。
解决这一难题的方法,一般是采用在小分子抗原上,先偶联上葡聚糖,明胶等手臂后再进行固相包被。
对于有多重表达抗原决定簇的大分子抗原,用抗体桥式包被法可避免表面效应的影响。
将蛋白抗原吸附于胶体AI(OH)3后再固相也可以避免蛋白变性。
用Y射线辐照(400GY)PS板,不但可增加蛋白抗原吸附能力,而且还有降低抗体测定本底的作用。
(2)固相对抗体的影响
直接吸附固相抗体(Igs)分子,除了呈团串状,不均分布和易解吸等一般不利因素之外,Igs分子摊开在载体表面,不但构象发生改变,而且影响抗体的活性,如IgG的结合价减少,可由2价变为1价,甚至完全失活。
实验结果表明,单克隆抗体比多克隆抗体更易失活,固相后仍能保持结合能力的分子仅占少数,分别为3%和5%-10%。
这不但浪费抗体试剂,更可惜的是空置了有限的微孔表面积。
抗体分子N末端为Fab,C末端为Fc,直接被动吸附的随意性,造成一部分
Fab,C末端为Fc,直接被动吸附的随意性,造成一部分Fab结合位点朝向载体一面,或因用量过多而造成的重叠吸附,部分Fab结合位被遮盖,均可导致其总体结合能力下降。
为此,出现了可以“锚定”F.段在载体表面,而使Fab朝外的共价结合法,即在载体上导入氨基肼基等活性基因,然后在水溶性碳二胺作用下,与Igs的羧基共价结合,或直接与羟基化糖基产生的醛基共价结合:含溴乙烯基团的PS板,可在双功能交联剂如戊二醛的帮助下与蛋白质共价结合。
目前,国外已有有关的酶标板产品(专利)供应。
桥式法是一种避免Igs与载体直接接触的固相方法,有几种不同的类型:(1)抗抗体法:(2)SPA法:(3)链酶亲和素生物素法,这一种方法应用最为成功,只要预先将第一捕捉抗体生物素化:(4)抗半抗原抗体法,这需要将捕捉体预先记半抗原。
(3)抗体介导的抗原分子变构抗原与抗体分子在三维立体空间自由运动,互相碰撞,彼此特异性结合,这种结合不似早期相像中的单纯的“锁-匙”关系,而是一种柔性的诱导契合。
抗原分子决定簇可以突入到Fab的深底部,反过来,Fab为了执行其固有生物学功能,主动地发生变角折弯,锥形转动及最N 末端可变区的“球穴”摆动,以契合抗原决定簇,Fab亦可突入到大分子抗原的较深的位区。
液态中的抗原体分子在完成一级结合反应之后,该复合物可以通过抗原抗体之间的特异性结合,亦可通过抗体Fc-Fc段的非特异性结合而进一步交联,形成肉眼可见的晶格形网络沉淀凝集型的抗原抗体二级反应复合物。
纵观全过程,抗原分子一般总能保持其固有的构象,而复合物中的抗体构象变化则较大。
相反,在固相抗体测定抗原的过程中,由于表面效应的关系,抗体介导的抗原分子变构具有特殊意义。
2. HD-HOOK效应
这种发生在固相法试验过程中的可造成“假低值”甚至“假阴性”错误结果的特殊效应,称为“高剂量钩镰(HD-HOOK)效应”。
它的产生条件、分子基础、导致的后果等,都与传统的液相沉淀、凝集反应中的“区带现象”不一样。
在一步二位点夹心ELISA中,主要是因为待测抗原的总量过高,竞争结合反应系统中的限量标记二抗,从而产生抗原越多,最终反应信号越低的HD-HOOK效应,如HBsAg等可出现假阴性。
抗原“量”是决定的因素,一般认为二步二位点夹心固相测定法不会产生抗原过剩的“阴滞现象”之观点,早已被Miles的实践否定,只是并非所有二步夹心法都会产生HD-HOOK效应。
迄今为止,仅少数具有多重抗原决定簇的大分子蛋白质抗原,如铁蛋白、前列腺特异抗原(PSA)、人绒毛膜促
性腺激素(HCG)、甲胎蛋白(Afp)、细胞溶素-D等,本身具有分子变构内因的抗原,测定时发现了HD-HOOK效应。
抗原“质”的特性是决定的因素,而标记二抗介导抗原分子变构是重要的外因。
当然抗原的数量亦是必备的相关因素。
以铁蛋白为例,被捕捉的铁蛋白抗原分子,与亲和性比一抗大的标记二抗发生交叉重叠结合后,由于立体效应,可促使铁蛋白分子变构,使其与一抗解离,形成标记二抗与铁蛋白分子复合物,而被随后的洗涤过程洗离出去,最终的信号下降。
在剂量反应曲线的高剂量(HD)区段,其线型走向不是呈平台状无限后延,而呈向下弯落状,似一只钩或一把镰刀(HOOK).若单纯从剂量反应曲线的钩状图形来看,与区带现象中抗原过剩型复合物的“后带现象”十分相似。
然而,其分子基础完全不同,“晶格理论”仅能解释区带现象,而对固相二步夹心ELISA的HD-HOOK 效应的解释,目前认为,“抗原分子变构理论”比较贴切。
克服HD-HOOK效应,主要依靠试剂盒的生产厂家。
首先,对靶抗原的决定簇应尽可能弄清楚,在此基础上,选择仅有一种而且仅有两个重复表达的决定簇,或者两种且每种仅有一个表达的决定簇,选用相应的一个单抗,或者两个相应单抗来组建药盒,有可能从根本上解决HD-HOOK效应的弊端。
作为应用者,可用稀释测定法解决这一问题。
在测定未知标本的aFP值时候,用原标本与10倍稀释的标本同时测定,发现原倍孔A值低于稀释孔,证实了HD-HOOK的存在,从而避免了实验的误(漏)诊。