ELISA 直接法与间接法的区别
酶联免疫分析的基本类型和原理
酶联免疫分析的基本类型和原理酶联免疫分析（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种灵敏的免疫学分析方法，广泛应用于生物医学领域，包括基础研究、临床诊断、药物筛选等。
该方法基于抗原-抗体的特异性结合反应，将酶与抗体或抗原的结合，通过酶促反应的放大效应，实现对蛋白质的灵敏检测。
一、酶联免疫分析的基本类型根据实验设计的不同，酶联免疫分析可以分为直接法和间接法两大类。
1.直接法：将酶标记的抗体直接与抗原反应，通过检测抗原-抗体-酶复合物的吸光度来定量抗原。
这种方法适用于检测抗原含量较高的样品，如病毒、细菌等。
2.间接法：将酶标记的抗抗体与特异性抗体反应，通过检测抗抗体-抗体-酶复合物的吸光度来定量特异性抗体。
这种方法适用于检测特异性抗体含量较高的样品，如血清、血浆等。
二、酶联免疫分析的原理酶联免疫分析的原理是利用抗原-抗体的特异性结合反应，将酶与抗体或抗原的结合，通过酶促反应的放大效应，实现对蛋白质的灵敏检测。
具体步骤如下：1.包被：将抗原或抗体包被在固相载体（如聚苯乙烯酶标板孔）上，使其与样品中的抗原或抗体结合。
2.温育：将包被后的样品放入温育箱中，保持一定温度和湿度，使抗原-抗体结合反应充分进行。
3.洗涤：洗涤未结合的游离抗原或抗体，去除未结合的物质，使后续步骤中的酶促反应更加特异。
4.加入酶标抗体或酶标抗原：将酶标记的抗体或抗原加入到洗涤后的样品中，使其与已结合的抗原或抗体特异性结合。
5.温育：将样品再次放入温育箱中，保持一定温度和湿度，使酶促反应充分进行。
6.洗涤：洗涤未结合的游离酶标抗体或酶标抗原，去除未结合的物质，使后续步骤中的显色反应更加特异。
7.显色：加入底物溶液，使其与已结合的酶标抗体或酶标抗原中的酶发生显色反应，生成有色产物。
8.终止反应：加入终止液，停止显色反应，使有色产物不再生成。
9.检测：用酶标仪测定各孔的光密度值，通过与标准曲线比较，计算出样品中待测抗原或抗体的浓度。
ELISA方法类型及原理
ELISA方法类型及原理ELISA是一种重要的实验技术，用于检测和定量分析蛋白质、抗体、荷尔蒙、生物学分子等。
ELISA的全称是酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），它通过将目标物（如抗原或抗体）与特定的酶标记物结合，然后利用染色反应来检测、定量或分析目标物。
根据目标物的不同，ELISA可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、间接竞争ELISA和反向ELISA等方法。
1.直接ELISA直接ELISA是最简单的一种ELISA方法。
它将目标物直接吸附在固相载体表面，然后加入与目标物特异性结合的酶标记抗体来检测目标物。
具体步骤包括：将目标物溶液加入固相载体中，使目标物吸附在载体表面；加入特异性酶标记抗体，与目标物结合；通过染色反应来检测酶的活性和目标物的定量。
2.间接ELISA间接ELISA是较常用的一种ELISA方法。
它将目标物首先吸附在固相载体表面，然后加入与目标物特异性结合的初级抗体，再加入与初级抗体特异性结合的酶标记二抗来检测目标物。
具体步骤包括：将目标物溶液加入固相载体中，使目标物吸附在载体表面；加入特异性的初级抗体，与目标物结合；加入与初级抗体特异性结合的酶标记二抗；通过染色反应来检测酶的活性和目标物的定量。
3.竞争ELISA竞争ELISA是一种用于定量测定样品中目标物含量的ELISA方法。
它将目标物预先包被在固相载体表面，然后加入与目标物特异性结合的酶标记抗体和待测样品，测定抗体与固相载体表面的目标物竞争的程度来定量目标物的含量。
具体步骤包括：将目标物溶液加入固相载体中，使目标物包被在载体表面；加入特异性酶标记抗体和待测样品；通过染色反应来检测酶的活性和竞争程度来定量目标物的含量。
4.间接竞争ELISA间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的原理。
首先将目标物吸附在固相载体上，然后加入与目标物特异性结合的初级抗体，再加入与初级抗体特异性结合的酶标记二抗和待测样品。
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测并定量测定生物样品中的抗体或抗原。
ELISA方法包括直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等。
下面将对这些方法的类型和反应原理进行详细介绍。
1.直接ELISA直接ELISA是最简单的ELISA方法之一、在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原，然后加入待检测样品，如血清等。
待检测样品中的抗体与涂覆的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
然后加入特异性抗体，这些抗体已标记有酶，比如辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP），然后加入适当的底物。
酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成正比。
2.间接ELISA间接ELISA是常用的ELISA方法之一，比直接ELISA灵敏度更高。
在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原，然后加入待检测样品，如血清等。
待检测样品中的抗体与涂覆的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
然后加入与待测抗体特异性的二抗，这些二抗已标记有酶，如HRP，再加入适当的底物。
酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成正比。
3.竞争ELISA竞争ELISA是一种用于测定样品中抗原或抗体浓度的ELISA方法。
在这种方法中，微孔板表面上涂覆有特异性抗体，然后加入待检测样品和已标记的抗原或抗体。
待检测样品中的抗原或抗体与涂覆的抗体竞争结合，形成复合物。
然后加入特异性的抗原或抗体，这些抗原或抗体已标记有酶，比如HRP，继续竞争与涂覆抗体结合。
酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成反比。
4.间接竞争ELISA间接竞争ELISA是一种用于测定样品中抗原或抗体浓度的高灵敏度ELISA方法。
在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原。
ELISA六种方法类型及原理
ELISA六种方法类型及原理ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验技术，用于测定样品中特定抗原或抗体的存在和浓度。
它的原理基于抗原和抗体之间的专一结合，利用酶标记的抗体或抗原来检测并定量目标物。
ELISA有多种不同的方法类型，以下将对其中六种方法类型及其原理进行详细介绍。
1.直接ELISA：直接ELISA是最简单和最常用的ELISA方法，适用于寻找目标抗原。
在这种方法中，被测抗原直接吸附在固相或表面上，然后与特异性酶标记的抗原特异性结合。
最后，通过酶标记的底物的反应来定量测定目标物的浓度。
2.间接ELISA：间接ELISA也是常用的方法，适用于寻找目标抗体。
首先，将被测抗原吸附在固相或表面上，然后加入待测抗体。
之后，特异性结合的第二抗体（酶标记的）被加入用于识别和检测第一抗体。
最后通过酶标记的底物的反应来定量测定目标物的浓度。
3.竞争ELISA：竞争ELISA用于检测样品中的特定抗原或抗体。
在这种方法中，特异性酶标记的抗原或抗体与待测样品中的抗原或抗体竞争结合。
通过测定酶标记物的信号强度，可以确定待测样品中目标物的含量。
4.间接竞争ELISA：间接竞争ELISA是一种用于定量测定目标抗原的方法。
首先，在固相或表面上吸附被测抗原，然后加入特异性抗体。
该抗体与样品中的目标物竞争结合。
接着，再加入另一特异性抗体，该抗体与前面结合的抗体有竞争关系。
最后通过测定酶标记物的信号强度，可以确定目标物的浓度。
5.间接夹心ELISA：间接夹心ELISA用于寻找样品中的特定抗体。
首先，在固相或表面上吸附被测抗原，然后加入待测抗体。
随后，特异性酶标记的第二抗体被加入，用于识别和检测待测抗体。
最后通过测定酶标记物的信号强度，可以定量测定目标抗体的浓度。
6.双抗体ELISA：双抗体ELISA常用于寻找特定抗原。
首先，在固相或表面上吸附被测特异性抗体，然后加入样品。
目标抗原与抗体特异性结合。
接着，酶标记的第二抗体被加入，该抗体与目标抗原结合。
ELISA实验中各种方法原理及优缺点比较
wash BSA
wash wash TMB
ELISA 实验中各种方法原理及优缺点比较
ELISE 实验是指酶联免疫吸附试验（enzyme linked
immunosorbent assay)指在固定相上进行免疫酶技术，其依据有1：蛋白质可以吸附到固定相上而不改变其活性，2：抗原或抗体与酶交联以后仍可保持其活性及酶的催化活性，3：交联后的酶可以与反应底物进行反应，并催化其分解，产生有色物质。
根据有色物质的多少，即颜色的深浅，通过酶标仪测定其颜色与标准物质颜色的差异，根据酶测曲线得出其浓度。
ELISE 实验基本类型有直接法、间接法、抗体夹心法、竞争法、抑制法。
现将各种方法原理及优缺点总结如下：
一：直接法
直接法利用抗原结合在固定相上面，用酶联抗体直接与抗原结合，而后分解底物。
二：间接法
间接法利用抗原与固定相结合后，用一抗与抗原结合，再用二抗V 区和一抗S 区结合。
酶联抗体位于二抗上。
由于一抗V 区具有稳定性，S 区具有可变性，所以在与不同抗原结合时，V 区变化
而S 区不变，故间接法可以测定
三：双抗夹心法
利用抗体锚定在固定相上，抗原与其结合后，抗原的另外一个表位与酶联抗体结合，催化底物分解，故双抗夹心法适用于某些大
TMB
wash wash
wash
分子的具有至少双表位的抗原
四：竞争法
竞争法是指针对抗原上同一抗原表位，分别用抗体与酶联抗体先后与其结合，抗体占据表位后，
故催化底物反应的能力相应下降。
子或只有一个抗原表位或重复抗原表位的抗原。
wash wash
TMB。
ELISA的原理和基本类型
ELISA的原理和基本类型ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫测定技术，通过测定抗原或抗体与其相应配体之间的特异性反应来检测目标物质的存在和浓度。
这项技术具有高灵敏度、高特异性和高通量性的优势，已广泛应用于医学、生物学、环境科学和食品安全等领域的研究和临床诊断中。
1.直接ELISA：直接ELISA是最简单的ELISA形式之一、在直接ELISA中，适量的抗原被吸附在固相（如微孔板）上后，样本中的抗体与其结合。
接着，通过与该抗体特异性结合的酶标记抗体检测目标物质的存在与否。
最后，加入底物使酶催化发生彩色反应，根据颜色的强度来确定抗原浓度。
2.间接ELISA：间接ELISA是最常用的ELISA形式之一、在间接ELISA中，抗原被吸附在固相上，然后与试样中的抗体结合。
随后，加入与试样中抗体结合的酶标记抗体，再加入底物以进行酶催化的彩色反应。
该方法的优势在于，只需要极少量目标抗原即可进行检测。
3.竞争ELISA：竞争ELISA用于测定抗体或抗原浓度，是一种定量分析的方法。
在竞争ELISA中，抗原或抗体与固相相结合的抗体或抗原发生竞争结合，测定竞争反应的结果来确定目标物质的浓度。
4.夹心ELISA：夹心ELISA又被称为“双抗体夹心ELISA”。
该方法可用于检测样品中特异的抗原或抗体。
在夹心ELISA中，首先将一种抗体吸附在固相上，样品中的抗原与之结合。
然后加入酶标记的第二抗体与抗原再次结合。
最后，加底物使酶发生催化反应，并测量酶催化发生的信号。
总而言之，ELISA是一种高灵敏度、高特异性的免疫测定技术，可以通过测定抗原和抗体之间的特异性反应来快速、准确地检测目标物质的存在和浓度。
在不同类型的ELISA中，抗原或抗体通过固相吸附、结合特异性的酶标记抗体、进行酶催化反应的彩色反应来实现检测。
ELISA技术在医学、生物学和环境科学等领域的研究和诊断中发挥了重要作用。
ELISA_直接法与间接法的区别
ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体.在这种测定方法中有三个必要的试剂1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);(3)酶反应的底物.根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不类型的检测方法.ELISA可分类是根据抗原抗体的结合情况来分类的。
主要有以下几种类型:（直接法也称一步法）1 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质.2) 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质.3) 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关.4) 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测.在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应.假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg 有adr,adw,ayr,ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题.双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。
直接免疫荧光和间接免疫荧光染色方法的异同
直接免疫荧光和间接免疫荧光染色方法的异同免疫荧光细胞化学方法的原理是根据抗原抗体反应的规律，把已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗原或抗体，然后以它作为探针来检测组织或细胞内的相应物质。
方法具体种类有直接法、间接法、夹心法和补体法等。
在荧光显微镜下，根据其形成复合物所发的荧光，来确定判断检测物的来源、性质和部位。
1、直接法：这是最早的方法。
其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体，染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育，使之直接与载玻片上的抗原结合，在荧光显微镜下直接观察，作出判断。
该方法评价：简单易行、特异性高、快速方便，常用于肾活检组织几种免疫球蛋白的检测和病原体的检测。
但其不足是只能检测相应的一种物质，敏感性较差，效果有时不理想，目前较少作为更多方面的检测。
2、间接法：该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体，与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。
在荧光显微镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。
该方法评价：由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。
目前本法应用较广泛，只需制备一种种属荧光抗体，即可适用于多种第一抗体的标记显示。
3、如果你有针对待查抗原一抗（荧光素标记），而且你的待检抗原表达也比较丰富的话，做直接法也未尝不可。
不过如果你不具备上述两个条件的话，还是推荐你做间接法。
4、如果你做的是细胞骨架，那么就是用直接免疫荧光。
如果是一般的蛋白表达，这个要看有没有试剂是直接标记的；如果没有，还是只能考虑间接荧光。
直接荧光相对间接荧光可以避免非特异姓染色，当然步骤也少了些。
我做过细胞骨架的直接染色，效果很好。
来源：互联网。
ELISA_直接法与间接法的区别
ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体.在这种测定方法中有三个必要的试剂1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);(3)酶反应的底物.根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不类型的检测方法.ELISA可分类是根据抗原抗体的结合情况来分类的。
主要有以下几种类型:（直接法也称一步法）1 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质.2) 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质.3) 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关.4) 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测.在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见 1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应.假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题.双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。
免疫组织化学直接法和间接法优缺点总结
免疫组织化学直接法和间接法优缺点总结免疫组织化学是一种用于检测细胞或组织中特定抗原或抗体的技术手段。
其主要应用于病理学诊断、生物医学研究和临床治疗等领域。
在免疫组织化学中，直接法和间接法是两种常用的技术路线，在具体应用时各自具有一些优点和缺点。
本文将针对这两种方法进行系统总结，以期为免疫组织化学技术的选择提供一定的参考依据。
一、直接法直接法是指在组织切片上直接检测抗原或抗体的方法。
其步骤主要包括：1. 杀菌、固定和脱水处理2. 抗原修复3. 封闭剂处理4. 抗体标记5. 染色显示直接法的主要优点包括：1. 操作简便，节省时间2. 对目标抗原或抗体的确认准确性高3. 信号直接来源于目标物质，信号强度相对稳定直接法的缺点包括：1. 信号叠加或掩盖现象相对较多2. 容易产生假阳性或假阴性结果3. 针对不同抗体需要反复优化条件二、间接法间接法是指在组织切片上间接检测抗原或抗体的方法。
其步骤主要包括：1. 杀菌、固定和脱水处理2. 抗原修复3. 封闭剂处理4. 一抗处理5. 二抗标记6. 染色显示间接法的主要优点包括：1. 信号放大效应明显，检测灵敏度高2. 信号叠加或掩盖现象相对较少3. 可以使用多种不同抗体进行多重染色间接法的缺点包括：1. 操作相对复杂，耗时较长2. 对目标抗原或抗体的确认准确性略低3. 信号来源于间接标记物质，信号强度相对不稳定三、综合比较在实际应用中，直接法和间接法各自有其适用的范围。
直接法适用于对抗原或抗体的确定性检测需求较高的情况，例如对细胞表面抗原的检测；而间接法适用于对抗原或抗体的放大检测需求较高的情况，例如对低表达抗原的检测。
在选择具体方法时，应根据实际实验目的和样本特点来进行综合考量，以确保获得可靠和准确的实验结果。
免疫组织化学直接法和间接法各有其优缺点，科学家在具体选择使用时应结合实验目的，灵活运用，以达到最佳的实验效果和结果。
希望本文能为相关科研工作提供一定的参考价值。
elisa原理
elisa原理Elisa（酶联免疫吸附实验）是一种常用于检测特定抗原或抗体的实验方法。
它基于酶与抗原抗体相互作用的特性，通过检测酶的活性来间接测定待测物质的存在与数量。
Elisa的原理可以分为间接法、直接法和间接夹心法。
以下是介绍这些方法的详细原理：1. 间接法：该方法用于检测抗原。
首先，在试验板上涂布含有待测抗原的物质。
然后加入与该抗原特异性反应的抗体。
这些抗体通常与酶（如辣根过氧化物酶）结合在一起。
随后，加入试液，其中包含检测样本中的抗体。
样本中的抗体与已有的抗原结合，形成抗原-抗体-酶复合物。
接下来，通过加入底物，酶的活性导致底物发生化学反应，生成可检测的产物。
产物的浓度与样本中的抗体浓度成正比，从而可以确定待测样本中的抗体含量。
2. 直接法：该方法用于检测抗体。
首先，在试验板上涂布已知抗原。
然后加入待测样本，其中的抗体将与试板上的抗原结合形成抗原-抗体复合物。
接下来，加入与该抗体特异性反应的酶标记二抗。
酶标记二抗与抗原-抗体复合物结合，形成双重复合物。
通过加入底物，酶的活性导致底物发生化学反应，生成可检测的产物。
产物的浓度与待测样本中的抗体浓度成正比。
3. 间接夹心法：该方法既可以用于检测抗原，也可以用于检测抗体。
首先，在试验板上涂布已知抗原。
然后加入待测样本，其中特异的抗体与试板上的抗原结合。
接下来，加入与该抗体特异性反应的酶标记二抗，形成抗原-抗体-酶标记二抗复合物。
随后，加入另一抗体（通常是与酶标记二抗相反的抗体）来结合酶标记二抗的未结合部分，形成夹心型复合物。
最后，通过加入底物，酶的活性导致底物发生化学反应，生成可检测的产物。
产物的浓度与待测样本中的抗原/抗体浓度成正比。
Elisa方法因其灵敏度高、特异性好、操作简单等优点而被广泛应用于医学、生物学和生物化学等领域，用于疾病的诊断、检测生物标志物、药物研发等。
ELISA检测方法有哪些
ELISA检测方法有哪些？酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是研究蛋白抗体的重要方法。
它是采用抗原与抗体的特异结合将被测物质与酶标抗体进行直接或间接结合，然后通过标记酶与底物产生颜色反应进行定性和定量分析。
那么，它与其它检测方法的灵敏度ELISA通常分为四种类型：直接法、间接法、竞争法、夹心法等，直接上图：直接法（Direct ELISA）仅需要抗原和酶标一抗，操作简便，可避免交叉反应，然而该方法要求酶标一抗有较高的特异性要求，同时也并非所有的一抗适合标记处理。
直接法在实际运用中并不多见，它并不能对样本中抗体进行定量分析，因为样本中抗体是非酶标抗体，无法进行后续显色，但是该法经过改进就是竞争性ELISA方法，见后文。
间接法（Indirect ELISA）使用了二抗增加信号强度，也使抗体的选择多样化，然而间接法容易产生交叉反应。
间接法只能用于测定抗体，主要用于疾病的诊断，其优点是只需要改变包被抗原，酶标抗体是通用的。
夹心法（Sandwich ELISA）分为双抗体夹心法和双抗原夹心法：双抗体夹心法中抗原被两个抗体——捕捉抗体和检测抗体，结合于不同位点。
捕捉抗体固定于载体上，检测抗体通过结合抗原进行显色分析。
应用于双抗体夹心法检测的抗体需是单抗，而且对同一抗原结合位点不同，如此才能避免交叉反应或两种抗体竞争性结合同一位点。
夹心法具有高灵敏度、高专一性的优势，但该法只适用于有多个结合位点的抗原检测，主要用于检测各种大分子抗原——例如在医学检测中测定HBsAg、HBeAg、AFP 等。
由于双抗体夹心法特异性高，在检测过程中有时会将样本和酶标抗体同时加入进行反应（一步法），此时如果样本中抗原含量过高会导致其与固相抗体和酶标抗体均有结合而不形成“夹心复合物”，此时测出的结果将低于实际含量甚至是阴性结果（钩状效应hook ffect）。
因此，如果使用一步法测定样本中抗原含量时要注意测量的线性范围，另外使用高亲和力的单抗也可削弱钩状效应。
(完整word版)ELISA直接法与间接法的区别
ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体.在这种测定方法中有三个必要的试剂1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);(3)酶反应的底物.根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不类型的检测方法.ELISA可分类是根据抗原抗体的结合情况来分类的。
主要有以下几种类型:（直接法也称一步法）1 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质.2) 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质.3) 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关.4) 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测.在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见 1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应.假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题.双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。
间接法elisa原理
间接法elisa原理一、ELISA概述酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的免疫学检测方法。
它通过抗原与抗体的特异性结合，利用酶标记技术检测样品中特定成分的含量或活性。
ELISA方法具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，已经广泛应用于医学诊断、生物制药和环境监测等领域。
二、ELISA分类根据检测目标和检测原理的不同，ELISA可以分为直接法和间接法两种。
1. 直接法直接法是将酶标记的抗体直接与待检样品中的抗原结合，形成固相复合物。
然后通过底物反应产生显色信号来检测样品中抗原的含量或活性。
直接法操作简单，但灵敏度较低。
2. 间接法间接法是将待检样品中的抗原先与已知特异性的未标记抗体结合，形成固相复合物。
然后再加入酶标记的二抗进行反应，形成新的复合物。
最后通过底物反应产生显色信号来检测样品中抗原的含量或活性。
间接法灵敏度高，但操作复杂。
三、间接法ELISA原理1. 原理概述间接法ELISA是一种常用的免疫学检测方法。
它通过将待检样品中的抗原先与已知特异性的未标记抗体结合，形成固相复合物。
然后再加入酶标记的二抗进行反应，形成新的复合物。
最后通过底物反应产生显色信号来检测样品中抗原的含量或活性。
2. 实验步骤（1）制备固相载体：将特定抗体固定在微孔板上，形成固相载体。
（2）加入待检样品：将待检样品加入微孔板，并与固相载体中的特异性抗体结合。
（3）加入酶标记二抗：加入酶标记二抗与待检样品中的特异性抗体结合，形成新的复合物。
（4）加入底物：加入底物与酶标记反应产生显色信号。
（5）读取结果：通过光谱仪等设备读取显色信号强度，根据标准曲线计算出待检样品中目标分子的含量或活性。
3. 优缺点间接法ELISA方法具有以下优缺点：（1）优点：灵敏度高，特异性好，适用于各种样品类型和检测目标。
（2）缺点：操作复杂，需要较长时间进行实验，容易出现假阳性或假阴性结果。
酶标仪工作原理
酶标仪工作原理一、引言酶标仪（ELISA）是一种常用的实验技术，用于检测和测定样品中特定分子的存在和浓度。
它的工作原理基于酶的催化作用和免疫学原理，具有高灵敏度和高特异性的特点。
本文将介绍酶标仪的工作原理，包括直接法、间接法、竞争法和间接酶标法。
二、酶标仪的基本原理酶标仪的基本原理是利用酶作为信号放大器，将检测目标物与酶标记的抗体或抗原结合，通过酶的催化作用产生可定量测量的信号。
通常，酶标仪使用底物和显色剂来测量酶的活性或产生的产物，并将其与目标物的浓度相关联。
三、直接法直接法是酶标仪中最简单的方法之一。
它利用酶标记的抗体直接与目标物结合。
首先，在酶标板的孔中涂覆待测物质，然后加入酶标记的抗体。
如果目标物存在，酶标记的抗体将与其结合。
接下来，通过加入底物和显色剂，测量酶的催化反应产生的颜色强度。
颜色的强度与目标物的浓度成正比。
四、间接法间接法是酶标仪中最常用的方法之一。
它利用酶标记的二抗与目标物结合。
首先，在酶标板的孔中涂覆待测物质，然后加入一抗。
一抗与目标物结合后，再加入酶标记的二抗。
二抗与一抗结合形成免疫复合物。
最后，通过加入底物和显色剂，测量酶的催化反应产生的颜色强度。
颜色的强度与目标物的浓度成正比。
五、竞争法竞争法是酶标仪中用于测定抗原或抗体浓度的常用方法。
首先，在酶标板的孔中涂覆固定浓度的抗原或抗体，然后加入酶标记的抗原或抗体样品。
如果样品中含有目标物，它将竞争性地与固定在酶标板上的抗原或抗体结合。
接下来，通过加入底物和显色剂，测量酶的催化反应产生的颜色强度。
颜色的强度与目标物的浓度成反比。
六、间接酶标法间接酶标法是酶标仪中用于检测抗体的常用方法。
首先，在酶标板的孔中涂覆待测物质，然后加入抗原。
抗原与待测物质结合后，再加入酶标记的抗体。
酶标记的抗体与抗原结合形成免疫复合物。
最后，通过加入底物和显色剂，测量酶的催化反应产生的颜色强度。
颜色的强度与待测物质的浓度成正比。
七、总结酶标仪是一种常用的实验技术，通过利用酶的催化作用和免疫学原理，可以检测和测定样品中特定分子的存在和浓度。
elisa常用方法及其原理
elisa常用方法及其原理Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验方法，广泛应用于生物学和医学研究中。
本文将介绍Elisa的常用方法及其原理。
一、Elisa的基本原理Elisa是一种通过检测抗原-抗体反应来测定物质浓度的方法。
其基本原理是将待测物质（抗原或抗体）固定在固相载体上，然后加入特异性的酶标记二抗，通过酶标记物的催化作用，将待测物质与酶底物反应产生可测定的信号。
Elisa可以根据待测物质的特异性与酶标记物的催化作用来测定物质的浓度。
二、Elisa的常用方法1.直接Elisa法：将待测抗原直接固定在固相载体上，然后加入酶标记的第一抗体，通过酶标记物的催化作用来测定抗原的浓度。
这种方法简单快速，适用于抗原浓度较高的情况。
2.间接Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的第一抗体，再加入酶标记的第二抗体，通过酶标记物的催化作用来测定抗原的浓度。
这种方法灵敏度较高，适用于抗原浓度较低的情况。
3.竞争Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的酶标记抗体和待测样品，通过抗原与酶标记抗体的竞争来测定抗原的浓度。
这种方法可以测定抗原和抗体的亲和力，适用于测定抗原或抗体的亲和力常数。
4.间接竞争Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的第一抗体，再加入酶标记的第二抗体和待测样品，通过第一抗体与第二抗体的竞争来测定抗原的浓度。
这种方法可以测定抗原和抗体的亲和力，适用于测定抗原或抗体的亲和力常数。
三、Elisa的操作步骤1.涂覆：将待测物质（抗原或抗体）溶液加入固相载体上，使其吸附固定在载体表面。
2.阻断：加入适当的阻断剂，防止非特异性结合。
3.第一抗体反应：加入特异性的第一抗体，使其与待测物质发生特异性结合。
4.洗涤：用洗涤缓冲液洗去未结合的抗体。
5.酶标记抗体反应：加入酶标记的第二抗体，使其与第一抗体结合。
6.洗涤：用洗涤缓冲液洗去未结合的酶标记抗体。
ELISA_直接法与间接法的区别
ELISA_直接法与间接法的区别ELISA 可用于测定抗原 , 也可用于测定抗体 . 在这种测定方法中有三个必要的试剂1) 固相的抗菌素原或抗体，即”免疫吸附剂"(immunosorbent);(2) 酶标记的抗原或抗体，称为”结合物"(conjugate);(3) 酶反应的底物 . 根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件, 可设计出各种不类型的检测方法 .ELISA 可分类是根据抗原抗体的结合情况来分类的。
主要有以下几种类型 : (直接法也称一步法)1 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法 , 操作步骤如下 :1) 将特异性抗体与固相载体联结 , 形成固相抗体 . 洗涤除去未结合的抗体及杂质 .2) 加受检标本 , 保温反应 .标本中的抗原与固相抗体结合 , 形成固相抗原抗体复合物 .洗涤除去其他未结合物质 .3) 加酶标抗体 , 保温反应 .固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合 . 彻底洗涤未结合的酶标抗体. 此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关.4) 加底物显色 . 固相上的酶催化底物成为有色产物 . 通过比色 , 测知标本中抗原的量 . 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体 , 就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法 . 如抗体的来源为抗血清 , 包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物. 如应用单克隆抗体 , 一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗 , 分别用于包被固相载体和制备酶结合物 . 这种双位点夹心法具有很高的特异性 , 而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应 , 作一步检测 .在一步法测定中 , 当标本中受检抗原的含量很高时 , 过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合 , 而不再形成 "夹心复合物 ". 类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象 , 此时反应后显色的吸光值 (位于抗原过剩带上 ) 与标准曲线 ( 位于抗体过剩带上 ) 某一抗原浓度的吸光值相同( 参见 1.3.2, 图 1-4), 如按常法测读 , 所得结果将低于实际的含量 , 这种现象被称为钩状效应 (hook effect), 因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落 . 钩状效应严重时 , 反应甚至可不显色而出现假阴性结果 . 因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值 . 用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应.假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg 的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物. 但在HBsAg 的检测中应注意亚型问题 ,HBsAg 有adr,adw,ayr,ayw4 个亚型 , 虽然每种亚型均有相同的 a 决定簇的反应性 , 这也是用单抗作夹心法应注意的问题 .双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体，多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现岀假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了 Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。
ELISA直接法与间接法的区别
ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体.在这种测定方法中有三个必要的试剂1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunos orbent);(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjuga te);(3)酶反应的底物.根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不类型的检测方法.ELISA可分类是根据抗原抗体的结合情况来分类的。
主要有以下几种类型:（直接法也称一步法）1 双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质.2) 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质.3) 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关.4) 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测.在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见 1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HB sAg,AFP和尿液h CG等)时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应.假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg 有a dr,adw,ayr,ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题.双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物I gG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法E LISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。
备课素材知识点：ELISE的四种类型 高中生物人教版选择性必修1
ELISE的四种类型酶联免疫吸附测定，简称ELISA，是免疫学当中的经典试验，是将可溶性的抗原或者是抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合，进行免疫反应的定性和定量检测方法。
定性检测结果是判断受检标本中是否含有待检测抗原或抗体，做出有或无的简单回答，分别用阴性、阳性表示，阳性表示该标本在该检测系统当中有反应，阴性表示无反应，定量检测操作步骤复杂，影响反应的因素较多。
基本方法有：直接法、间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。
一、直接ELISA原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进行孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要用于测定抗原。
优点：操作流程简短，实验步骤少；无需使用二抗，避免了交叉反应；实验步骤少，操作不易出错。
缺点：实验中的一抗需要直接用酶标记，成本相对较高。
二、间接法ELISA原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标二抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显色。
优点：酶标二抗可加强信号，提高灵敏度；灵活性更大，同一酶标二抗可应用于多种不同的一抗；不直标一抗，可保留更多的免疫反应性；成本更低，使用标记抗体更少。
缺点：交叉反应几率升高。
三、双抗夹心法ELISA原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。
将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。
洗涤除去未结合的抗体及杂质。
加入待检样品，保温孵育。
样品中的特异性抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
加酶标抗体（检测抗体）保温孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
加底物反应。
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ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体.在这种测定方法中有三个必要的试剂1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);(3)酶反应的底物.根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不类型的检测方法.
ELISA可分类是根据抗原抗体的结合情况来分类的。
主要有以下几种类型:（直接法也称一步法）
1 双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:
1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质.
2) 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质.
3) 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关.
4) 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测.
在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见 1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应.
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题.
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心.
2 双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似.用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体.与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法.乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法.本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法.
3 间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的方法.其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固
相抗原结合的受检抗体,故称为间接法(见图2-3).操作步骤如下:
1)将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原.洗涤除去未结合的抗原及杂质.2)加稀释的受检血清,保温反应.血清中的特异抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗体复合物.经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体,血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去.
3)加酶标抗抗体.可用酶标抗人Ig以检测总抗体,但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体.固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合,从而间接地标记上酶.洗涤后,固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关.
4)加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断.间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法.间接法成功的关键在于抗原的纯度.虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果,但应尽可能予以纯化,以提高试验的特异性.特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质,例如以E.Coli为工程酶的重组抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应.抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质,例如来自人血浆或人体组织的抗原,如不将其中的Ig去除,试验中也发生假阳性反应.另外如抗原中含有无关蛋白,也会因竟争吸附而影响包被效果.
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性.病人血清中受检的特异性IgG 只占总IgG中的一小部分.IgG的吸附性很强,非特异IgG可直接吸附到固相载体上,有时也可吸附到包被抗原的表面.因此在间接法中,抗原包被后一般用无关蛋白质(例如牛血清蛋白)再包被一次,以封闭(blocking)固相上的空余间隙.另外,在检测过程中标本须先行稀释(1:40~1:200),以避免过高的阴性本底影响结果的判断.。