ELISA检测乙肝抗体HBsAb
电化学发光法和ELISA法检测HBsAb的结果分析_赵秀丽
·医学检验·2012年10月第19卷第28期乙型肝炎（hepatitis B，简称乙肝）是一种严重危害人类健康、传播广泛的病毒传染性疾病，据世界卫生组织报道，全球约有20亿人感染乙型肝炎病毒，每年有超过60万人死于乙型肝炎病毒所致肝硬化或肝癌[1]。
乙型肝炎病毒侵入人体后，刺激人体免疫系统中的B淋巴细胞分泌出一种特异的免疫球蛋白G，也就是常说的乙型肝炎病毒表面抗体（HB-sAb），它可以与表面抗原特异地结合，与人体的其他免疫功能共同作用消除掉病毒，保护人体不再受HBV的感染[2]。
所以，乙型肝炎表面抗体（HBsAb）是一种中和抗体，具有保护作用，它的检测是判断疫苗接种效果的重要指标[3]。
目前，乙型肝炎表面抗体的检测主要还依赖于酶联免疫吸附试验（ELISA）来判断是否阳性，并不能说明HBsAb是否能达到对机体的保护作用。
电化学发光法（ECLIA）作为一种新型标记免疫分析技术，在临床工作中也得到了越来越广泛的应用。
笔者2011年8～11月对本院536例HBsAb阳性的标本分别使用电化学发光法和ELISA方法进行检测，并对检测结果进行分析比较。
1材料与方法1.1标本来源选取沈阳医学院奉天医院2011年8～11月门诊和住院患者HBsAb为阳性的血液标本536份。
1.2仪器及试剂ECLIA采用Roche E170型全自动电化学发光免疫分析仪，HBsAb试剂盒、校准品、质控品均由Roche公司提供。
严格按照仪器和试剂说明书进行校准、质控、检测等操作。
ELISA法采用上海科华HBsAb试剂盒检测，实验仪器为安图酶标仪和洗板机。
所有试剂均在有效期内使用。
1.3阳性标准ECLIA法≥10IU/L为阳性；ELISA法按照说明书确定临界值：为2.1×阴性对照（阴性对照<0.05按0.05计算），每次标本测定值（S/CO）≥临界值为阳性。
1.4统计学处理数据采用SPSS11.0软件进行四格表分析。
乙肝五项
李成静
乙肝五项（酶联免疫法ELISA)
两对半：
表面抗原HBsAg ① 表面抗体HBsAb ② e抗原HBeAg ③ e抗体HBeAb ④ 核心抗体HBcAb ⑤
检验原理
表面抗原HBsAg 表面抗体HBsAb e抗原HBeAg e抗体HBeAb 核心抗体HBcAb
夹心法
竞争法
双抗体夹心法
乙肝表面抗原检验原理
采用抗体包被反应板，加入待测样本， 经孵育后，加入酶标抗体，当样本中存 在抗原时，该抗原与包被抗体结合并与 酶标抗体结合形成抗体抗原酶标抗体复 合物，加入底物产生显色反应，反之则 无显色反应。
乙肝e抗体检验原理（竞争法）
采用抗原包被反应板，加入待测样本， 同时加入酶标抗体，与抗原形成竞争结 合，如待测样本中抗体含量高，则酶标 抗体与抗原结合少，加入底物时显色淡， 反之显色深。
检验方法
表面抗原（两步法）
1.配置洗液（25倍稀释）。 2.根据标本数排板，多加两孔作为阳性对照。 3.加75ul待测样本和阳性对照于反应孔中。 4.封板，置37℃加速仪温育40min。 5.取出反应板，不洗，每孔各加酶50ul（即一滴）。 6.封板置37℃加速仪温育20min。 7.取出反应板，洗液洗5次，清水冲洗，吸水纸上拍干。 8.每孔各加显色液A和B各一滴，混匀。 9.显色蓝色为阳性，无色为阴性。
谢谢Βιβλιοθήκη 后四项（一步法）1.根据标本数排板，加阳性对照一孔。 2.加入血清50ul和阳性对照于反应孔中，加酶一 滴。 3.封板，加速仪温育20min。 4.取出反应板，用洗液洗5次，清水冲洗，板拍 干。 5.每孔各加显色液A和B各一滴，混匀。
小鼠乙肝表面抗体(HBsAb)酶联免疫分析(ELISA)
小鼠乙肝表面抗体（HBsAb）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中乙肝表面抗体（HBsAb）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中小鼠乙肝表面抗体（HBsAb）水平。
用纯化的小鼠乙肝表面抗体（HBsAb）抗原包被微孔板，制成固相抗体，往包被抗原的微孔中依次加入乙肝表面抗体（HBsAb），再与HRP标记的乙肝表面抗体（HBsAb）抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的乙肝表面抗体（HBsAb）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠乙肝表面抗体（HBsAb）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：90IU/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
CLIA和ELISA检测血清HBsAg及HBsAb的结果比较
CLIA和ELISA检测血清HBsAg及HBsAb的结果比较许文;邝琳;张振林【摘要】目的：比较化学发光免疫分析(CLIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清HBsAg及HBsAb的结果。
方法采用CLIA法和ELISA法测定定值血清中的HBsAg和HBsAb，并对两种结果进行比较和分析。
结果测定HBsAg时，ELISA法的批内CV：1IU/ml为9.6%，2IU/ml为7.3%，批间CV：1IU /ml为17.8%，2IU/ml为15.1%，灵敏度为0.25IU/ml，CLIA法的批内CV：1IU/ml为2.33%，2IU /ml为1.07%，批间CV：1IU /ml为6.57%，2IU/ml为3.78%，灵敏度为0.063IU/ml。
HBsAb测定时，ELISA法的批内CV：10mIU/ml为11.8%，20mIU/ml为8.7%，批间CV：10mIU/ml为18.6%，20mIU/ml为15.9%，灵敏度为10mIU/ml，CLIA法的批内CV：10mIU/ml为4.79%，20mIU/ml为3.52%，批间CV：10mIU/ml为7.58%，20mIU/ml为6.13%，灵敏度为2.5mIU/ml。
结论 ELISA法敏感度相对低，精密度差；CLIA法灵敏度高，精密度好，且自动化程度高，检测更快速，更适合于临床。
【期刊名称】《现代诊断与治疗》【年(卷),期】2014(000)007【总页数】2页(P1467-1468)【关键词】乙肝表面抗原;乙肝表面抗体;酶联免疫吸附试验;化学发光免疫分析【作者】许文;邝琳;张振林【作者单位】珠海市人民医院检验科，广东珠海519000;珠海市人民医院检验科，广东珠海 519000;珠海市人民医院检验科，广东珠海 519000【正文语种】中文【中图分类】R446.1目前，我国大多数医院采用ELISA法检测血清HBsAb和HBsAg，该法虽简便，但ELISA法重复性差，灵敏度低，且当标本中的HBsAg浓度太低时，因灵敏度低而出现假阴性，容易造成漏检，当浓度过高时会因钩状效应(Hook effect)出现假阴性，因此正有逐步被新方法所取代的趋势。
电化学发光免疫法和酶联免疫法检测乙肝病毒标志物结果准确性的比较
电化学发光免疫法和酶联免疫法检测乙肝病毒标志物结果准确性的比较目的分析比较电化学发光免疫法（ECLIA）和酶联免疫法（ELISA）检测乙型病毒性肝炎（HBV）标志物检测结果的准确性。
方法选取2015年1月～2017年1月在我院就诊的160例乙型肝炎患者，随机分为观察组（80例）和对照组（80例）。
观察组使用ECLIA法，对照组使用ELISA法，比较两组的HBV 标志物阳性率，再在观察组中选取HBsAg/Ab和（或）HBeAg/Ab双阳性的患者，采用ELISA法检测，观察其检测结果。
结果观察组的HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb阳性率分别为100.0%、52.5%、76.3%、78.8%，均高于对照组的92.5%、45.2%、52.5%、50.0%，差异有统计学意义（P＜0.05）；ECLIA法对s和（或）e系统双阳性的患者检出76例，相比之下，ELISA法只检出9例。
结论ECLIA 法检测乙肝病毒感染的结果较ELISA法更准确，值得临床推广应用。
[Abstract]Objective To analyze and compare the accuracy of electrochemiluminescence immunoassay （ECLIA）and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）in the detection of hepatitis B virus （HBV）markers.Methods 160 patients with HBV treated in our hospital from January 2015 and January 2017 were selected as research targets，and were randomly divided into the observation group （n=80）and the control group （n=80）.The observation group was given ECLIA and the control group was given ELISA，the positive rates of HBV markers were compared between the two groups.Then in the observation group，HBsAg/Ab and/or HBeAg/Ab double positive patients were selected and detected by ELISA method，and the results were observed.Results The positive rates of HBsAg，HBsAb，HBeAg and HBeAb in the observation group were 100.0%，52.5%，76.3% and 78.8% respectively，which was higher than 92.5%，45.2%，52.5%，50.0% in the control group，with significant difference （P＜0.05）.The number of patients with the s and/or e system double positive detection results by the method of ECLIA were 76 cases，but the number by the method of ELISA were comparatively 9 cases.Conclusion Compared with ELISA，ECLIA is more accurate in the detection of HBV infection，therefore，it is worthy of wide clinical promotion and application.[Key words]Electrochemiluminescence immunoassay；Enzyme-linked immunosorbent assay；Hepatitis B virus我國的乙型肝炎发病率较高，约有12%为平时无自觉症状的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）携带者[1]，乙肝感染者如不及时治疗，可发展为肝炎、肝硬化、肝癌等重大疾病[2]，因而准确地诊断乙肝病毒（HBV）标志物，选取敏感度和特异度高的检测方法，对及时防治乙肝有着重要的意义。
电化学发光法和ELISA法检测HBsAb的结果分析
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电化学发光法和ELISA法检测HBsAb的结果分析
作者：赵秀丽
来源：《中国当代医药》2012年第28期
[摘要] 目的探讨电化学发光法（ECLIA）和酶联免疫吸附实验法（ELISA）检测乙肝表面抗体的结果差异。
方法选取沈阳医学院奉天医院2011年8～11月门诊和住院部送检的HBsAb为阳性的血液标本536份，分别进行ECLIA法和ELISA法进行检测，并对结果进行分析。
结果 ECLIA检测HBsAb在10～50 IU/L时，ELISA的阳性率只有6.62%，说明ELISA方法的灵敏度不如电化学发光法高。
与电化学发光法比较，ELISA方法的敏感性为41.24%，特异性为98.04%，符合率为46.64%，阳性预测值为99.50%，阴性预测值为12.99%。
结论在临床常规检测标本中，电化学发光法和ELISA法检测结果相似，但电化学发光法的灵敏度高于ELISA法。
电化学发光法检测HBsAb对乙肝疫苗接种是否成功是非常有意义的。
[关键词] 电化学发光法；酶联免疫吸附实验法；HBsAb；灵敏度。
elisa检测hbsab实验报告
elisa检测hbsab实验报告ELISA 检测 HBsAb 实验报告一、实验目的本实验旨在通过酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测血清中乙型肝炎表面抗体（HBsAb）的水平，以评估个体对乙型肝炎病毒（HBV）的免疫状态。
二、实验原理ELISA 是一种基于抗原抗体特异性结合反应的免疫测定技术。
在本实验中，将纯化的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）包被在微孔板上，形成固相抗原。
待检血清中的 HBsAb 与固相抗原结合后，加入酶标记的抗人免疫球蛋白（通常为辣根过氧化物酶标记的抗人 IgG），形成抗原抗体酶标抗体复合物。
通过加入底物显色，根据显色的强度来定量测定血清中 HBsAb 的含量。
三、实验材料与设备1、试剂HBsAg 包被微孔板样品稀释液酶标记的抗人 IgG 试剂显色剂 A、B 液终止液阳性对照血清阴性对照血清洗涤液2、仪器设备酶标仪移液器恒温箱离心机四、实验步骤1、样本采集与处理采集受检者空腹静脉血 3-5ml，室温静置 30 分钟后，以 3000rpm 离心 10 分钟，分离血清。
将血清样本用样品稀释液按一定比例稀释。
2、加样分别在微孔板的相应孔中加入稀释后的血清样本、阳性对照血清、阴性对照血清，每孔100μl。
3、温育将微孔板放入 37℃恒温箱中孵育 30 分钟。
4、洗涤取出微孔板，甩掉孔内液体，用洗涤液洗涤5 次，每次浸泡30 秒，然后甩干。
5、加酶标抗体每孔加入100μl 酶标记的抗人 IgG 试剂。
6、温育再次将微孔板放入 37℃恒温箱中孵育 30 分钟。
7、洗涤重复洗涤步骤。
8、显色每孔加入显色剂 A、B 液各50μl，轻轻振荡混匀，室温避光孵育15 分钟。
9、终止反应每孔加入50μl 终止液，终止显色反应。
10、测定吸光度使用酶标仪在 450nm 波长处测定各孔的吸光度（OD 值）。
五、结果判断1、阳性判断值（cutoff 值）的确定计算阴性对照孔的平均 OD 值（NC）和阳性对照孔的平均 OD 值（PC）。
ELISA、GICT及CLIA检测乙肝病毒标志物的效果比较
ELISA、GICT及CLIA检测乙肝病毒标志物的效果比较袁梦【期刊名称】《临床医学研究与实践》【年(卷),期】2022(7)14【摘要】目的比较酶联免疫法(ELISA)、免疫胶体金技术(GICT)及电化学发光免疫分析法(CLIA)检测乙肝病毒标志物的效果。
方法选取2018年7月至2020年7月我院收治的200例疑似乙肝患者作为研究对象,分析ELISA、GICT及CLIA对乙肝病毒标志物的检测阳性率。
以病理诊断为金标准,比较ELISA、GICT及CLIA对HBsAg的诊断效能。
结果CLIA对HBcAb、HBeAb、HBeAg、HBsAb、HBsAg 的检测阳性率最高,其次为ELISA、GICT。
以病理诊断为金标准,ELISA、GICT及CLIA对HBsAg的诊断灵敏度分别为79.41%、63.73%、97.06%,特异度分别为86.73%、80.61%、96.94%,准确度分别为83.00%、72.00%、97.00%。
CLIA对HBsAg的诊断灵敏度、特异度、准确度高于ELISA、GICT,差异具有统计学意义(P<0.05)。
结论CLIA对乙肝病毒标志物的检测阳性率高于ELISA、GICT,CLIA对HBsAg的诊断灵敏度、特异度、准确度高于ELISA、GICT。
【总页数】3页(P103-105)【作者】袁梦【作者单位】徐州医科大学【正文语种】中文【中图分类】R512.6【相关文献】1.化学发光与ELISA法检测乙肝病毒血清学标志物的方法学比较分析2.CLIA和ELISA检测乙肝病毒感染血清标志物的效果探讨3.荧光定量PCR法检测乙肝病毒DNA和ELISA法检测乙肝病毒标志物的临床价值4.CLIA法和ELISA法在乙型肝炎病毒血清学标志物检测中的应用价值比较5.荧光定量PCR与ELISA检测乙肝病毒标志物的临床应用比较因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
1.2乙肝表面抗体检测操作规程1
乙型肝炎病毒表面抗体检测（ELISA）1原理在微孔板上预包被被纯化的乙肝表面抗原（HbsAg），配以酶标记抗体（HbsAg-HRP）及TMB等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗体（HBsAb）。
2试剂：2.1试剂名称：乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）2.2试剂生产厂家：英科新创（厦门）科技有限公司2.3包装规格：96Test/Kit2.4试剂盒组成：HbsAg预包被微孔板（包被HbsAg），HbsAb酶标抗体（含HRP标记HbsAg）, HbsAb阳性对照（含HbsAbde 阳性血清），HbsAb阴性对照血清（正常人血清），浓缩洗涤液（PBS-T缓冲液），底物A（含H2O2），底物B（含TMB），终止液（含2M H2SO4），封板膜，自封袋，说明书。
2.5试剂储存条件及有效期：2~8℃避光保存，有效12个月。
3样本采集：取静脉血3-4ml于干净容器中分离出血清或血浆标本，如不及时测定可置于4℃冰箱保存，如长期保存需置于-15至-20℃冻存，并避免样本反复冻融。
高脂血、高胆红素及溶血样本可能会影响试验结果的准确性，建议不使用。
4所需仪器4.1全自动酶免分析仪4.2新鲜蒸馏水或去离子水4.3酶标仪（单波长450nm或双波长450nm/630nm）4.4微量移液器4.5 37℃恒温箱或水浴箱4.6洗板机或洗瓶5检验方法5.1平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18~25℃），微孔板板开封后，余者即时以自封袋封存。
5.2配液：浓缩洗涤液配置前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水去离子水按1：19稀释后使用。
5.3编号：取所需数量微孔条固定于支架，按序编号。
5.4加样：分别在相应孔中加入50ul阴、阳性对照血清或待测样本。
5.5加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50ul；轻拍混匀。
5.6温育：置37℃温育25min。
5.7洗涤：用洗涤液充分洗涤5次、洗涤后扣干（每次应保持30~60s的浸泡时间）。
电化学发光法和ELISA法检测HBsAb的结果分析
ＥＬ Ｉ ｗａ ｉｈ ｒｔ ａ ｈ ｔｏ １ Ａ．Ｃ ｍｐ ｒ ｄ ｔ Ｌ Ａ，ｔ ｅ ａ ｃ ｒｃ ，ｓ ｅ ｉ ｃｔ，ａ ｃ ｒ ａ ｃ ａｅ ｏｉｉｅ ｐ ｅ ｉ ｖ Ｃ Ａ ｓｈ ｇ ｅ ｈ ｎ ｔａ ｆＥＬ Ｓ ｏ ａ ｅ ｏ ＥＣ Ｉ ｈ ｃ ｕ ａ ｙ ｐ ｃｆ ｉ ｉ ｙ ｃ ｏｄ ｎ ｅ ｒｔ，ｐ ｓｔ ｒｄ ｔ ｅ ｖ ｉ
［ 中图分 类 号】 ４ ６６ Ｒ ４ ．
【 文献 标பைடு நூலகம் 码】 Ａ
【 章编 号】 ６ ４ ４ ２ （ ０ ２）０（ 一 ０ ４ ０ 文 １ ７ — ７ １ ２ １ １ ａ） ０ ９ — ２
Ｃｏ ｐ ｒｓ ｎ ｏ ｅ ｕ ｔ ｆＨＢｓ ｅ ｅ ｔ ｄ ｂ ｍ ａ ｉｏ ｆｒ ｓ ｌｓｏ Ａｂ ｄ ｔ ｃ ｅ ｙ ＥＣＬＩ ａ ｄ ＥＬＩ Ａ Ａ ｎ Ｓ
取沈 阳 医学 院奉 天医 院 ２ １ ０ １年 ８ １ 门诊 和住 院部 送检 的 Ｈ ｓ ｂ为 阳性 的血 液标 本 ５ ６份 ， 别 进行 Ｅ ＬＡ 法 ～ １月 ＢＡ ３ 分 ＣＩ 和 Ｅ ＩＡ法 进 行 检 测 ，并 对 结 果 进 行 分 析 。 结 果 Ｅ ＬＡ 检 测 ＨＢ Ａ ＬＳ ＣＩ ｓ ｂ在 ｌ ～ ０ Ｉ ， ０ ５ Ｕ Ｌ时 ， Ｌ Ｓ 的 阳性 率 只 有 Ｅ ＩＡ ６６ ％ ， 明 Ｅ ＩＡ方法 的 灵敏 度 不如 电化学 发光法 高 。与电 化学 发 光法 比较 ， ＬＳ ． ２ 说 ＬＳ Ｅ ＩＡ方 法 的敏感 性 为 ４ ．４ 特 异 １ ％， ２ 性 为 ９ ．４ ， 合 率为 ４ ． ％， ８０ ％ 符 ６６ ４ 阳性 预测 值 为 ９ ．０ 阴性 预 测值 为 １ ． ％。 结论 在 临 床常 规检 测 标本 中 ， ９５ ％， ２９ ９ 电化
ELISA法检测血清中乙肝病毒表面抗体虚拟实验笔记
ELISA法检测血清中乙肝病毒表面抗体虚拟实验笔记
（实验主编：杨健，川北医学院）
实验一：肘静脉采血与分离血清
实验原理：带受试者完成三针乙肝疫苗免疫接种两个月后，对其进行肘静脉采血，将血液样本静置后离心分离血清用于检测乙肝病毒表面抗体，以判断乙肝疫苗的免疫效果
实验相关设备介绍：器材和试剂
采血针，压脉带，真空采血管，离心机，1000ul移液器，天平，-20℃冰箱，2ml离心管，恒温培养箱，无菌棉签，75%酒精，碘酒，采血垫
实验操作：
点击采血垫→压脉带→握拳→碘酒→酒精→采血针→真空采血管→压脉带→无菌棉签→培养箱→离心机→签字笔→移液枪→冰箱
实验二ELISA法检测血清乙肝病毒表面抗体
实验操作
血清样本→HBsAb阳性对照血清→HBsAb阴性对照血清→HBsAb酶标记抗原
酶标抗原添加1-5孔（左到右）→封口膜→培养箱→酶标板（每孔加入300ul洗涤液，轻晃酶标板1min，弃去，在吸水纸上拍杆，如此重复共洗涤5次）
点击洗涤液→加入1-6孔→酶标板晃动→吸水纸→底物A(1-6孔）
底物B→晃动标板→封口膜→终止液→晃动酶标板→酶标仪。
1.1乙肝表面抗原检测操作规程
乙型肝炎病毒表面抗原检测（ELISA）1原理：在微孔板上预包被被纯化的乙肝表面抗体（HBsAb），配以酶标记抗体（HbsAb-HRP）及TMB等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗原（HBsAg）。
2试剂：2.1试剂名称：乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法）2.2试剂生产厂家：英科新创（厦门）科技有限公司2.3包装规格：96Test/Kit2.4试剂盒组成：HbsAb预包被微孔板（包被HbsAb），HbsAg 酶标抗体（含HRP标记HbsAb）, HbsAg阳性对照（含基因工程HbsAg），HbsAg阴性对照（正常人血清），HbsAg样品稀释液（含BSA缓冲液），浓缩洗涤液（PBS-T缓冲液），底物A（含H2O2），底物B（含TMB），终止液（含H2SO4），封板膜，自封袋，说明书。
2.5试剂储存条件及有效期：2~8℃避光保存，有效12个月。
3样本采集：取静脉血3-4ml于干净容器中分离出血清或血浆标本，如不及时测定可置于4℃冰箱保存，如长期保存需置于-15至-20℃冻存，并避免样本反复冻融。
高脂血、高胆红素及溶血样本可能会影响试验结果的准确性，建议不使用。
4所需仪器4.1全自动酶免分析仪4.2新鲜蒸馏水或去离子水4.3酶标仪（单波长450nm或双波长450nm/630nm）4.4微量移液器4.5 37℃恒温箱或水浴箱4.6洗板机或洗瓶5检验方法5.1平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18~25℃），微孔板板开封后，余者即时以自封袋封存。
5.2配液：浓缩洗涤液配置前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水去离子水按1：19稀释后使用。
5.3编号：取所需数量微孔条固定于支架，按序编号。
5.4稀释：每孔加入20ul样品稀释液。
5.5加样：分别在相应孔中加入100ul阴、阳性对照血清或待测样本。
5.6温育：置37℃温育60min。
5.7加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50ul。
免疫学实验二 ELISA(双抗夹心法)1
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3
ELISA的测定方法包括：
双抗体夹心法：检测抗原最常用的方法 间接法：检测抗体最常用的方法 竞争法：既可检测抗原，亦可检测抗体 生物素－亲和素系统ELISA法：是在ELISA中引入生物素或亲 和素放大系统，检测极微量的抗原或抗体的方法。
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4
直接法
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间接法
5
大于0.05按实际OD值计算判断值。
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15
注意事项：
1. 试剂及待测标本使用前应平衡至室温，并将试剂混匀， 弃去1～2滴垂直滴加；
2. 严格按照操作程序依次加样，以保证实验结果准确性； 3. 应尽量避免孔中有气泡，以免所测得OD值不准确。
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16
思考题：
1.免疫标记技术有哪些？各有何特点？。 2.ELISA操作过程中应注意哪些问题？
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13
OPD（邻苯二胺）经酶 作用后的显色反应
终
终
止
止
前
前
终
终
止
止
后
TMB四甲基联苯胺经酶作后
用后的显色反应
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14
结果判断：
计算：判断值＝阴性对照平均OD值×2.1 结果判断：待测样品孔OD值大于或等于判断值为阳性；
小于判断值为阴性。 注：阴性对照OD值小于0.05按0.05计算，ppt课件完整6
BAS-ELISA
biotin-avidin-system，生物素-亲和素系统 此法敏感性更高。用于抗原抗体以及DNA、RNA的检测。
酶 生物素
待检标本
底物
5.加底物显色
亲和素
4.加酶标记的亲和素
ELISA检测乙肝抗体HBsAb
间接法
将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原；
加酶标抗体：与固相抗原抗体复合物中的 抗体结合，使该抗体问接地标记上酶；
加受检血清：其特异抗体与抗原结合， 形成固相抗原抗体复合物。
固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。
传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原 就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法 。
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急性感染趋向恢复（小三阳）
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既往感染恢复期
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既往感染恢复期
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既往感染或“窗口期”
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既往感染或接种过疫苗
酶联免疫吸附试验-ELISA
➢ 实验原理
抗原或抗体吸附到固相载体表面后，以及抗原抗体与 酶连接后，仍保持免疫活性和酶活性，当酶遇到相应底物 时，在酶的催化下引起底物水解显色。产物的量与标本中 受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定 性或定量分析。
此法的特异性及灵敏度与荧光及同位素标记相似，但 其方法较以上两者简便，且不需特殊贵重仪器。因此，这 项技术目前正越来越广泛地被应用到医学的各个领域中。
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、 HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体， 就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
竞争法
用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。 以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体表面， 经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和待测抗原的混 合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底 物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知 抗原的量。
乙肝抗体报告单怎么看
乙肝抗体报告单怎么看一、什么是乙肝抗体乙肝抗体是指抗体反应阳性，即人体免疫系统已经对乙型肝炎病毒产生了抵抗力。
乙肝抗体又分为乙肝表面抗体（HBsAb）、乙肝核心抗体（HBcAb）和乙肝e抗体（HBeAb）三种。
二、乙肝抗体的检测方法目前常用的乙肝抗体检测方法有酶联免疫吸附试验法（ELISA）和放射免疫测定法（RIA）等。
在临床上，一般采用ELISA法进行检测。
三、乙肝抗体的阴性、阳性判定1. HBsAbHBsAb阴性表示未感染乙型肝炎病毒或感染时间短，免疫系统未能产生足够的抗体；HBsAb阳性则表示已被免疫系统识别并抵抗了乙型肝炎病毒，是乙肝病毒的免疫保护指标。
在接种乙肝疫苗后，也可以出现HBsAb阳性。
2. HBcAbHBcAb阴性表示未感染乙型肝炎病毒或感染时间短，免疫系统未能产生足够的抗体；HBcAb阳性表示已经感染过乙型肝炎病毒，但不同于HBsAg代表的慢性感染，HBcAb可能只是乙型肝炎病毒短暂存在的痕迹。
3. HBeAbHBeAb阳性表示乙型肝炎病毒已经失去了活性，不能再复制繁殖；HBeAb阴性则表示乙型肝炎病毒仍处于活跃状态，具有传染性。
四、乙肝抗体报告单的解读乙肝抗体报告单通常包括HBsAb、HBcAb和HBeAb三项指标。
一般认为只要HBsAb阳性，即可认为乙肝病毒已经被免疫抗体保护，具有抵抗乙肝病毒的能力。
但需要注意的是，乙肝抗体检测结果仅代表当前时刻的状况，不能完全代表未来的状态。
如果长期生活在乙肝病毒载体者身边，仍需加强防范措施，避免感染。
同时，需定期进行检测，及时发现和治疗乙肝病毒感染。
总之，乙肝抗体报告单的解读需要结合个人情况和临床数据进行综合分析，建议在专业医生指导下进行判定和处理。
两种检测乙肝表面抗体方法的比较
两种检测乙肝表面抗体方法的比较摘要】目的了解两种检测乙型肝炎方法的优缺点，为实验室提供快速、准确的检验方法。
方法先后采用胶体金免疫层析测试条法和做血清学检测乙型肝炎表面抗体，然后，将资料整理、分析。
结果胶体金免疫层析法检出阳性250份, 阳性率为54.82%；ELISA法检出阳性275份，阳性率为60.31%。
两法检测结果的总符合率为94.52%。
以ELISA法为常规法验证胶体金免疫层析法的敏感性，敏感性为90.91%，特异性为100%。
结论胶体金免疫层析法敏感性较酶联免疫法（ELISA）差，认为检测HBsAb仍然以ELISA法为主。
【关键词】乙肝表面抗体胶体金免疫层析酶联免疫法Compare of twodetecting methods forhBsAbGaofeng (JinZhou Railway of Center fordisease Control JinZhon 121000, China) 【Abstract】 Aim To understand relative merits of twodetectinghepatitis B and offer a rapid and accurate method for laboratory. Method Use colloidal gold chromatography test and serologicallydefinedhBsAb, then collate and analyze thedate. Resultdetect 250 positive using the method of colloidal gold chromatography test, positive rate54.82%;detect 275 positive using the method of ELISA, positive rate 60.31%. The general coincidence rate of two methods is 94.52%. The sensitivity of colloidal gold chromatography test is 90.91% and the specificity is 100% using the method of ELISAas the routine method to validate. Conclusion Colloidal gold chromatography test isnot better than ELISA, the method of ELISA should be recognized as the main method ofdetectinghBsAb.【Keywords】 hBsAb colloidal gold chromatography ELISA乙肝表面抗体检测是幼儿体检的必检项目，也是判断抵抗乙型肝炎感染能力的重要指标。
ELISA2-乙肝两对半
4. 5.
6.
显色：先加显色液A50ul，再加入显色液
B50ul，贴上封膜，37℃反应15min(避
光)；
注：显色从加入第一滴显色液B开始计时
7.
8.
终止：加终止液50ul；
判读：终止反应后10min内完成。(450nm 处测定吸光度)
结果判断： COV=0.5×N 阴性对照A ≥0.80 ，阳性对照A ≤0.10 ， 否则实验无效。 S≤COV 阳性 S＞CO在37℃平衡30min；
2.
3.
配洗涤液：按1：20将20×洗液稀释；
加样品及酶标：各50ul，同时设阳性、阴 性（样品作1：30稀释） 孵育：贴上封膜，37 ℃反应30min; 洗板：洗板机5次，每次洗液在孔中滞留 时间10-15s，并注满反应微孔；
B50ul，贴上封膜，37℃反应15min(避光)；
注：显色从加入第一滴显色液B开始计时
7.
终止：加终止液50ul；
8.
判读：终止反应后10min内完成。(450nm
处测定吸光度)
结果判断及解释： COV=2.1×N
阴性对照A≤0.10，阳性对照A≥1.0，否 则实验无效。
S≥COV 阳性
S＜COV 阴性
B50ul，贴上封膜，37℃反应15min(避
光)；
注：显色从加入第一滴显色液B开始计时
7.
8.
终止：加终止液50ul；
判读：终止反应后10min内完成。(450nm 处测定吸光度)
结果判断及解释： COV=2.1×N
阴性对照A≤0.10，阳性对照A≥1.0，否 则实验无效。
S≥COV 阳性
S＜COV 阴性
B50ul，贴上封膜，37℃反应15min(避光)；
乙肝五项检测
乙肝五项检测（ELISA法）一、检测目的：乙型肝炎病毒标志物(HBsAgHBsAb、HBeAg、HBeAb、HbcAb)检测。
二、测定原理：分别采用双抗体（抗原）夹心法和竞争法。
HBsAg、HBsAb原理：采用单克隆抗-HBs(HbsAg)包被反应板，加入待测标本，同时加入多克隆抗-HBs-HRP(HBsAg-HRP),当标本中存在HBsAg（HBsAb）时，该HBsAg（HBsAb）与包被抗- HBsAg（HBsAb）结合并与抗- HBsAg-HRP （HbsAb-HRP）结合形成抗- HBsAg（HBsAb）-抗- HBsAg-HRP（HBsAb-HRP）复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。
HBeAg原理：采用抗-HBe包被反应板，加入待测标本，同时加入抗—HBe-HRP，如待测样本中抗HBeAg时，就与包被抗-HBe、抗—HBe-HRP结合形成复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。
HBeAb原理：采用抗-HBe、HBeAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBe-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测样本中抗-HBe含量高，则抗—HBe-HRP 与HBeAg结合少，加入TMB底物时显色淡，反之则显色深。
HBcAb原理：采用基因工程重组HbcAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBc-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测样本中抗-HBc含量高，则抗—HBc-HRP 与HBcAg结合少，加入TMB底物时显色淡，反之则显色深。
三、操作步骤：1、将试剂从冷藏室中取出，30分钟后平衡至室温方可开启使用。
2、用蒸馏水将PBST浓缩液20倍稀释，作为洗液。
3、将微孔条固定于支架上，按序编号。
4、按具体使用试剂盒说明书加样、孵育、洗板、显色。
9、用酶标仪读数，取波长450nm,先用空白调零，然后读取各孔OD值。
四、结果判断：样品OD值／阴性对照平均OD ≥2.1，判断为阳性，否则为阴性。
试剂盒使用说明书
人抗乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中抗乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中人抗乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）水平。
用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被的微孔中依次加入抗乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb），再与HRP标记的抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的抗乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人抗乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）含量。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存标准品：270IU/L 0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
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此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、 HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体， 就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
竞争法
用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。 以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体表面， 经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和待测抗原的混 合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底 物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知 抗原的量。 这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位就可， 因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此 法。该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过程， 但需用较多量的酶标记抗原。
竞争法（测小分子抗原）
间接法
将特异性抗原与固相载体连接，的 抗体结合，使该抗体问接地标记上酶；
加受检血清：其特异抗体与抗原结合， 形成固相抗原抗体复合物。
固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。
传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原 就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法 。
酶
D + 2H2O 有色
酶联免疫吸附试验 用于检测可溶性抗 原或抗体
酶免疫技术
酶免疫组化法 用于检测组织中或 细胞表面的抗原
酶联免疫吸附试验-ELISA
ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）。
抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记；
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物； 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定 性或定量分析。
放射免疫技术
Y
细胞2
免疫荧光技术
酶免疫技术 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 可用酶标测定 仪测定光密度（OD）来反应抗原或抗体含量，灵敏度可达到 ng-pg/ml水平。
酶
酶具有高效催化性：可以加快化学反应的速度 ；在反应前后， 没有质和量的改变；微量的酶便可发挥巨大的催化作用。
Y
DH2 + H2O2 无色
ELISA检测乙肝抗体
第三小组
肝表面抗体ELISA检测
实验目的
1.掌握ELISA的原理和操作方法。
2.熟悉酶标仪的使用方法。
免疫标记技术
免疫标记技术是用荧光素、酶、或者放射性核素等标记抗体或 抗原，利用标记技术的高度敏感性进行的抗原抗体的反应。
标记物
细胞1
分类
荧光素 放色性核素 酶 酶免疫技术
操作步骤 1.从冰箱取出试剂盒，室温平衡30分钟。 2.按如下方式加待测血清，每孔1滴。 待1 待2 待3 阳性 阴性 空白
3.每孔加酶结合物1滴（孔上方悬空滴加，无气泡），混匀， 空白孔不加，置37度温箱30分钟。 4.取出反应板，弃液，拍干。 5.每孔注满洗涤液，（不要溢出）静置5秒后弃液，拍干， 重复洗涤5次，拍干。 6.每孔加显色剂A和B各1滴，置37度温箱15分钟。 7.每孔加终止液1滴混匀，观察结果。
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定 方法中有三个必要的试剂：
（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂" （immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物" （conjugate）； （3）酶反应的底物。
ELISA的类型
间接法（测抗体）
双抗体夹心法（测大分子抗原）
双抗体夹心法
酶标抗体
血清样品 或参比品
底物
特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体； 标本中的抗原与固相载体上的抗体结合成固相抗原复合物； 加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合， 酶量与标本中受检物质的量成正相关；
酶标仪测定OD值
加底物：夹心式复合物中的酶催化 底物成为有色产物
终止液
根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量
酶联免疫吸附试验-ELISA 实验原理 抗原或抗体吸附到固相载体表面后，以及抗原抗体与 酶连接后，仍保持免疫活性和酶活性，当酶遇到相应底物 时，在酶的催化下引起底物水解显色。产物的量与标本中 受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定 性或定量分析。 此法的特异性及灵敏度与荧光及同位素标记相似，但 其方法较以上两者简便，且不需特殊贵重仪器。因此，这 项技术目前正越来越广泛地被应用到医学的各个领域中。
两对半： HBsAg HBsAb HBcAb HBeAg HBeAb
HBV-Ag、Ab检测结果临床分析
HBsAg HBeAg HBsAb HBcAb HBeAb
+ + + + + + + + + + + + + + + + HBV感染/无症状携带者 急性/慢性乙肝/无症状携带者 急性/慢性乙肝 （传染性强，大三阳） 急性感染趋向恢复（小三阳） 既往感染恢复期 既往感染恢复期 既往感染或“窗口期” 既往感染或接种过疫苗
结果观察
结果观察
乙型肝炎病毒采用ELISA检测法具有操作简便、灵敏度高、试 剂成本低、环保和适用于大批量人群抗原、抗体筛查等优点, 目前在国内实验室被广泛使用。 缺点易产生假阳性结果。
酶标仪洗板机
排枪加样
酶标仪
乙肝病毒（hepatitis B virus, HBV）
抗原,抗体: 1、表面Ag（HBsAg） HBsAb 2、核心抗原（HBcAg） HBcAb 3、e抗原（HBeAg） HBeAb