郜刚分子生物学-03-染色体-2包装和半保留复制-1

D、
引物酶 华中科技大学2004年生物化学与分子生物学 硕士研究生入学试题 名词解释 ：冈崎片段（3分）
DNA聚合酶详解
大肠杆菌DNA聚合酶I
3’模板链 3’
Arthur Kornberg (1918-2007) is an American biochemist who won the Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959 for his discovery of "the mechanisms in the biological synthesis of deoxyribonucleic acid (DNA)" together with Dr. Severo Ochoa of New York University. He has also been awarded the Paul-Lewis Laboratories Award in Enzyme Chemistry from the American Chemical RNA引物 Society in 1951, L.H.D. degree from Yeshiva University in 1962, as well as National Medal of Science in 1979.
5、 DNA聚合酶:以DNA为模板的DNA合成酶 ●以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物催化合成DNA
●反应需要有模板和引物的指导 ●反应需要有3′-OH存在,催化dNTP加到生长中的DNA 链的3'-OH末端 ●DNA链的合成方向为5 ′ → 3 ′
最早在大肠杆菌中发现，以后陆续在其他原核生物及微生物中找到。下面首先介绍 大肠杆菌的DNA聚合酶，然后简略说明一下其他原核生物的DNA聚合酶和真核生 物DNA聚合酶。
• 大肠杆菌染色体DNA复制起点oriC
• 它由422bp的DNA片段组成，其核苷酸序列已经搞清。其结构特点该为(1)在oriC区域 内有一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)，这表明区域与复制酶 系统的识别有关(2)在oriC区中还有两个转录启动区(启动子)的核苷酸序列，这暗示了转 录可能在大肠杆菌染色体DNA复制起始着重的作用。目前已有许多实验表明转录确实 是复制的起始所必需的，但具体的作用机制尚不清楚。
大肠杆菌DNA聚合酶1的理化性质2/2
DNAPolⅠ在空间结构上近似球体，直径约650nm。在酶的纵 轴上有一个约200nm的深沟(cleft)，带有正电荷，这是该 酶的活性中心位置，在此位置上至少有6个结合位点: [1]模板DNA结合位点; [2]DNA生长链或引物结合位点; [3]引物末端结合位点，用以专一引物或DNA生长链的3'-OH; [4]脱氧核苷三磷酸结合位点; [5]5'→3'外切酶活性位点，用以结合生长链前方的5'-端脱 氧核苷酸并切除之; [6]3'→5'外切酶活性位点，用以结合和切除生长链上未配 对的3'-端核苷酸。
而在真核生物中，每个DNA分子有许多个复制子，每个复制子长约50200kb。因此，真核细胞DNA的复制是由许多个复制子共同完成的。
ori ori ori
真核复制子1 真核复制子2 原核复制子
复制起点是有特定结构的，不是随 机的
• 既然DNA复制不是随机的从DNA分子上的任何一点起始，而是从特定的区域开始，这 说明复制起点有其结构上的特殊性。分子遗传学者们利用分子克隆技术，分离出
ori ori
OriC in E. coli chromosomal DNA
三个13bp的重复序列 ♦ 三个 的重复序列
四个9bp的重复序列 ♦ 四个 的重复序列 dnaA结合位点 结合位点
若干GATC位点 位点 若干
4、复制子
• DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止，每一 个这样的DNA单位称为复制子或复制单元 (replicon)。在原核生物中，每个DNA分子上就有一个复制子;
ori
大肠杆菌复制起点引发的DNA复制
复制方向等速 起点、
多起点、双向等速 起点、
7、DNA复制的特点---总结
• DNA复制的最主要特点是半保留复制和半不连续复制(Semiondisctinuous replication) • DNA 在进行复制的时候一其中的一条链为模板连开始复制， 经过一系列酶（DNA聚合酶、解旋酶、链接酶等）的作用复 制出新的DNA双螺旋。 子代DNA 其中的一条链是亲代DNA 保留下来的也就是说新合成的DNA 中一条链是新合成的另 一条是亲代DNA留下来的。成为半保留复制。 DNA • 在复制起点两条链解开形成复制泡(replication bubbles)， DNA向两侧复制形成两个复制叉(replication forks)。以复制 叉移动的方向为基准，一条模板链是3'→5'，以此为模板而 进行的新生DNA链的合成沿5'→3'方向连续进行，这条链称 为前导链(leading strand)。另一条模板链的方向为5'→'3'， 以此为模板的DNA合成也是沿5'→3'方向进行，但与复制叉 前进的方向相反，而且是分段，不连续合成的，这条链称为 滞后链(lagging strand)，合成的片段即为冈崎片段。这些冈 崎片段以后由DNA连接酶连成完整的DNA链。这种前导链 的连续复制和滞后链的不连续复制在生物是普遍存在的，称 为DNA合成的半不连续复制
2.16 DNA复制
• 分子生物学讲义 • 山西师范大学 • 生命科学学院 • 2009年9月
2.16 DNA复制的基本机理
• DNA由两条螺旋的多核苷酸链组成，两条链的碱基 通过A:T和G:C之间的氢键联结在一起。在复制过 程中首先两条链间的氢键破裂并使双链解旋和分 开，然后以每条链为模板，按碱基互补配对原则 (A:T，G:C)，由DNA聚合酶催化合成新的互补链， 结果由一条链成为互补的两条链，这样新形成的 两个DNA分子与原来的DNA分子的碱基序列完全相 同。在此过程中，每个子代DNA的一条链来自亲代 DNA，另一条链则是新合成的。这种复制方式称此 过程中，每个子代DNA的一条链来自亲代的DNA， 另一条链则是新合成的。这种复制方式称为半保 留复制(semi conservation replication)
大肠杆菌DNA聚合酶I的功能2/5
[2] 3'→5'外切酶活性──校对作用: 这种酶活性的主要功能是从3‘→5’方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的 核苷酸。 当反应体系中没有反应底物dNTP时，由于没有聚合作用而出现暂时的游离现 象，从而被3‘→5’外切酶活性所降解。如果提高反应体系的温度可以促进 这种作用，这表明温度升高使DNA生长链3‘末端与模板发生分离的机会更 多，因而降解作用加强。当向反应体系加入dNTP，而且只加放与模板互 补的上述核苷酸才会使这种外切酶活性受到抑制，并继续进行DNA的合成。 由此推论，3’→5‘外切酶活性的主要功能是校对作用，当加入的核苷酸与 模板不互补而游离时则被3’→5‘外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合 对应的核苷酸。 在某些T4噬菌体突变株中DNA复制的真实性降低，而易发生突变，从此突变 株分离得到的T4DNA聚合酶的3‘→5’外切酶活性很低。 相反，另外一些具有抗突变能力的T4突变株中的T4DNA聚合酶的3‘→5’外切 酶活性比野生型高得多，因此，其DNA复制真实性好，变异率低。 可见，3'→5'外切酶活性对DNA复制真实性的维持是十分重要的。
2、DNA的复制过程（大肠杆菌为例）
• 双链的解开
• RNA引物的合成 RNA引物的合成
• DNA链的延伸 DNA链的延伸
• 切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的 切除RNA引物，填补缺口， RNA引物 DNA片段 DNA片段
3、复制起点
• DNA复制在生物细胞中要从DNA分子上特定 位置开始。这个特定的位置就称为复制起 点(Origin of replication)，用ori表示
DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等 复制、 DNA连接酶 DNA复制 损伤修复、
习题i
武汉大学2003年硕士研究生入学分子生物学试题： Replicon、 semi-conservative replication
华中科技大学2004年生物化学与分子生物学硕士研究生入 学试题 原核DNA合成酶中（ 片段 ）的主要功能是合成前导链和冈崎
A、DNA聚合酶Ⅰ B、DNA聚合酶Ⅱ
C、DNA聚合酶Ⅲ
(DNApolymeraseⅠ， DNApolⅠ)
5’
5’
3’
阿瑟·科恩伯格（1918年3月3日－ 2007年10月26日 Klenow片段
大肠杆菌DNA聚合酶1的理化性质1/2
纯化的DNApolⅠ由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基， MW为109KD。 分子含有一个二硫键和一个-SH基。通过二个酶分子上的-SH 基与Hg2+结合产生二聚体，仍有活性。 每个酶分子中含有一个Zn2+，在DNA聚合反应起着很重要的作 用。 每个大肠杆菌细胞中含有约400个分子，每个分子每分钟在 37℃下能催化667个核苷酸掺入正在生长的DNA链。 经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段，大片 段分子量为76KD，通常称为Klenow片段，小片段的分子量 为34KD。此酶的模板专一性和底物专一性均较差，它可以 用人工合成的RNA作为模板，也可以用核苷酸为底物。在 无模板和引物时还可以从头合成同聚物或异聚物。
[5] 焦磷酸交换作用:催化dNTP末端的PPi同无 机焦磷酸的交换反应。反应式为 32P32Pi+dNPPP←dNP32P32P+PPi→DNA
DNA polymerase III
’
• 6、DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA 中一条链有切口，一端是3’-OH，另一端是 5‘-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸 二酯键，而使切口连接。 但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来