神经生物学形态学方法
神经生物学研究方法
Tail suspension test (TST)
• 应激模型
小鼠悬尾法（tail suspension test），一种行为绝望法。将小鼠 倒悬 在实验小室内，观察5分钟内不动时间。 抗抑郁药可减少不动时间
Forced swim test (FST)
强迫游泳实验(forced swimming test) 动物在恶劣环境下不能逃逸 时，便出现行为绝望(behavioural despair)，处于一种不动状态 （immobility）是一种有效地评价抗抑郁药的大鼠抑郁模型。
WT
Camk2-cre;foxg1 L1
P7P10-P14
P7P10P13P15-P21
Camk2-cre;foxg1;Rosa-gfp GFP
control
MU
40000X
PSD/Active zone 宽度、 囊泡数量、 囊泡数量与 active zone相 对值
150000X
Adult TM7 rest14 Golgi staining
治疗干预
表观有效性
动物表现出和神经精神疾 病病人相同的行为模式
行为/认知障碍 减缓
预测有效性
动物模型应能对已知的 抗精神病药物处理作出 相应的反应或治疗前景
治疗干预
Behavioral tests
Basic Open fiated plus maze: anxiety Depression: tail suspension test, forced swim test Sucrose preference test, social interaction,
Foxg1f/f
Camk2-creer; Foxg1f/f
神经生物学研究常用方法
1.神经生物学研究的常用方法神经科学的发展与的研究方法的进步密切相关。
总体上，神经生物学的研究方法有六大类：形态学方法、生理学方法、电生理学方法、生物化学方法、分子生物学方法及脑成像技术。
7.1形态学方法神经生物学研究中常用的形态学方法有束路追踪、免疫组化和原位杂交，其他还有受体定位、神经系统功能活动形态定位等方法。
7.1.1束路追踪法追踪神经元之间的联系是神经解剖学研究中的重大目标，它对研究神经元的功能、神经系统的发育和成熟都具有重要意义。
这种方法学的建立始于19世纪末的逆行和顺性溃变（顺行溃变指胞体或轴突损伤后的轴突终末的溃变，逆行溃变指去除靶区之后神经元胞体的溃变）研究。
20世纪40年代主要手段是镀银染色法，根据变性纤维的形态变化来判断变性纤维。
20世纪50年代发展了Nanta法，能遏制正常纤维的染色而仅镀染出变性纤维。
但该法不易显示细纤维，1971年Kristenson等将辣根过氧化物酶（HRP）注入幼鼠的腓肠肌及舌肌结果在脊髓和延脑的相应部分运动神经元胞体内发现HRP的积累。
不久LaVail正式使用HRP作为轴突逆行追踪，以后遂广泛应用于中枢神经系统的研究。
HRP可被神经末梢、胞体和树突吸收，轴突损伤部分也可摄入。
在胞体内，HRP的活性可持续4~5天，在溶酶体内对联苯胺呈阳性反应而显现出来。
被标记的神经元可以清晰的显示胞体、树突及轴突。
除了HRP标记法，还有荧光物质标记法、毒素标记法、注射染料等方法。
7.1.2免疫组织化学免疫组织化学术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。
这种方法特异性强，敏感度高，进展迅速，应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。
近年随着纯化抗原和制备单克隆抗体的广泛开展以及标记技术不断提高，免疫组织化学的进展更是日新月异，不仅用于许多基本理论的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。
神经生物学的常用研究方法
HRP：1.游离HRP： 通过非特异性整体胞饮的方式被摄入
2.结合HRP：通过与细胞膜的特异性受体结合的介导进入神经元 麦芽凝集素（WGA）-HRP 霍乱毒素（CT）-HRP 优点：灵敏度高，用量较少， HRP在胞内降解时间明显延长， 能清晰地显示包括细微分支在内的整个神经元的全貌。
注意：因为HRP到达预定部位的时间取决于运输速度和距离，运 输速度因动物及纤维种类而异。同时HRP被运至胞体后即被送入溶酶 体内水解。因此在聚集和降解两个相反的过程中求得最佳存活期必须 具体测试。
（一）形态学方法
1、束路追踪法 2、免疫组织化学法 3、原位杂交法 4、受体定位法
束路追踪法
研究神经元之间的纤维联系是神经科学研究领域 的一个基本问题，其研究方法主要有三： （1）利用神经元轴浆运输现象的追踪法，是目前应用 最广者； （2）利用神经元胞体受损或轴突离断后远侧轴突的变 性，或轴突切断后胞体的反应特性的变性追踪法； （3）利用某些荧光染料在神经细胞质膜扩散的神经元 质膜荧光追踪法。
原 理： 将荧光物质注射至神经元的轴突分布区, 经分支 的末梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。在荧光显微镜 下可看到胞体内呈现荧光标记物。
• 荧光素追踪剂是一种暴露在一定激发波长光照下，以一定 发射波长发出一定颜色荧光的化合物。每一种荧光素都有 各自的激发波长和发射波长，不同的发射波长决定了这些 荧光素发出的荧光颜色各异。
HRP即可作逆行追踪剂使用，也可作顺行追踪剂使用。
基本步骤： 将HRP注射至实验动物中枢核团或周围器官、 神经的一定部位；存活一定时间后灌注、固定动物，取材 作苯冰胺冻（T切M片D；）然或后二用氨双基氧联水苯（胺H（2OD2A）B及）呈显色示剂HR四P甲反基应联产 物。
将HRP注射于周围神经感觉末梢 或神经干逆向标记背根神经节细 胞后，HRP还可进一步沿背根节 细胞的中枢突顺向标记其在脊髓 的中枢终止部位，称作跨节标记。
神经生物学研究
神经生物学研究神经生物学是研究神经系统的结构、功能和发展的学科。
它涉及到神经元、神经通路、神经调节以及神经系统与行为之间的相互关系。
神经生物学的发展对于我们理解大脑的工作原理以及神经相关疾病的治疗具有重要意义。
本文将介绍神经生物学研究的基本内容和方法。
一、神经生物学研究的内容神经生物学的研究内容包括：神经系统的组成、神经元的形态结构、神经递质及其作用机制、神经通路的形成与发展、神经调节的机制、神经系统的功能以及神经科学与行为科学的交叉等。
1. 神经系统的组成神经系统由中枢神经系统和周围神经系统组成。
中枢神经系统包括大脑和脊髓，周围神经系统包括脑神经和脊神经。
2. 神经元的形态结构神经元是神经系统的基本单位。
它由细胞体、树突、轴突和突触等组成。
不同类型的神经元形态结构各异，适应于不同的功能需求。
3. 神经递质及其作用机制神经递质是神经元之间传递信号的化学物质。
常见的神经递质有乙酰胆碱、多巴胺、谷氨酸等。
神经递质通过与神经元膜上的受体结合来传递信号。
4. 神经通路的形成与发展神经通路是神经元之间传递信息的路径。
神经通路的形成与发展受到遗传和环境因素的调控，它们的紧密联系决定了神经系统的功能。
5. 神经调节的机制神经调节是通过神经递质释放和神经元电活动调控神经系统功能的过程。
这种调控作用可以在大脑中控制感觉、运动、认知等各种生理过程。
6. 神经系统的功能神经系统参与各种生理功能的调节，如感觉、运动、认知、记忆、情绪等。
神经科学的研究有助于揭示这些功能的机制。
7. 神经科学与行为科学的交叉神经科学与行为科学是相互关联的学科。
神经科学研究提供了行为科学的基础，而行为科学的研究结果也能够反过来指导神经科学的发展。
二、神经生物学研究的方法1. 形态学方法形态学方法主要通过显微镜观察和记录神经元形态结构的特征，如细胞体形状、轴突走向、树突分支等。
这些方法可以揭示神经元的连接方式和功能区域。
2. 分子生物学方法分子生物学方法可以用来研究神经胶质细胞和神经元内信号传递的分子机制，如基因表达调控、蛋白质互作等。
神经生物学考点0
第八章
1.诱导：在原肠胚中，原肠背部中央的脊索与其上方覆盖的预定神经外胚层之间细胞的相互作用，使外胚层发育为神经组织的过程称为神经诱导。
3.神经生物学的概念:神经生物学（Neurobiology）是一门对动物和人类的神经系统进行生物学研究的综合性科学。 它从分子水平、细胞水平到神经网络（细胞间的活动）乃至整体系统水平上研究神经系统；以了解各个水平上的结构与功能的相互关系；神经系统的生长、发育、衰老、调亡规律；为阐明行为和心理产生的机制；物质产生精神活动的机理提供依据。
5.神经肽：神经系统存在的参与神经信息传递,具有生物活性的肽类物质,由5~10个氨基酸组成,分子量在500~5000之间
6.递质共存：见P79同一神经元内可以含有二种或二种以上的化学信息物质，此现象称为递质共存
生理学意义意义：见P79①共存的递质释放后，起协同传递信息的作用；②可通过突触前调节的方式，改变相互的释放量，加强或减弱突触传递活动；③可直接作用于突触后受体，以相互拮抗或协同的方式来调节器官的活动，使机体的功能调节更加精密完善，更加协调。
5.神经胶质细胞：也称神经胶质，是广泛分布于中枢神经系统内的，除了神经元以外的所有细胞。具有支持、滋养神经元的作用，也有吸收和调节某；
分类：
中枢神经系统（CNS)的神经胶质细胞：有四种，星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和室管膜细胞。
周围神经系统(PNS)的神经胶质细胞：有两种，施万细胞和卫星细胞
神经生物学的常用研究方法
组织（细胞）化学是介于细胞学与化学之间的一门科 学。细胞化学的目的是使用细胞学和化学的方法使细胞 （组织）内的某些化学成分发生反应，在局部形成有色反 应物，藉此对各种活性物质在显微镜水平进行定性、定位 和定量分析。 酶组织化学：利用酶对底物的催化作用，使底物发生颜色 变化，其次对该酶进行定位、定量分析。
在应用组织化学技术显示组织和细胞内化学物质及定位 和定量以及代谢状态时，需要满足以下要求： ① 保持组织和细胞形态结构的良好状态，以便反应产物的定 位精确。如果形态结构破坏而失真，则定位困难。 ② 具备一定的特异性，以便获取正确的实验结果。 ③ 具备一定的灵敏性，以便含量极微的物质也能被显示出来。 ④ 生成的反应产物必须是有色沉淀，颗粒微细不溶，定位于 原位。反应物沉淀的颜色深度与相应物质含量或酶的活性 具有一定的量效关系。 ⑤ 反应产物具有稳定性，以便于重复观察 ⑥ 要有重复性。 ⑦ 选择的试剂必须是分析纯，对被检测物质或酶应无任何影 响；实验所用器皿必须清洁无污染杂质，使用的蒸馏水应 为双蒸水。 ⑧ 为了保证实验的可靠性、科学性，防止假阳性的发生，必 须同时作对照实验。
• 荧光素追踪剂是一种暴露在一定激发波长光照下，以一定 发射波长发出一定颜色荧光的化合物。每一种荧光素都有 各自的激发波长和发射波长，不同的发射波长决定了这些 荧光素发出的荧光颜色各异。
• 不同荧光素在神经元内的标记特征不同： 绝大多数标记细胞质，如荧光金（Furogold，灵敏度 高，能较好显示树突分支，只标记胞浆；在胞体内分解慢， 甚至在注射后存活2个月标记强度仍无明显变化；比较耐 紫外线的照射，褪色比较缓慢；可以经受许多组织学染色 处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等结合使用）， fast bule（固蓝）等。 只有少数仅标记细胞核，如nuclear yellow（核黄 ）, diamidino yellow（双脒基黄）等。
神 经 生 物 学 常 用 形 态 学 研 究 方 法
组织材料的处理
1.固定(fixation) 目的：防止组织自溶，保护组织免受微生 物侵袭，保存组织成份不被破坏丢失， 维持组织结构使之正确的反应生活状态。 固定剂：4%多聚甲醛（常用） 方法：浸泡固定，灌注固定 2.切片(section)：石蜡切片，冰冻切片
一、一般染色方法
10×
40×
HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat
HRP labelling neurons in dLGN
40×
Doublelabelling of HRP and
Glutamate in rat lateral geniculate nucleus
NOS与 NADPH-d活性的比较
• Nos活性：a.协同因子有Ca2+、CaM、 NADPH阻断任何一个协同因子结合位点都 可抑制Nos • b.底物:L-Arg • NADPH-d活性:a:不需CaM、Ca2+作为协 同因子，只需NADPH • b；底物：NBT(亚硝基四唑氮蓝）
NOS活性≠NADPH-d活性,使用NOS 抑制剂后不能用NADPH-d组化染色来 分析NOS活性。 NADPH-d组化染色阳性细胞中可含有 NOS,但不能说明有NOS 活性， NADPH-d组化染色阴性细胞中一般不 含NOS.
4,Washing:去掉非特异性结合 5, Incubate in second antibody :浓度 1/100~200,二抗必须针对一抗动物种属， 二抗上结合的物质不同，显色用不同方法： ABC，PAP，荧光显色，IGSS。ABC， PAP经典、产物稳定，荧光法不需三抗， 不需脱水透明。但荧光易淬灭。IGSS非 常敏感，不用DAB做反应，但背景难以控 制。
神经生物学第二章 神经生物学研究的方法
*Ag+Ab *Ag.Ab +
Ag ↓↑ Ag.Ab? 当*Ag固定时，Ag含量越高，所得到的*Ag.Ab就越 少。 所用仪器：r-计数器，液体闪烁计数仪
4、放射受体测定受体法
利用标记能作用于不同靶组织内各 种受体的递质和激素，从而达到直接测 定配体与其受体形成络合物的过程和理 化特性。
l 双重免疫组织化学染色：主要是为了研究 两种物质在同一细胞或突起内的共存现象， 或两种不同化学物质的相互关系。
免疫组化的类型:直接法和间接法
３、原位杂交法
在形态学研究中，主要用于显示细胞内功能 蛋白或多肽的mRNA。
４、受体定位法：研究受体在神经 系统内的定位
配体法：主要在组织切片上进行，利用标记的配 体和受体结合以示踪其部位
逆行冲动记录法(Antidromic impulse recording)： 逆行冲动记录法即电刺激神经元的轴突主干或末 梢，在同一神经元胞体记录反相传导的动作电位。
电压钳技术(Voltage Clamp)： 通过插入细胞内的一根微电极向细胞内补
充电流，补充的电流量正好等于跨膜流出的反向 离子流，这样即使膜通透性发生改变时，也能控 制膜电位数值的不变。
5、免疫印迹法（immunoblotting 或western blotting）鉴 定生物分子
将电泳凝胶分离出来的电泳带移到特殊的滤膜上，再利 用标记抗体与滤膜上某一蛋白质或肽的特异结合，使其显 色。
优点：一是将传统的电泳凝胶染色法的敏感度提高了 100~1000倍，二是与RIA相似，能从多种蛋白质中选择鉴 定出一种特异的蛋白质，其敏感性可达1ng，同时能知道 这一蛋白质的分子量，这又是RIA无法达到的。
神经生物学
脑组织推挽灌流
是一种采集特定脑区或 核团的神经细胞外液中. 所含有的神经化学 物质的方法。
脑透析术又称微透析术是在推挽灌流基础上发展起 来的一种连续灌注并采集清醒自由活动动物特定脑 区内灌流液的一种新方法，该技术与高效液相色谱 或放射免疫测 定等灵敏的检测系统相结合可测定脑 内细胞外液中许多神经递质如乙酰胆碱，去甲肾上 腺素，多巴胺，５－羟色胺及它们的代谢产物，游 离氨基酸，小的肽类，磷酸 乙醇胺、维生素和各种 离子等的变化。
保护脑
PD, AD, 中风
开发脑
开发人脑 增强智能 模拟人脑
高速交通
生活节奏 生活质量 社会开放
颅脑, 脊髓外伤
焦虑,抑郁,精神病 镇痛 祛痛 吸毒问题
Confocal
(形态）
CT(形态）
行为变化
智能电脑
• 离体实验(in vitro) 从动物体内取出某一器官、 组织或分离出某种细胞，置于适宜的人工环境 下使其在短时间内保持生理功能，观察它们的 功能活动及影响因素。 • 优点：有利于排除无关因素的影响，便于观察 离体器官、组织或细胞的基本生理特性。 • 缺点：但这些特性不一定完全代表它们在整体 条件下的活动情况。 • 在体实验(in vivo) 一般是指在麻醉状态下，对 动物施行手术，暴露所要观察或实验的器官， 也称活体解剖实验。 • 优点：有利于观察器官间的相互关系和分析某 一器官活动的过程和特点。
CT 技术首先应用于医学领域，形成了医学 CT(MCT)技术，其重要作用被评价为是医学 诊断上的革命。CT技术成功应用于医学领域 后，美国率先将其引入到航天 及其它工业部 门，另一些发达国家相继跟上，经过一段不 长的时间，形成了CT技术的又一个分支—工 业CT(Industrial Computed Tomography, ICT)，其重要作用被评价是无损检则领域的 重大技术突破。
神经生物学中的突触发育与变形
神经生物学中的突触发育与变形神经系统是一种复杂的生物系统，负责传递信息与控制各种生理功能。
而神经细胞之间的信息传递，则通过突触完成。
突触是连接神经元之间的间隙，其中包含着神经递质与神经元之间的连接点。
在神经信号传递过程中，突触的发育与变形是至关重要的一环，因为它们决定了神经系统的结构与功能。
突触发育的过程分为分化、生长和成熟三个阶段。
分化阶段，神经元之间的联系尚未建立，突触标志物则开始在细胞表面分布。
生长阶段则是突触发育的最重要阶段，它的成功与否将直接影响到神经元之间的连接质量。
在这个过程中，突触树将从神经元上生长出来，分化出许多分支，向着其它神经元的方向生长。
当两个神经元的突触树接触到一起时，突触结构将被形成。
随后，突触进入成熟阶段，自身的结构及功能都将逐渐稳定下来。
值得注意的是，突触发育与成熟的过程是受到环境因素影响的。
例如，如果神经元的连接含有大量损伤因素，那么突触的发育将会受到不利的影响。
同样地，如果神经元连接的附近含有足够充足的神经递质或能量，那么突触的成熟过程将会提前，神经元之间的连接也将更为稳定。
突触还有着非常重要的变形能力，具体表现为“可塑性”。
在神经信号传递过程中，突触会根据它们所接收到的信息来进行变形，以适应生理或环境的需要。
这是指突触后膜上的受体发生了改变或者是预异质化了。
可塑性最为常见的形式则是长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）。
LTP是指神经元之间的连接能力增加，即有效突触间的传输增强。
LTD与LTP相反，神经元间的连接能力被减弱。
具体来说，LTD和LTP有着相似的生化机制和神经递质途径，其差异主要在于递质的通道。
在生物学中，突触的可塑性是与记忆、学习、适应等重要的生命功能密切相关的。
除了LTP和LTD，其他类型的可塑性也可以通过调节神经递质来实现。
例如，非同步释放可以增强突触的有用性，而同步释放则可以降低突触的有效性。
突触可塑性是一个相对开放的研究领域，未来还需要通过大量的实验和观察，进一步发掘其背后的生理和神经生物学原理。
神经细胞的形态学与功能分析
神经细胞的形态学与功能分析神经细胞是组成神经系统的基本单位，其形态和功能对于神经系统的正常运作至关重要。
神经细胞具有多样的形态和功能，其结构特点和活动机制在神经科学中得到了广泛研究和探讨。
神经细胞的形态特点：神经细胞是一类极度分化的细胞，其形态展现出了一些明显的特点。
首先，神经细胞的细胞体呈现类圆形或多角形，大小不一，通常较大，其直径可达到100微米以上。
其次，神经细胞的细胞质含有大量细胞器，特别是内质网和小体，使得细胞体呈现出较大的浓度差异。
此外，神经细胞还具有很长的细胞突起，分为树突和轴突，其中轴突通常较长，可以延伸到整个身体的不同部位，为神经信号传递提供了重要的通道。
树突则主要是接受突触传入的信号，并将这些信号传递到细胞体内。
神经细胞的功能特点：神经细胞主要的功能是传递神经信号，控制和调节人体的各种生理活动，其中脑部神经细胞的功能更是精细和繁复。
神经细胞可以将细胞膜上的神经冲动转化为化学信号，通过突触传递给其他细胞。
神经细胞在传递神经信号的过程中，其功能表现出了很多特点。
神经细胞的突触部位是神经信号传导至其他细胞的重要通道，在此处，神经细胞和其他细胞之间形成了特殊的结构，即突触。
突触分为化学突触和电突触两种。
其中，化学突触是神经内递质分泌后，在神经内递质和受体之间发生复杂的相互作用，产生突触后电位，从而传递神经信号。
而电突触则是通过跨着高度抵抗的连续性质膜通道来传递信号的，其传递速度更快，响应也更加迅速。
神经细胞的形态和功能变化：随着生物体的成长和发育，神经细胞的形态和功能也会发生变化。
例如，在人类的大脑皮层中，神经元的数量约为1000亿个，而每个神经元能建立的突触数量巨大，所以大脑的神经元数量和其突触总数呈倍指数增长。
此外，神经细胞还可以通过合并形成更大的结构单元，如形成神经纤维、神经丛和神经节等。
总之，神经细胞的形态和功能是神经系统的重要组成部分，其形态和功能的多样性和变异性反映了神经系统的巨大复杂性。
神经元和突触的形态学结构与功能
神经元和突触的形态学结构与功能在神经科学领域内，神经元和突触一直都是研究的核心。
神经元是神经系统中最基本的单位，而突触则是神经元之间传递信息的重要结构。
本文将详细讨论神经元和突触的形态学结构与功能。
神经元的形态学结构神经元可以分为三个部分：细胞体、树突和轴突。
细胞体是神经元的主要部分，包括细胞核和细胞质。
树突是一种长短不一的分支结构，负责接收其他神经元的信息。
轴突则是一条长长的管道，负责将信息发送给其他神经元。
神经元的形态学结构与其所处的功能区域有关。
在脑部区域，神经元的形态学结构更为复杂，分支更多，且与其他神经元之间会形成复杂的突触结构。
这就是我们所说的神经网络。
神经元的功能神经元的主要功能是接收、处理和传递信息。
当神经元接收到信息时，它会将信息传递给轴突，然后通过轴突将信息传递给其他神经元。
这个过程被称为神经元的“放电”。
神经元的放电是被动的，它的强弱取决于刺激的强度和持续时间。
当神经元的放电达到一定强度时，它就会引发动作电位的形成，将信息传递给其他神经元。
在神经网络中，这个过程会接连不断地重复进行，从而形成神经信号的传递。
突触的形态学结构突触分为两种类型：化学突触和电突触。
化学突触是最常见的突触类型，它通过化学物质传递信息。
电突触则是通过电信号传递信息，但相对于化学突触，电突触数量较少。
化学突触的形态学结构包括前突触和后突触。
前突触是信息传递的源头，它从神经元的轴突向外分叉并释放神经递质，后突触则是信息接受的末端，它包括接受神经递质的受体。
电突触的形态学结构则比化学突触简单得多，只有一个突触间隙和两个细胞膜。
电突触的重要性在于它能够更快速地进行信息传递，通常用于由一组神经元构成的细小网络之间的信息传递。
突触的功能突触主要用于神经元间的信息传递，通过释放神经递质或电信号来完成。
在神经网络中，神经元会通过多个突触与其他神经元形成连接。
这种连接的强弱会影响信息的传递速度和强度，进而影响神经网络的功能。
神经生物学的形态学研究方法
第一部分神经生物学的形态学研究方法一、研究神经细胞的形态及细胞构筑的方法（一）尼氏（Nissl）染色法原理用碱性染料染神经组织常用染料焦油紫、硫堇、中性红结果尼氏小体被染色，背景无色。
用途皮质的分层、分区、脊髓灰质的分层、核团的分区、细胞的构筑（二）高尔基（Golgi）镀银染色法原理铬银与脂蛋白形成复合物，在细胞膜系统的间隙内形成结晶结果整个细胞为黑色用途显示整个细胞的全貌二、研究神经径路的方法（一）溃变法原理神经元胞体或纤维损伤后远侧部分发生顺行变性（纤维交替膨胀和狭窄，呈念珠状继而呈颗粒状），可用镀银法显示或电镜观察。
胞体发生逆行变性（胞体内色质溶解，胞体肿胀，核偏向胞体的一边），可用尼氏法显示。
应用研究纤维联系。
（二）辣根过氧化物酶（HRP）标记法原理HRP注入神经组织或脏器—逆行、顺行、过节标记—H2O2、色原酶反应—呈色试剂HRP： 1.游离HRP2.结合HRP(WGA-HRP、CT-HRP）色原： 1.二氨基联苯胺(DAB)2.二盐酸联苯胺(BDHC)3.邻-联茴香胺(OD)4.四甲基联苯胺(TMB)稳定剂:硝普钠、钨酸钠用途研究脏器的神经支配、中枢内核团间的联系等。
还可与免疫组织化学、电镜技术等结合。
（三）荧光素轴突逆行传递标记法原理将荧光物质注射至神经元的轴突分布区, 经分支的末梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。
在荧光显微镜下可看到胞体内呈现荧光标记物。
荧光素Furogold FB-NY GB-NY TB-Bb PI-Bb EB-DAPA应用研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。
（四）放射自显影示踪技术原理将放射性同位素3H等标记的氨基酸导入神经组织，氨基酸被神经元摄取后在胞体内合成蛋白质，沿轴突顺行运输，分布于整轴突和末梢，同位素产生的核射线使照相乳胶感光，根据感光银粒所在部位和黑度判断放射性示踪剂的位置和数量，从而确定神经纤维的路径。
示踪剂3H -脯氨酸标记终末、跨突触标记3H -亮氨酸标记终末、纤维3H -HRP酶蛋白与HRP结合双标记用途研究神经元的传出路径（五）2-脱氧葡萄糖放射自显影法原理2-DG能与葡萄糖竞争和6-磷酸葡萄糖异构酶结合，但不能转化为相应的磷酸果糖，因此滞留在细胞中。
神经生物学形态学方法
神经生物学形态学方法神经生物学是研究神经系统的结构和功能的学科，其核心是形态学方法。
神经生物学形态学方法主要用于观察神经系统的形态结构，以及研究神经元的形态特征、神经系统的连接方式和功能区域等。
本文将从神经元的形态特征、神经系统的连接方式和功能区域等方面，介绍神经生物学形态学方法的应用。
神经元是神经系统的基本功能单位。
神经生物学形态学方法能够通过显微镜观察神经元的形态特征，包括神经元的形状、大小、分支等。
例如，通过光学显微镜观察神经元的形态结构，可以发现神经元的细胞体、树突、轴突等部分。
通过电子显微镜观察神经元的形态结构，可以进一步了解神经元的胞质、细胞核、线粒体等细胞器的分布和形态。
这些形态特征的观察和描述为研究神经元的功能和神经系统的连接方式提供了基础。
神经系统的连接方式是神经生物学形态学方法的重要研究内容之一。
神经系统的连接方式包括神经元与神经元之间的突触连接和神经元与靶细胞之间的突触连接。
神经生物学形态学方法可以通过显微镜观察和显微操作手段，揭示神经元之间的突触连接方式。
例如，通过神经示踪技术，可以将示踪物注射到某一神经元中，然后观察示踪物在神经系统中的传播路径，从而确定神经元之间的连接方式。
这种方法可以帮助研究者了解神经系统的连接方式，从而揭示神经系统的功能结构。
功能区域是神经系统的重要组成部分，也是神经生物学形态学方法研究的重点之一。
功能区域是指神经系统中特定区域的神经元具有相似的功能。
神经生物学形态学方法可以通过观察神经元的形态特征和突触连接方式，确定神经系统中的功能区域。
例如，通过观察大脑皮层神经元的形态特征和突触连接方式，可以确定大脑皮层的功能区域。
这种方法可以帮助研究者了解神经系统的功能分区和功能定位，从而揭示神经系统的功能机制。
神经生物学形态学方法在研究神经系统的结构和功能方面起着重要作用。
通过观察神经元的形态特征、揭示神经系统的连接方式和功能分区，可以帮助研究者了解神经系统的基本结构和功能机制。
形态学方法
形态学方法形态学方法是生物学发展至今所提出的一种理论方法，它是一种主要研究生物体的外部形态变化的研究。
形态学通过对生物体的形态特征的观察和定性描述，以及对生物体外部特征的定量测量，来研究生物体内部器官结构、解剖形态、行为和生态特征。
它也可以被用来描述生物体之间的关系，即它们是如何由不同的特征组成的，以及它们之间的相似性和差异等。
形态学之于生物学就像化学之于化学一样，它是解决生物学问题的最基本的和最有效的方法之一。
它有助于我们理解物种的分布、进化和物种本身的属性。
在进化生物学中，形态学方法也可以用来推断物种的进化史，以及不同物种之间的关系。
形态学方法的应用大致可以分为定量和定性形态学两个方面。
定量形态学主要是通过对物种形态的实际测量来评估物种群落的形态变化，研究其形态特征的变化情况，以及在物种群落进化过程中，物种形态特征的进化变化情况。
定性形态学则主要是通过对物种外部特征的定性描述，分析不同物种之间的形态差异，以及比较不同物种之间的相似性，以进一步观察物种进化和分布趋势。
形态学方法在研究生物多样性时特别有用。
物种特性，如形状、大小、颜色等，都可以作为生物多样性的重要指标。
形态学方法可以用来研究物种特性的多样性，比如可以利用定性形态学方法描述一种物种的形状、大小、结构等外部特征，从而建立物种特征之间的关联，探索物种进化和分布趋势。
此外，形态学方法也可以用来研究入侵物种对本地物种群落的影响。
通过对入侵物种与主要成分物种的形态特征的比较，可以深入地检验两者之间的差异。
此外，形态学方法还可以用来研究入侵物种与本地物种之间的竞争关系，从而发现入侵物种对本地物种的影响，并找出可能的管理策略。
形态学方法是一种重要的生物学方法，它有助于我们深入研究物种之间的关系、研究生物多样性，以及研究入侵物种对本地物种的影响等方面。
它也可以帮助生物学家更好地了解物种的进化史和未来发展趋势，从而为解决生物多样性保护和可持续发展提供有效支持。
15神经生物学研究的常用方法
1.神经生物学研究的常用方法神经科学的发展与的研究方法的进步密切相关。
总体上，神经生物学的研究方法有六大类：形态学方法、生理学方法、电生理学方法、生物化学方法、分子生物学方法及脑成像技术。
7.1形态学方法神经生物学研究中常用的形态学方法有束路追踪、免疫组化和原位杂交，其他还有受体定位、神经系统功能活动形态定位等方法。
7.1.1束路追踪法追踪神经元之间的联系是神经解剖学研究中的重大目标，它对研究神经元的功能、神经系统的发育和成熟都具有重要意义。
这种方法学的建立始于19世纪末的逆行和顺性溃变（顺行溃变指胞体或轴突损伤后的轴突终末的溃变，逆行溃变指去除靶区之后神经元胞体的溃变）研究。
20世纪40年代主要手段是镀银染色法，根据变性纤维的形态变化来判断变性纤维。
20世纪50年代发展了Nanta法，能遏制正常纤维的染色而仅镀染出变性纤维。
但该法不易显示细纤维，1971年Kristenson等将辣根过氧化物酶（HRP）注入幼鼠的腓肠肌及舌肌结果在脊髓和延脑的相应部分运动神经元胞体内发现HRP的积累。
不久LaVail正式使用HRP作为轴突逆行追踪，以后遂广泛应用于中枢神经系统的研究。
HRP可被神经末梢、胞体和树突吸收，轴突损伤部分也可摄入。
在胞体内，HRP的活性可持续4~5天，在溶酶体内对联苯胺呈阳性反应而显现出来。
被标记的神经元可以清晰的显示胞体、树突及轴突。
除了HRP标记法，还有荧光物质标记法、毒素标记法、注射染料等方法。
7.1.2免疫组织化学免疫组织化学术是应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。
这种方法特异性强，敏感度高，进展迅速，应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。
近年随着纯化抗原和制备单克隆抗体的广泛开展以及标记技术不断提高，免疫组织化学的进展更是日新月异，不仅用于许多基本理论的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速诊断等临床实际。
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神经生物学形态学方法（总结）一、束路追踪法（神经形态示踪方法）1. 辣根过氧化物酶示踪技术1971年，Kristenson和Olsson首先报道辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）可被神经末梢摄取，经轴浆逆行运输至神经元胞体，然后用组织化学方法即可显示出神经元的轮廓，从而创建了HRP追踪神经元示踪技术，即HRP法。
HRP法的基础是轴浆运输。
轴浆运输是神经元的一项基本活动，即沿其轴突有从胞体向末梢（顺向）及从末梢向胞体（逆向）的物质转运。
且不同的物质有不同的运输速度。
轴浆运输的特性为HRP在轴浆运输及其跨神经元的示踪技术奠定了基础。
该法为研究神经元之间的联系提供了一种简便可行的方法。
HRP是从辣根中提取出来的过氧化物酶，为一种结合酶，由一分子无色的酶蛋白与一分子棕色的铁卟啉辅基结合而成。
HRP比较稳定，63℃加热15min不失活。
其分子量约为40000，直径3.0nm，在水化情况下直径为5.34nm。
1966年，Shannom等曾将HRP分出A1、A2、A3 、B、C、D和E七种同工酶。
1976年，Bunt等曾试验了中枢神经系统对不同的HRP同工酶的摄取及运输能力，发现A同工酶几乎无逆行运输现象，而B、C同工酶的逆行运输效果较好，由此可见，HRP的选择是HRP追踪法成败与否的一个关键因素。
HRP法建立的早期，仅用于逆行追踪，即将HRP注入神经的末梢部位，经逆行轴浆运输至胞体，再通过酶组化染色显示。
以后的实验证明，HRP也可用于顺行运输，即将HRP注入神经元胞体所在部位，HRP可顺向运送至末梢部位。
近年来也发现，HRP注射于感觉神经末梢周围不仅可逆向标记背根节细胞，还可进一步沿背根节细胞顺向标记其所在脊髓的中枢投射，称为跨节标记（transganglionic labeling）。
与过去用于显示由损伤而引起纤维溃变的银染法相比，HRP法可更精确地研究神经纤维的联系。
HRP方法的问世，在神经科学研究领域中极富价值，它结束了自Marchi（1886年）开始长达一个世纪的唯用银染法追踪溃变纤维的年代，在神经束路追踪的形态及功能研究中具有划时代的意义。
至今，HRP追踪技术已可运用于：逆行追踪；顺行追踪；跨节转运。
HRP法的基本步骤包括：动物麻醉，HRP的注入（中枢或周围神经系统，周围器官），动物存活一定时间，灌注取材，切片，组织化学染色。
以下对每一步骤作逐一介绍。
0票票数举报MORRIS水迷宫视频分析系统.kyy629.40积分0得票2粉丝加关注. 2004-12-25 12:14 消息引用收藏分享分享到哪里？复制网址新浪微博豆瓣社区腾讯微博开心网人人网一、动物麻醉及HRP的注入（一）麻醉一般常用麻醉剂为戊巴比妥钠。
也有报道乌拉坦的效果优于戊巴比妥钠。
动物麻醉不宜过深，过深可抑制神经元的活动度，影响HRP在轴突内的运输速度，同时也易导致动物不苏醒或死亡。
一般的原则是：勿过深，时间勿过长，最好在注射完毕时动物已苏醒。
据文献报道，大鼠的麻醉剂量为0.25~0.35ml/100g，猫的麻醉剂量为1.3ml/kg（3.5%戊巴比妥钠）。
（二）HRP在中枢神经系统的导入有多种将HRP引入中枢神经系统的方法，最常用的是压力注射法和电泳法，此外，还有适应特殊需要的缓释胶、聚合物糊及微孔滤纸等方法，现将常用的前两种方法介绍如下：1．压力注射法若HRP为粉剂，用时常将其用生理盐水或蒸馏水稀释成20~50%的水溶液。
而用麦芽凝集素-HRP（wheat-germ agglutinin，WGA-HRP）或霍乱毒素-HRP（cholera toxin，CT-HRP）则用1~5%和0.1~3%的浓度。
若HRP为溶液（如北京协和医科大学生产），则可直接应用，不必稀释。
注射器常用0.5µl 或1.0µl的微量注射器。
HRP的注入量与动物大小和脑内核团的大小以及注入后在其注入点扩散的范围有关。
注入0.06µl浓度20%的HRP，可在脑内注入点形成直径2~5mm的注射范围。
注射的速度影响HRP在组织内的扩散程度，注射过快，在局部形成的压力过大，易造成局部组织损伤出血，过慢则使注射范围太局限。
因1µl等于1立方毫米，这对于小动物的中枢神经系统已是一个比较大的体积。
所以，注射速度一定要控制。
一般情况下，注射0.1µl的时间为7~10min。
进针后停针几分钟，以免HRP随局部出血而被稀释。
注射过程中速度不易控制，可用千分尺或电动自动推进器来推进。
为了使HRP充分渗入组织，不致随针道外溢造成污染，注射完毕应留针15~20min才拔针。
2. 电泳法电泳法的特点是在电泳时只有HRP离子的泳出而无液体流出，不致在组织内形成液体压力。
这样有两个优点：（1）HRP扩散范围小，注射区较集中；（2）避免了液体压力对组织造成的损伤。
HRP 中作神经束路追踪的有效成分是其碱性同工酶（Shannon分类的B、C同工酶），其等电点为pH9.0。
为了使HRP在溶液中达到最大的离子化程度，Bunt等（1976）提出应将HRP溶液的pH值调节到8.6以下。
事实上，pH接近7.4更合理，由于与体内正常pH一致，避免了管内、外液体之间的pH梯度差过大。
在pH小于其等电点的溶液中，HRP离子带正电，因此，HRP溶液应接直流电阳极，电泳强度及通电时间按所需注射范围的大小而异，一般常用2~4μA，通电15~30min。
连续的稳恒电流可使电极极化，阻抗增加，故常采用脉冲或间断式通电。
HRP液的浓度可用20%，也可用低于此的浓度。
由于电泳时泳出的离子除了HRP＋外，还包括其它的正离子，而其它正离子越多，则泳出的HRP＋越少，故应尽量减少溶液中的其它正离子。
可用0.1~0.2M的氯化钠或0.1M的磷酸缓冲液配成2~5%的HRP溶液。
（三）HRP在周围神经系统的导入1. 周围器官的注射将HRP溶液注射于周围器官内，可以追踪支配该器官的感觉、运动神经元的胞体所在部位。
注射量因器官之大小及所需注射的范围而异。
CT-HRP用于追踪肌肉运动神经元的部位及支配区域效果较好，能比较完整地显示出运动神经元的树突。
例如：需要追踪舌下神经核，可以将HRP注射于舌肌。
然而，需特别强调的是，周围器官注射应注意的一个重要问题就是排除污染。
如将HRP注射于某一器官前，应切断邻近器官的神经，若注射某一腹腔脏器，可将其与临近的器官隔离。
⒉神经干注射将HRP直接注射在神经干内，可追踪其感觉、运动纤维的胞体及感觉纤维的中枢投射。
为了促进神经纤维对HRP的吸收，可在注射前将注射部位的神经夹挫一下。
⒊神经断端的涂抹、浸泡法此法的目的同神经干注射，用锐器将神经切断后，在断端涂以HRP结晶，放置大约2小时后，用生理盐水冲洗。
但如果神经断端干燥，时间稍长时HRP不易溶解而无效，故可以将HRP调成糊状涂抹更有效。
浸泡法与之相似，将HRP配成一定浓度的溶液（20%左右），放入一段比神经稍粗的聚乙烯管内，使神经断端浸泡于其中，另一端用骨蜡或凡士林封口。
WGA-HRP和CT-HRP均可用此方法，且效果较游离HRP者好。
用涂抹、浸泡法时需注意以下几点：(1)保证神经的血液循环，以利于HRP的运输，因此，不能游离神经过长。
(2)勿挤压、牵拉神经，防止对其造成额外损伤。
(3)断端充分止血，血凝块要去除干净，动作要轻柔，可在神经断端放置一块温盐水棉花数分钟。
二、动物存活期的确定因为HRP在注入部位被神经末梢或神经元胞体摄取后，在轴突中运输要经过一段时间，故为有效显示神经元胞体或末梢，动物需存活一段时间，而动物存活时间的长短对HRP的标记效率有直接影响，时间太短，HRP不能到达目标部位，时间太长，HRP被降解影响组化染色的结果，故动物存活时间或称存活期应适当。
存活期的确定主要取决于三个因素：①HRP何时运输至胞体或末梢。
②HRP何时在胞体或末梢内的含量最高。
③HRP何时从胞体或末梢消失。
HRP到达预定部位的时间取决于运输的速度及距离，同时也因动物种类及纤维种类而不同。
故应具体情况具体分析，摸索出较理想的存活期。
一般逆行和顺行的运输速度参考值为50~80mm/d和50~500mm/d。
也可根据这样的公式估计存活期，即最佳存活期（日）=（束路长度mm/350mm）+1日。
WGA-HRP和CT-HRP在神经细胞内的降解速度较慢，存活时间稍长不致影响标记物的数量。
但需注意的是，跨节标记需要的时间较长，因HRP从周围端进入胞体后，需经一段时间的延搁后，才能进入其中枢突。
故跨节标记时间比不跨节者长，需较好的理论计算结合实验摸索才能得到良好效果。
三、动物的灌注、取材（一）固定剂的选择固定是HRP技术中的一个关键步骤。
因此，固定剂的选择就显得尤为重要。
常用的固定剂有两种：多聚甲醛及戊二醛。
固定的效果不仅取决于固定液各成分的浓度，还和使用时的温度及固定时间的长短有关。
较常用的是1.5%多聚甲醛-1.25%戊二醛。
(二) 灌注、取材、切片动物经过存活期后，进行麻醉，并经左心室升主动脉插管行心内灌注固定。
灌注分为三部分：先快速灌注21℃生理盐水或0.1M PBS，灌注量视动物大小而定（大鼠约100ml，大动物如兔、猫、猴等约500~1000ml）。
随即灌注固定液，常用的固定液为1.5%多聚甲醛-1.25%戊二醛磷酸缓冲液（pH 7.4），灌注速度先快后慢，约30~40min灌完。
继固定液灌完之后，接着再灌10%蔗糖磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH 7.4 ，0~4℃，最好用双蒸水配制）, 灌注量和速度以及总时间与固定液相同，蔗糖可防止冰晶形成，还可减少呈色反应中的冰晶沉着。
灌注结束后，取组织放入20%蔗糖磷酸缓冲液中沉底，若不立即切片，可将组织保存在10%蔗糖磷酸缓冲液中（4℃，1周）。
切片厚40μm左右，收集于pH7.4的磷酸缓冲液中备用。
四、呈色反应较常用的是TMB（四甲基联苯胺）显色法，也可用DAB（二氨基联苯胺）显色。
TMB法反应灵敏，现将其反应步骤介绍如下：1. 切片蒸馏水洗，6次，每次15s，或3次，每次2min。
2. 温的孵育液孵育，19~23℃，避光，20min，不断晃动。
3. 将切片取出，每100ml孵育液中加入0.3%的H2O21.0~5.0ml，混匀。
具体量应根据具体实验摸索确定。
重新将切片浸入，晃动，避光，19~23℃，20min。
4. 洗片：醋酸洗液（4℃）漂洗，3次，每次5min。
5. 贴片，载玻片用铬矾明胶包被，室温空气干燥。
6. 脱水、透明按如下步骤依次进行（1）蒸馏水10s（2）70%酒精10s（3）95%酒精10s（4）100%酒精2次，各10s（5）二甲苯2次，各2~5min7．中性树胶封片呈色反应的基本原理是游离或结合型HRP与H2O2结合成[HRP·H2O2]络合物，此络合物可氧化各种供氢的呈色剂而呈色。