基因工程作业(引物设计)

基因工程作业

1、DNA载体经HindⅢ切割后产生粘性末端，能发生载体自连，影响载体与外源DNA的连接效率，常用的防止载体自连的方法有碱性磷酸酶处理使5’磷酸基团羟基化。

2、切口平移是指在DNA聚合酶Ⅰ的作用下，使5’磷酸基团带上放射性标记。

在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是提高蛋白质浓度防止酶失活。

3、下列哪一种酶作用时需要引物（B）反转录酶在作用时需要DNA聚合酶，而后者需要引物A、末端转移酶B、反转录酶C、DNA 连接酶D、限制酶4、下列DNA片段，最可能含有SstI 酶切位点的是（A）ＡGGAGAGCCTCT ＢGAGCACA TCT ＣCCCTGTGGGAＤA TCCTACATG ＥAACCTTGGAADNA连接酶的作用特点有哪些？1、DNA 3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）2、需要能量、Mg2+3、被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分4、只封闭双螺旋DNA骨架上的nick大肠杆菌DNA聚合酶I有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值。

1、5’—3’聚合酶活性：以DNA为模板利用四种dNTP合成DNA链2、3’—5’外切酶活性：主要起校对作用3、5’—3’外切酶活性：从5’端降解DNA分子何谓Star activity？简述Star activity 的影响因素及克服方法？限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。

当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，称为星号（*）活性。

（1）高甘油含量（>5％, v／v）；（2）限制性内切核酸酶用量过高（>100U／ugDNA）；（3）低离子浓度（<25 mmol／L）；（4）高pH（8.0以上）；（5）含有机溶剂，如DMSO（二甲基亚砜），乙醇等；（6）有非Mg2+的二价阳离子存在（如Mn2+，Cu2+，Co2+，Zn2+等）。

基因工程作业(引物设计)讲解

口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）一、选择原因及应用口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）在蛋白和mRNA的表达水平，揭示其与口腔鳞癌（OSCC）发生、发展的关系。

方法采用免疫组织化学法和原位杂交技术检测46例OSCC标本、15例口腔黏膜白斑与20例正常口腔黏膜标本中MTAl 基因的表达水平，并分析其与OSCC临床病理学参数的关系。

结果MTA1蛋白和MTA1mRNA在OSCC组织中的表达水平显著高于口腔黏膜白斑和正常口腔黏膜（P 〈0．05），口腔黏膜白斑中MTA1蛋白和MTA1mRNA表达水平显著高于口腔正常黏膜（P〈0．01），MTA1蛋白和MTA1mRNA表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移密切相关（P〈0．05）。

结论MTA1基因在蛋白和mRNA的表达水平在OSCC发生、发展及浸润转移过程中起一定促进作用，有望成为判断OSCC预后及选择治疗方案的一个新肿瘤标志物。

二、2查阅NCBI得到MTA1相关信息并获得目的基因PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla metastasis associated 1 (MTA1), mRNANCBI Reference Sequence: XM_004055801.1FASTA GraphicsLOCUS XM_004055801 2872 bp mRNA linear PRI 03-DEC-2012DEFINITION PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla metastasis associated 1 (MTA1),mRNA.ACCESSION XM_004055801VERSION XM_004055801.1 GI:426378238KEYWORDS .SOURCE Gorilla gorilla gorilla (western lowland gorilla) ORGANISM Gorilla gorilla gorillaEukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini;Catarrhini; Hominidae; Gorilla.COMMENT MODEL REFSEQ: This record is predicted by automated computationalanalysis. This record is derived from a genomic sequence(NW_004005914) annotated using gene prediction method: GNOMON,supported by mRNA and EST evidence.Also see:Documentation of NCBI's Annotation Process##Genome-Annotation-Data-START##Annotation Provider :: NCBIAnnotation Status :: Full annotationAnnotation Version :: Gorilla gorilla Annotation Release 100Annotation Pipeline :: NCBI eukaryotic genome annotation pipelineAnnotation Method :: Best-placed RefSeq; Gnomon Features Annotated :: Gene; mRNA; CDS; ncRNA##Genome-Annotation-Data-END##FEATURES Location/Qualifierssource 1..2872/organism="Gorilla gorilla gorilla"/mol_type="mRNA"/sub_species="gorilla"/db_xref="taxon:9595"/chromosome="14"gene 1..2872/gene="MTA1"/note="Derived by automated computational analysis usinggene prediction method: GNOMON. Supporting evidence/codon_start=1/product="metastasis-associated protein MTA1"/protein_id="XP_004055849.1"/db_xref="GI:426378239"/db_xref="GeneID:101134898"/translation="MAANMYRVGDYVYFENSSSNPYLIRRIEELNKTANGNVEAKVVC FYRRRDISSTLIALADKHATLSVCYKAGPGADNGEEGEIEEEMENPEMVDLPEKLKHQ LRHRELFLSRQLESLPATHIRGKCSVTLLNETESLKSYLEREDFFFYSLVYDPQQKTL LADKGEIRVGNRYQADITDLLKEGEEDGRDQSKLETKVWEAHNPLTDKQIDQFLVVAR SVGTFARALDCSSSVRQPSLHMSAAAASRDITLFHAMDTLHKNIYDISKAISALVPQG GPVLCRDEMEEWSASEANLFEEALEKYGKDFTDIQQDFLPWKSLTSIIEYYYMWKTTD RYVQQKRLKAAEAESKLKQVYIPNYNKPNPNQISVNNVKAGVVNGTGAPGQSPGAGRA CESCYTTQSYQWYSWGPPNMQCRLCASCWTYWKKYGGLKMPTRLDGERPGPNRSNMSP HGLPARSSGSPKFAMKTRQAFYLHTTKLTRIARRLCREILRPWHAARHPYLPINSAAI KAECTARLPEASQSPLVLKQAVRKPLEAVLRYLETHPRPPKPDPVKSVSSVLSSLTPA KVAPVINNGSPTILGKRSYEQHNGVDGNMKKRLLMPSRGLANHGQTRHMGPSRNLLLN GKSYPTKVRLIRGGSLPPVKRRRMNWIDAPDDVFYMATEETRKIRKLLSSSETKRAAR RPYKPIALRQSQALPLRPPPPAPVNDEPIVIED" ORIGIN1 tcctcctctt cctctcccgc ccgcgccgcg gccctcccgt ccctgcgcgg cctcggcggc61 ctcggcggcg gcggcggcgg cggcggcagc agcgcggccc ctttaaacgc ctgcggcgccgcgccgagcg ccgcgcccgcaacatgtaca gggtcggaga241 ctacgtctac tttgagaact cctccagcaa cccatacctg atccggagga tcgaggagct301 caacaagacg gccaatggga acgtggaggc caaagtggtg tgcttctacc ggaggcggga361 catctccagc accctcatcg ccctggccga caagcacgca accctgtcag tctgctataa421 ggccggaccg ggggcggaca acggcgagga aggggaaata gaagaggaaa tggagaatcc481 ggaaatggtg gacctgcccg agaaactaaa gcaccagctg cggcatcggg agctgttcct541 ctcccggcag ctggagtctc tgcccgccac gcacatcagg ggcaagtgca gcgtcaccct601 gctcaacgag accgagtcgc tcaagtccta cctggagcgg gaggatttct tcttctattc661 tctagtctac gacccacagc agaagaccct gctggcagat aaaggagaga ttcgagtagg721 aaaccggtac caggcagaca tcaccgactt gttaaaagaa ggcgaggagg atggccgaga781 ccagtccaag ttggagacca aggtgtggga ggcgcacaac ccactcacag acaagcagat841 cgaccagttc ctggtggtgg cccgctctgt gggcaccttc gcacgggccc tggactgcag901 cagctccgtc cgacagccca gcctgcacat gagcgccgca gctgcctccc gagacatcac961 gctgttccac gccatggata ctctccacaa gaacatctat gacatctcca aggccatctc1021 ggcactggtg ccgcagggcg ggcccgtgct ctgcagggac gagatggagg agtggtctgc1081 atcagaggcc aaccttttcg aggaagccct ggaaaaatat gggaaggatt tcacggacat1141 tcagcaagat tttctcccgt ggaagtcgct gaccagcatc attgagtact actacatgtg1201 gaagaccacc gacagatacg tgcagcagaa acgcttgaaa gcagctgaag ctgagagcaa1261 gttaaagcaa gtttatattc ccaactataa caagccaaat ccgaaccaaa tcagtgtcaa1321 caacgtcaag gccggtgtgg tgaatggcac gggggcgccg ggccagagcc ctggggctgg1381 ccgggcctgc gagagctgtt acaccacaca gtcttaccag tggtattctt ggggtccccc1441 taacatgcag tgtcgtctct gcgcatcttg ttggacatat tggaagaaat atggtggctt1501 gaaaatgcca acccggttag atggagagag gccaggacca aaccgcagta acatgagtcc1561 ccacggcctc ccagcccgga gcagcgggag ccccaagttt gccatgaaga ccaggcaggc1621 tttctatctg cacacgacga agctgacgcg gatcgcccgg cgcctgtgcc gtgagatcct1681 gcgcccgtgg cacgctgcgc ggcaccccta cctgcccatc aacagtgcgg ccatcaaggc1741 cgagtgcacg gcgcggctgc ccgaagcctc ccagagcccg ctggtgctga agcaggcggt1801 acgcaagccg ctggaagccg tgcttcggta tcttgagacc cacccccgtc cccccaagcc1861 tgaccccgtg aaaagcgtgt ccagcgtgct cagcagcctg acgcccgcca aggtggcccc1921 cgtcatcaac aacggctccc ccaccatcct gggcaagcgc agctacgagc agcacaacgg1981 ggtggacggc aacatgaaga agcgcctctt gatgcccagt aggggtctgg caaaccacgg2041 acagaccagg cacatgggac caagccggaa cctcctgctc aacgggaagt cctaccccac2101 caaagtgcgc ctgatccggg ggggctccct gcccccagtc aagcggcggc ggatgaactg2161 gatcgacgcc ccggatgacg tgttctacat ggccacagag gagaccagga agatccgcaa2221 gctgctctca tcctcggaaa ccaagcgtgc tgcccgccgg ccctacaagc ccatcgccctgcgcccgtca acgacgagccgccccccgcc cctcgcccgc2401 ccacacggcc ccttcccagc cagcccgccg cccgcccctc agtttggtag tgccccacct2461 cccgccctca cctgcagaga aacgcgctcc ttggcggaca ctgagggagg agaggaagaa2521 gcgcggctaa cttattccga gaatgccgag gagttgtcgt ttttagcttt gtgtttactt2581 tttggctgga gcggagatga ggggccaccc cgtgcccctg tgctgcgggg ccttttgccc2641 ggaggccggg ccctaaggtt ttgttgtgtt ctgttgaagg tgccgtttta aattttattt2701 ttattacttt ttttgtagat gaacttgagc tctgtaactt acacctggaa tgttaggatc2761 gtgcggccgc ggccggccga gctgcctggc ggggttggcc cttgtctttt caagtaattt2821 tcatattaaa caaaaacaaa gaaaaaaatc ttataaaaag gaaaaaaacc aa//三、表达载体的选择我所选用的原核表达载体为质粒pBR322；pBR322 是一种常用的E. coli 克隆载体（1），为4,361 bp 的环状双链DNA（2）。

引物设计

无任何特异性
03
目的基因的获取-PCR引物设计
特异引物设计：
通用引物设计：
1、扩增的完整序列完全已知 1、扩增保守的同源基因
2、扩增序列长度要≥CDS
2、扩增序列长度一般<CDS
3、引物长度18-22，得分高
3、一般测序用
4、要blast
4、不用个人设计
5、测序时要提供引物，连到T载 5、测序不需要提供引物
03
PART THREE
引物设计原则和方法
03
目的基因的克隆
基因工程的主要目的是把经过遗传学和分子生物学前期研究探明了结构与功能的靶基因（target gene）转导宿主细胞中表达，以大量获取该基因的产物或改变宿主性状。由此可见，如何分离得到靶基因是基因工程操作的关键步骤之一，否则“巧妇难为无米之炊”。
序不好进行
3、随机6或9个mers
4、要获得完整基因要做步移
PCR或反向PCR或测完整基因组
03
目的基因的获取-PCR引物设计
引物设计软件： 1、Oligo 6 2、Primer premier 5/6 3、Dnastar 4、Primer 3plus（在线）
03
目的基因的获取-PCR引物设计
引物二聚体
发夹结构
03
目的基因的获取-PCR引物设计
引物设计种类：
引物
克隆引物表达引物
特异引物Specific
primers
只扩增某一类基因或生物
通用引物Universal 与基因两端基因匹配（载体）
Primers
兼并引物Degenerate 可以扩增某一类相似基因
Primers
随机引物
Random primers

基因工程实验操作作业指导书

基因工程实验操作作业指导书前言：在进行基因工程实验操作之前，请确保已经具备相应的实验知识和技能，并遵守实验室的安全规定。

本实验操作指导书将详细介绍基因工程实验的步骤和注意事项，以确保实验顺利进行。

一、实验前准备1.确认实验的目的和所需材料：确定需要进行的基因工程实验目标，并准备所需的各种试剂、细胞培养物和实验器材。

2.实验室安全措施：穿戴实验室要求的个人防护装备，遵守实验室的规章制度。

确保实验室电源和排风系统正常运行。

二、实验步骤1.基因克隆a) DNA提取：从源生物体中提取DNA样本，利用适当的提取方法将DNA纯化并获得高质量的DNA。

b) PCR扩增：设计引物，进行PCR扩增反应，使目标基因扩增到所需的浓度。

c) 酶切：使用限制性内切酶对目标基因和载体进行酶切，创建黏性末端适配体。

d) 连接：将目标基因与载体连接，形成重组DNA。

e) 转化：将重组DNA转化到适宜的宿主细胞中，使其能够被宿主细胞内的酶复制和表达。

2.细胞培养a) 培养基准备：根据实验需求制备适宜的培养基。

b) 细胞传代：将宿主细胞进行传代，以保持活性和生长状态。

c) 质粒提取：从转化后的细菌中提取质粒DNA，作为后续实验的样本。

d) 菌液预处理：将细菌培养物进行适当的处理，如离心、洗涤等。

3.基因表达a) 表达培养条件控制：设置适宜的温度、培养时间和培养基成分，以获得高效的基因表达。

b) 转录与翻译：利用适当的启动子和加入适量的诱导剂，实现基因转录和翻译。

c) 蛋白质纯化：根据需要，对表达的蛋白质进行纯化，确保其纯度和活性。

4.实验结果分析a) 凝胶电泳：使用凝胶电泳分析方法，判断基因工程实验的成功与否。

b) 荧光检测：通过荧光标记的方法检测基因表达程度。

c) 其他分析方法：根据实验目的及需求，选择适当的分析方法进行结果分析。

三、实验操作注意事项1.实验室安全：佩戴手套、实验外套、护目镜等个人防护装备，避免实验材料和试剂对人体造成伤害。

基因工程pcr引物设计原则

基因工程pcr引物设计原则### PCR Primer Design Principles for Gene Engineering.PCR primer design is critical for successful gene engineering experiments. Well-designed primers ensure efficient and specific amplification of the target DNA sequence. Here are some key principles of PCR primer design:1. Specificity: Primers should be designed to bind specifically to the target DNA sequence. This is achievedby choosing primers with sequences complementary to theends of the target region. Mismatches between the primerand target sequence can lead to non-specific amplificationor primer-dimer formation.2. Melting Temperature (Tm): The Tm is the temperatureat which half of the primer molecules are bound to thetarget DNA sequence. Primers with Tm values close to the annealing temperature (Ta) ensure efficient primer binding without compromising specificity. Generally, the Tm shouldbe between 55-65°C.3. Length: Primers should be around 18-25 nucleotides long. Longer primers provide more specificity but can be difficult to synthesize. Shorter primers are easier to synthesize but can have lower specificity.4. GC Content: Primers with a GC content of 40-60% are optimal. Higher GC content can increase Tm, while lower GC content can decrease Tm.5. Avoid Secondary Structures: Primers should be designed to minimize the formation of secondary structures such as hairpins or dimers. These structures can interfere with primer binding and amplification efficiency.6. Use Degenerate Primers for Mismatched Targets: If the target DNA sequence has mismatches or is unknown, degenerate primers can be used. Degenerate primers contain ambiguous nucleotides (e.g., N or I) that can bind to multiple target sequences.### 中文回答：基因工程 PCR 引物设计原则。

引物设计的详细步骤

引物设计的详细步骤引物设计是一项关键的实验技术，用于在分子生物学实验中扩增目标DNA片段。

该技术的成功与否直接影响到实验结果的准确性和可靠性。

以下是引物设计的详细步骤：1.确定目标DNA序列：首先，确定需要扩增的目标DNA序列。

这可以通过已知的参考序列、文献调研或基因数据库进行。

2.定位扩增区域：根据目标DNA序列，确定需要扩增的特定区域。

通常选择在该区域中的保守性较高的片段，以确保引物的特异性。

3. 确定引物长度：引物长度通常为18-25个核苷酸（nt），最好不超过30nt。

引物长度的选择是为了确保引物在反应温度下的特异性和稳定性，同时不会引起非特异扩增。

4.碱基组成与G/C含量：引物的碱基组成应平衡，避免过多的同质二聚物和结构异常。

G/C含量一般在40-60%之间，过高或过低的G/C含量可能会导致引物与模板DNA结合的效力降低。

5.特异性：使用基因序列数据库或引物设计软件进行引物BLAST比对，确保引物与目标DNA序列的独特性。

6. 避免互补引物间的二聚体形成：引物间不能有太多相互衔接的序列，以免引物自身形成二聚体。

通常应避免引物间的结合自由能低于-9 kcal/mol。

7.避免引物内部二聚体的形成：通过引物设计软件计算引物的内部二聚体结合自由能，避免过多的二聚体形成。

8.引物末端设计：通常引物的末端应设计在较保守的区域，以确保扩增的特异性。

9.引物的副产物与杂交：避免引物自身产生副产物以及与其他非特异目标DNA序列杂交。

10.引物设计验证：使用引物设计软件对设计的引物进行验证，包括引物特异性、二聚体和杂交等。

11.引物合成：通过合成引物的商业公司进行引物合成，选择信誉好的厂家。

12.引物纯化：使用聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法对引物进行纯化。

13.引物浓度测定：使用紫外分光光度计等方法测定引物的浓度。

总之，引物设计是一项细致而复杂的步骤，需要考虑多个因素，如目标DNA序列，引物长度，碱基组成，特异性和二聚体等。

基因工程选引物的典型例题及解析

基因工程选引物的典型例题及解析基因工程是一门前沿的生物学技术，它涉及到对生物体的基因进行改造和调控。

在基因工程中，选取合适的引物是至关重要的一步，因为引物的选择直接影响到基因工程的成功与否。

下面我们将以典型例题及解析的方式来讨论基因工程选引物的重要性和方法。

典型例题：假设你需要在实验室中进行一项基因工程实验，要求你设计引物来扩增目标基因。

目标基因的序列如下：5'-ATGCTAGCTAGCTAGCATG-3'。

请设计适合的引物序列。

解析：在设计引物时，需要考虑引物的长度、GC含量、配对性和特异性。

在这个例题中，我们需要设计一对引物来扩增目标基因。

首先，我们需要选择两个合适长度的引物序列，通常引物的长度在18-25个碱基对之间。

其次，引物的GC含量应该在40-60%之间，以确保引物的稳定性和特异性。

最后，引物的配对性和特异性也是非常重要的，避免引物与非目标序列产生杂交反应。

根据上述要求，我们可以设计如下两个引物序列：引物1，5'-ATGCTAGCTAGCTAGC-3'。

引物2，5'-CATGCTAGCTAGCTAGC-3'。

这两个引物序列分别位于目标基因的起始和终止序列上，长度适当，GC含量合适，并且具有良好的特异性和配对性。

在基因工程实验中，选取合适的引物是成功的关键之一。

通过合理的引物设计，可以有效地扩增目标基因，为基因工程实验的顺利进行提供了重要保障。

总结：基因工程中选取合适的引物是至关重要的一步，它直接影响到基因工程实验的成功与否。

在设计引物时，需要考虑引物的长度、GC含量、配对性和特异性等因素，并且要根据目标基因的序列特点来进行合理的选择和设计。

只有通过精心设计的引物才能确保基因工程实验的顺利进行，为相关研究和应用提供坚实的基础。

基因引物的设计

四、引物与PCR
引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L（公司合成以后，干粉状，先离心，按照说明上加入无菌水溶解）
PCR程序中退火温度：一般采用引物Tm值低5度作为PCR退火温度
五、引物设计软件
最常用的软件是Primer Premier 网站设计软件手动设计
NCBI网站设计引物
6、引物5’端
引物的5’端可以有与模板DNA不配对碱基因此5’可以引入一段非模板依赖序列
加上限制性核酸内切酶位点序列修改某个碱基，引入该位点的点突变以作研究标记放射性或者非放射性物质（地高辛等）
7、扩增区域的二级结构
如果模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使引物设计区域避开 DNA这些区域
手动设计引物
六、引物同源性分析
用BLASTn软件进行同源性比较
✓尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物 ✓选择3’端与非目的基因不同源的序列作为引物 ✓选择两个引物3’端与同一非目的基因不同源的序列
作为引物
练习：以人类PIWIL2的mRNA序列为例，设计 RT-PCR引物2对，产物大小为150-250bp
综合练习：在NCBI网站上查找人类BRCA2基因的DNA 序列和mRNA序列，并查找该基因序列多态性与乳腺癌、卵巢癌的关系相关论文，针对论文报道的多态性区域进行引物设计。
Thanks！
4、引物二级结构
引物二聚体 ------尽可能避免两个引物之间3’端有较多碱基互补发夹结构 -------尤其要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸
5、引物3’端
引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败

引物设计实验报告

引物设计实验报告引言引物设计是分子生物学和遗传学研究中的关键步骤之一。

引物是一段特定序列的DNA或RNA片段，用于在聚合酶链式反应（PCR）等实验中定向放大或检测特定的目标序列。

本实验旨在通过合理的引物设计，实现目标序列的选择性扩增，为后续实验与研究提供基础。

实验目的本实验的目的是通过学习引物设计的基本原理和方法，掌握引物的设计步骤，实现对目标序列的选择性扩增。

实验材料与方法实验材料•目标序列：通过测序技术获得的待扩增的DNA序列。

•引物设计软件：如Primer3等提供的引物设计工具。

实验方法1.获取目标序列：使用测序技术获取待扩增的DNA序列，并记录下来。

2.引物设计软件：选择一款合适的引物设计软件，如Primer3等。

3.引物设计参数设置：根据实验需求，设置引物设计的参数，如引物长度、GC含量、Tm值等。

4.引物设计：根据目标序列，在引物设计软件中输入相关信息进行引物设计，生成合适的引物序列。

5.引物评估：使用引物评估软件（如OligoAnalyzer等）评估所设计引物的性能，包括互补性、二聚体形成等。

6.引物合成：将合适的引物序列提交给合成公司进行引物合成。

7.引物验证：使用PCR等技术验证所设计的引物是否能成功扩增目标序列。

实验结果与讨论通过以上的实验方法，我们成功地设计了一对合适的引物，并利用PCR技术进行了验证。

我们发现，所设计的引物能够选择性地扩增目标序列，而不会引起非特异性扩增。

在引物设计过程中，我们需要注意以下几点：- 引物长度：引物的长度应适中，通常选择15-25个碱基对。

- GC含量：引物中GC含量的选择对扩增效果有重要影响，一般控制在40-60%之间。

- Tm值：引物的熔解温度（Tm值）应相近，避免引物间的二聚体形成。

- 引物特异性：通过引物评估软件进行评估，确保引物与非目标序列无或低互补性。

- 引物合成：选择可靠的引物合成公司进行合成，确保引物的质量。

引物设计的成功与否对后续实验的可靠性和准确性具有重要影响。

基因工程入门-引物设计

引物设计1,序列gene 252709..253161/gene="yafP"/locus_tag="b0234"/note="synonyms: ECK0235, JW0224"/db_xref="ECOCYC:G6118"/db_xref="EcoGene:EG13153"/db_xref="GeneID:944912"CDS 252709..253161/gene="yafP"/locus_tag="b0234"/codon_start=1/transl_table=11/product="predicted acyltransferase with acyl-CoA N-acyltransferase domain"/protein_id="NP_414769.1"/db_xref="GI:16128220"/db_xref="ASAP:ABE-0000801"/db_xref="UniProtKB/Swiss-Prot:Q47158"/db_xref="ECOCYC:G6118"/db_xref="EcoGene:EG13153"/db_xref="GeneID:944912"在DNA序列文件中找到相应的序列252709..253161 252661 attgggaaaa tggcagaagc gtttcgcatg cgtttttgaa tttatattat gaataacata252721 caaataagaa actatcagcc tggcgatttt cagcaactat gcgctatttt cattagagcg252781 gttacgatga ccgccagtca gcattattca ccacaacaaa tttccgcctg ggcgcagatt252841 gacgaatctc gctggaagga gaaactcgcg aaatcacaag tgtgggttgc gatcattaat252901 gcacaaccgg ttggttttat ttcccgcatt gaacattata tcgatatgtt atttgttgac252961 cctgaataca cccgccgtgg ggttgccagc gctttgttaa aacctttgat taagtctgaa253021 tccgaactta cggtggacgc aagcataacc gcaaaaccct tttttgaacg ttatggtttt253081 cagacagtta agcagcagcg cgttgaatgc cggggagcgt ggtttactaa tttttatatg253141 cgatataaac cgcaacatta aatccagctt gcaatgaaaa taacgcccgc ctggtatgtgORF去除空格、回车键，数字后和多余碱基的序列atgaataacatacaaataagaaactatcagcctggcgattttcagcaactatgcgctattttcattagagcg gttacgatgaccgccagtcagcattattcaccacaacaaatttccgcctgggcgcagattgacgaatctcgctggaaggagaaactcgcgaaatcacaagtgtgggttgcgatcattaatgcacaaccggttggttttatt tcccgcattgaacattatatcgatatgttatttgttgaccctgaatacacccgccgtggggttgccagcgctt tgttaaaacctttgattaagtctgaatccgaacttacggtggacgcaagcataaccgcaaaacccttttttga acgttatggttttcagacagttaagcagcagcgcgttgaatgccggggagcgtggtttactaatttttatatg cgatataaaccgcaacattaa搜索Bam HI和Hin dIII 位点结果如下发现基因中不存在Bam HI和Hin dIII 位点，故正反向引物的5’端分别引入Bam HI 和Hin dIII序列ORF的检查：利用DNASIS软件的Translate功能将核苷酸Internet Explorer.lnk信息翻译成为氨基酸序列，ATG为起始密码子。

引物设计流程之基因编码区扩增引物设计

引物设计流程之基因编码区扩增引物设计基因编码区（CDS）扩增引物设计是在研究过程中常常使用的一种技术。

通过设计合适的引物序列，可以扩增出感兴趣的基因编码区域，进而进行后续的实验或分析。

下面将介绍基因编码区扩增引物设计的流程，并详细讨论其中的关键步骤。

1. 确定扩增范围：首先，需要明确要扩增的基因编码区域。

可以根据已知的基因序列，选择感兴趣的片段进行扩增。

可以使用已有的基因序列数据库（如GenBank、Ensembl等）进行和筛选，或者利用已有的文献报道来确定扩增范围。

在确定扩增范围时，需要考虑现有的引物设计规则，如避开带有重复序列、剪切位点或调控元件的区域。

2.引物设计：引物设计是基因编码区扩增的关键步骤之一、引物通常包括两个部分：扩增前端引物和扩增后端引物。

前端引物与基因的5'端序列互补匹配，后端引物与基因的3'端序列互补匹配。

在引物的设计中，有几个关键点需要考虑：a.引物长度：一般来说，引物的长度应在18-24个碱基对之间。

引物太短可能导致扩增特异性下降，引物太长可能导致反应效率降低。

b.GC含量：GC含量是引物设计中重要的考虑因素之一、一般来说，引物的GC含量应在40-60%之间。

GC含量高的引物更稳定，但可能导致特异性下降；GC含量低的引物则可能导致引物和模板结合的稳定性下降。

c.末端碱基：引物的末端碱基应尽可能选择A或T，以提高引物的特异性。

d. 引物二聚体和自身结合：在设计引物时，需要检查引物之间是否存在二聚体和引物与自身之间是否存在结合。

可以使用计算工具（如IDTOligoAnalyzer）进行预测和优化，确保引物之间和引物与自身之间没有相互结合的问题出现。

3.引物特异性和重复性分析：在设计引物后，需要进行引物特异性和重复性分析。

特异性分析是为了确保引物只扩增目标基因编码区域，不扩增其他非目标区域的DNA序列。

可以使用BLAST等工具进行引物序列的比对和筛选，以确保引物的特异性。

基因克隆引物设计步骤

基因克隆引物设计步骤基因克隆是指将感兴趣的基因从一个生物体中转移到另一个生物体中的过程。

在基因克隆中，引物是必不可少的工具，它们作为DNA扩增的起始序列，帮助将目标基因扩增出来。

引物的设计是基因克隆的关键步骤之一，下面是基因克隆引物设计的详细步骤。

1.确定目标基因序列：首先要确定你想要克隆的基因序列。

可以根据已有的序列资料获得，也可以通过测序等技术获得此序列。

2.选择扩增方法：根据实验需求选择适合的扩增方法。

常见的扩增方法有PCR、RT-PCR、RACE等。

3.获取引物序列：根据目标基因序列，设计引物序列。

引物通常由两个部分组成：前向引物和反向引物。

前向引物与目标序列的上游区域互补，反向引物与目标序列的下游区域互补。

引物长度通常为18-22个碱基对。

4.引物设计原则：-引物长度：引物长度应在18-22个碱基对之间，过短则会导致特异性降低，过长则会导致引物的结构稳定性下降。

-GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低的GC含量会导致引物的熔解温度变化，降低引物与目标序列的互补性。

-特异性：引物应具有高度的特异性，避免与其他基因或非目标序列发生互补。

5.避免引物二聚体和髙聚物的形成：-引物二聚体：引物二聚体是指两个引物之间通过碱基配对形成的复合物。

二聚体的形成会导致PCR扩增效率降低甚至完全失败。

要避免引物二聚体的形成，可以使用引物设计软件进行计算和优化。

-引物髙聚物：引物髙聚物是指引物之间互相结合形成的长链。

髙聚物的形成会抑制PCR扩增的产物的生成，同样可使用引物设计软件进行计算和优化。

6.核酸序列分析软件的使用：核酸序列分析软件可以帮助你检查设计引物的性能，如特异性、互补性等。

常用的软件有Primer3、Oligo Analyzer等。

7.引物合成：找到合适的引物序列后，可以将其提交给寡核苷酸合成机构进行合成。

合成的引物会被送到实验室进行后续的基因克隆实验。

总结起来，基因克隆引物设计的关键是确定目标基因序列、选择合适的扩增方法、根据引物设计原则设计引物、避免引物二聚体和髙聚物的形成，并使用核酸序列分析软件进行验证。

全基因扩增的引物设计步骤

全基因扩增的引物设计步骤引言全基因扩增（Whole Genome Amplification，WGA）是一种将整个基因组进行扩增的技术，可以从极少量的DNA样本中获得足够的DNA量进行后续实验。

在全基因扩增过程中，引物设计是至关重要的一步，它直接影响扩增效率和特异性。

本文将详细介绍全基因扩增的引物设计步骤。

引物设计步骤1. 确定扩增目标在进行全基因扩增之前，首先需要确定扩增的目标。

可以是整个基因组的扩增，也可以是特定区域的扩增。

根据扩增目标的不同，可以选择不同的引物设计策略。

2. 引物长度选择引物的长度对扩增效率和特异性有重要影响。

通常，引物的长度在18-30个碱基对之间。

较短的引物可以提高扩增效率，但可能会导致非特异性扩增产物的产生；较长的引物可以提高特异性，但可能会降低扩增效率。

3. 引物序列选择引物序列的选择是引物设计中最关键的一步。

以下是引物序列选择的几个要点： - 引物应具有足够的特异性，避免非特异性扩增产物的产生。

可以通过比对基因组数据库或使用引物设计软件来评估引物的特异性。

- 引物的GC含量应适中，一般在40-60%之间。

过高或过低的GC含量可能会影响扩增效率。

- 引物的3’端应尽量避免出现重复序列或富含AT或GC碱基对的序列，以减少扩增的非特异性。

- 引物的3’端还可以加入一些特定的序列，如限制性酶切位点、引物标签等，以方便后续实验操作。

4. 引物的互补性检查在引物设计完成后，需要进行引物的互补性检查。

引物之间的互补性可能会导致二聚体的形成，影响扩增效率和特异性。

可以使用引物设计软件或进行体外实验来检查引物之间的互补性。

5. 引物的合成合成引物时，可以选择商业合成或自行合成。

在合成引物时，需要注意以下几个问题： - 引物的纯度要求较高，以避免污染对扩增结果的影响。

- 引物的浓度要适中，一般在10-100 μM之间。

引物设计实例以下是一个全基因扩增引物设计的实例：1.扩增目标：整个基因组的扩增。

基因工程引物设计-lhy

植物表达载体pROKⅡ Ⅱ 植物表达载体
XbaI
35S
BamHI SmaI
KpnI
SacI
确定酶切位点 BamHⅠ:GGA TCC Ⅰ
SacⅠ ：GAGCTC Ⅰ
同时在正链上设计3端及端引物同时在正链上设计端及5端引物端及
上游：上游：5`-ATGGCAGGCTCTTCCGCCCT-3` 下游: 下游５`-ACTGCTCCAGGGTGAAGTGA-３` ３
引物设计之浅谈
PCR
过
程
内容
引物设计的原则 Primer premier 5.0的使用的使用植物表达载体引物设计原核表达载体引物设计酵母表达载体引物设计
一、引物设计的原则
引物长度
• 一般为一般为15-30个核苷酸在做长片段个核苷酸. 个核苷酸 PCR或做某些特殊的或做某些特殊的PCR时应使用较或做某些特殊的时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸个核苷酸。长的引物，但最多不超过个核苷酸。
• 注意事项注意事项:
产生融合蛋白，产生融合蛋白，基因的插入不能影响蛋白的正常翻译．蛋白的正常翻译．
多克隆位点：多克隆位点：
BamH I EcoR I Sac I Sal I Hind III Not I Xho I GGA TCC GAA TTC GAG CTC CGT CGA CAA GCT TGC GGC CGC ACT CGA G Gly Ser Glu Phe Glu Leu Arg Arg Gln Ala Cys Gly Arg Thr Arg A
引物二级结构
• 引物二聚体
–尽可能避免两个引物分子之间3’端有较多碱基互补
• 发夹结构

《基因引物设计》课件

引物的长度一般在15-30bp之间，根据目标基因序列的特性和实验要求选择合适的长度。
选择合适的引物序列
避免引物二聚体和发夹结构
引物的序列应与目标基因序列完全互补，且在3’端应有一个突出的单链区域，以便于DNA聚合酶的结合和延伸。
引物自身不能形成二聚体或发夹结构，否则会影响引物的结合和DNA聚合酶的延伸。
2023
PART 03
基因引物设计的实践应用
REPORTING
基因克隆与表达
基因克隆
基因引物设计是基因克隆过程中的关键步骤，通过设计特异性的引物，可以实现对目标基因的特异性扩增，进而进行克隆和表达。
VS
基因表达
在基因表达方面，基因引物设计可用于检测基因的表达水平，通过设计特异性引物，对特定基因的表达产物进行扩增和检测，从而了解该基因的表达情况。
2023
PART 02
基因引物设计的基本步骤
REPORTING
选择合适的引物设计软件
总结词
选择合适的引物设计软件是基因引物设计的重要步骤，有助于提高引物设计的效率和准确性。
详细描述
在选择引物设计软件时，应考虑其功能、易用性、准确性和可靠性。一些常用的引物设计软件包括Primer3、Oligo、Beacon Designer等，这些软件可根据用户需求提供不同的引物设计方法和功能。
基因引物设计的重要性
确保基因复制的准确性和完整性
基因引物是DNA复制的起始点，设计合理的引物能够确保复制的准确性和完整性，避免出现突变或缺失。
提高PCR扩增效率
设计合理的基因引物可以提高PCR扩增效率，缩短扩增时间，提高实验效率。
应用于基因克隆、测序等领域

基因工程设计性实验(1)

基因工程设计性实验组员：马瑞冯亚杰余文莉李秦瑾李端友实验目的：掌握PCR过程中引物的设计，PCR体系的设定，以及PCR产物的检测实验原理：引物设计原理：以基因或cDNA的5’→3’方向的单链为标准，确定待扩增片段两侧的引物序列.按5’→3’方向，照抄模板的序列，先写下5’端引物的序列；然后根据模板3’的序列，写下由5’→3’方向的互补链的碱基序列，即为3’引物的序列。

引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性；产物不能形成二级结构；引物长度一般在15~30碱基之间;G+C含量在40%~60%之间；碱基要随机分布;引物5′端可以修饰;引物3′端不可修饰。

PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏94°高温时变性会变成单链，低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右)，DNA 聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链具有灵敏度高，特异性强，操作方便简单等特点。

本实验需扩增的目的基因为cre重组酶，大小为1039bp其基因序列为atggcgggctccaatttactga ccgtacaccaaaatttgcctgcattaccggtcgatgc aacgagtgatgaggttcgcaagaacctgatggacatgttcagggatcgccaggcgtttt ctgagcatacctggaaaatgcttctgtccgtttgccggtcgtgggcggcatggtgcaag ttgaataaccggaaatggtttcccgcagaacctgaagatgttcgcgattatcttctata tcttcaggcgcgcggtctggcagtaaaaactatccagcaacatttgggccagctaaaca tgcttcatcgtcggtccgggctgccacgaccaagtgacagcaatgctgtttcactggtt atgcggcggatccgaaaagaaaacgttgatgccggtgaacgtgcaaaacaggctctagc gttcgaacgcactgatttcgaccaggttcgttcactcatggaaaatagcgatcgctgcc aggatatacgtaatctggcatttctggggattgcttataacaccctgttacgtatagcc gaaattgccaggatcagggttaaagatatctcacgtactgacggtgggagaatgttaat ccatattggcagaacgaaaacgctggttagcaccgcaggtgtagagaaggcacttagcc tgggggtaactaaactggtcgagcgatggatttccgtctctggtgtagctgatgatccg aataactacctgttttgccgggtcagaaaaaatggtgttgccgcgccatctgccaccag ccagctatcaactcgcgccctggaagggatttttgaagcaactcatcgattgatttacg gcgctaaggatgactctggtcagagatacctggcctggtctggacacagtgcccgtgtc ggagccgcgcgagatatggcccgcgctggagtttcaataccggagatcatgcaagctgg tggctggaccaatgtaaatattgtcatgaactatatccgtaacctggatagtgaaacaggggcaatggtgcg cctgctggaagatggcgattag本实验设计的引物为：正向引物：5'ATGGCGGGCTCCAATTTACTGA 3' 22nt反向引物：5'CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG 3' 22ntPCR的原理和反应体系(50微升)dNTP 4µl正向引物（10µM） 4ul反向引物（10µM） 4ul模板 0.1ul10XBuffer 5µlTaq DNA 聚合酶 2ulddH2O 31µl实验材料:PCR仪，PCR管，移液器和枪头，琼脂糖，电泳仪，TaqDNA聚合酶，10×kod Buffer，dNTP，引物，ddH2O，荧光灯箱。

引物设计知识点归纳总结

引物设计知识点归纳总结引物设计是分子生物学和基因工程领域中非常重要的一项技术。

合理设计的引物能够用于聚合酶链式反应（PCR）、DNA测序、基因克隆等实验操作，对实验结果的准确性和可靠性起到至关重要的作用。

本文将对引物设计的关键知识点进行归纳总结。

一、引物的基本原理在开始介绍引物设计的具体知识点之前，我们首先需要了解引物的基本原理。

引物是一串能够与目标DNA序列特异性结合的短链核酸分子。

在PCR等实验中，引物通过与DNA序列的互补配对，在酶的催化下引导合成新的DNA链。

因此，引物的设计需要考虑以下几个方面：1. 引物长度：一般来说，引物的长度在18-30个碱基对左右。

过短的引物可能导致非特异性引物结合，而过长的引物则会增加实验成本和复杂性。

2. 引物GC含量：引物的GC含量对引物的特异性和结合稳定性有一定影响。

通常来说，引物的GC含量在40% - 60%之间较为合适。

3. 引物特异性：引物设计的最重要原则是要确保引物与目标DNA序列能够特异性结合。

这就需要通过合理的选择引物序列，避免引物与非目标序列发生配对。

二、引物设计中的重要考虑因素在引物设计中，需要综合考虑多个因素，以确保引物在实验中的成功应用。

以下是引物设计中的一些重要考虑因素：1. 引物的互补性：引物应该具有高度的互补性，即引物序列与目标DNA序列的互补配对部分要尽可能多。

这有助于提高引物与模板DNA 的结合能力。

2. 引物的内部结构：引物在设计时，需避免存在自身内部结合部分，即引物序列中不应出现太多连续的互补序列，以防止引物在实验中形成二聚体或多聚体。

3. 引物的Tm值：引物的熔解温度（Tm值）是指引物与目标DNA序列之间的双链分离温度。

引物的Tm值需要根据所需实验条件和目标DNA序列的碱基组成来确定，以保证引物与目标DNA能够在适当的温度下进行特异性结合。

4. 引物的特异性：在引物设计中，需要进行引物序列的BLAST（基础局部比对搜索工具）检测，以确保引物序列与非目标序列不存在高度相似之处，避免产生假阳性结果。