第二章 染色体与DNA(3复制)

(三)DNA复制的过程 DNA复制的过程
DNA复制的全部过程可以人为地分成三个阶段 DNA复制的全部过程可以人为地分成三个阶段 第一阶段为DNA复制的起始阶段,这个阶段包括起始点, 第一阶段为DNA复制的起始阶段,这个阶段包括起始点,复 DNA复制的起始阶段 制方向以及引发体的形成; 制方向以及引发体的形成; 第二阶段为DNA链的延长, 第二阶段为DNA链的延长,包括前导链及随从链的形成和切 DNA链的延长 RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段 引物后填补空缺及连接岗崎片段; 除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段; 第三阶段为DNA复制的终止阶段. 第三阶段为DNA复制的终止阶段. DNA复制的终止阶段 在DNA复制的整个过程中需要30多种酶及蛋白质分子参加 DNA复制的整个过程中需要30多种酶及蛋白质分子参加 复制的整个过程中需要30
(1)σ滚环复制
replication) (2)噜噗滚环复制(looped rolling circle replication) 噜噗滚环复制(
(3)线粒体DNA的D线粒体DNA的 DNA 噜噗(displacement 噜噗(displacement loop)复制 loop)复制
θ型 (4) θ型
1,DNA复制的起始阶段 DNA复制的起始阶段
replication): (1)DNA复制的起始点(origin of replication): DNA复制的起始点(origin 复制的起始点 复制起始的特定DNA DNA序列 复制起始的特定DNA序列 复制起点的一般特征: 复制起点的一般特征: 它们都由多个独特的短重复序列组成; 1,它们都由多个独特的短重复序列组成; 2,这些短重复序列被亚多基的复制起点结合蛋白所识 它对于在复制起点组装复制酶具有关键作用; 别;它对于在复制起点组装复制酶具有关键作用; 复制起点附近一般有一个富含A 的序列, 3,复制起点附近一般有一个富含A-T的序列,以利于双 螺旋DNA解链或解旋,并产生单链DNA复制模板. DNA解链或解旋 DNA复制模板 螺旋DNA解链或解旋,并产生单链DNA复制模板. 复制子或复制单元(replicon): 复制子或复制单元(replicon): 染色体上能够进行独立复制的单位. 染色体上能够进行独立复制的单位.细菌一个复制 真核生物一条染色体上多个复制子. 子,真核生物一条染色体上多个复制子.
二,DNA的复制与调控 DNA的复制与调控
(教材P.37-51) 教材P.37-51) P.37
学习目的和要求 熟悉DNA复制的一般规律,掌握DNA复制的特点; DNA复制的一般规律 DNA复制的特点 熟悉DNA复制的一般规律,掌握DNA复制的特点;掌握真核生物 和原核生物DNA复制的异同点;理解DNA复制的基本过程. DNA复制的异同点 DNA复制的基本过程 和原核生物DNA复制的异同点;理解DNA复制的基本过程.
2,DNA复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子 DNA复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子
(1)DNA的聚合反应和DNA聚合酶 DNA的聚合反应和DNA聚合酶 的聚合反应和DNA DNA聚合酶的共同特点 DNA聚合酶的共同特点 第一,需要提供合成模板; 第一,需要提供合成模板; 第二,不能起始新的DNA链 第二,不能起始新的DNA链, DNA 必须要有引物提供3' OH; 3'- 必须要有引物提供3'-OH; 第三,合成的方向都是5' 第三,合成的方向都是5' →3' 第四,除聚合DNA外还有其 第四,除聚合DNA外还有其 DNA 它功能
解链酶(helicase) ① 解链酶(helicase) DNA复制,修复,重组及接 DNA复制 修复, 复制, 合过程, 合过程,两条互补链必须部分 分开形成单链DNA中间体-DNA中间体--解 分开形成单链DNA中间体--解 ---螺旋酶催化 旋---螺旋酶催化 发动蛋白,具有依赖DNA的 发动蛋白,具有依赖DNA DNA的 ATPase活性 活性, ATP水解产生 ATPase活性,把ATP水解产生 的自由能转化为解旋DNA DNA并使 的自由能转化为解旋DNA并使 螺旋酶本身沿DNA DNA链移动的机 螺旋酶本身沿DNA链移动的机 500-1000bp/ bp/秒 械能 500-1000bp/秒 真核生物转录复合物的组分, 真核生物转录复合物的组分, 有些螺旋酶具有RNA RNA螺旋酶活 有些螺旋酶具有RNA螺旋酶活 性
(二)DNA复制的几种主要方式 DNA复制的几种主要方式
依DNA合成的起始方式, DNA合成的起始方式, 合成的起始方式 复制可分为从新起始 从新起始与 复制可分为从新起始与 共价延伸两种类型 两种类型. 共价延伸两种类型.前 者是前导链从新开始, 者是前导链从新开始, 也叫复制叉式复制; 也叫复制叉式复制;后 者是先导链共价结合在 一条亲代链上, 一条亲代链上,也叫滚 环式复制. 环式复制.
缺刻平移标记DNA探针
D. 内切酶活性
Klenow片段 Klenow片段
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段( 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段(E.coliDNA DNA聚合酶 片段 fragment),又叫做Klenow ),又叫做Klenow聚合酶或 PolⅠ Klenow fragment),又叫做Klenow聚合酶或 Klenow大片段酶 它是由大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶, 大片段酶. DNA聚合酶 Klenow大片段酶.它是由大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶, 经枯草杆菌蛋白酶(一种蛋白质分解酶)处理之后, 经枯草杆菌蛋白酶(一种蛋白质分解酶)处理之后,产 生出来的分子量为76KD的大片段分子. 76KD的大片段分子 生出来的分子量为76KD的大片段分子. Klenow聚合酶仍具有5′→ 3′的聚合活性和3′→ 5′ 的聚合活性和3′→ Klenow聚合酶仍具有5′→ 3′的聚合活性和 聚合酶仍具有 核酸外切酶活性,但失去了全酶的5′→ 3′的核酸外 核酸外切酶活性,但失去了全酶的5′→ 3′的核酸外 切酶活性. 切酶活性. 在DNA分子克隆中,Klenow聚合酶的主要用途有: DNA分子克隆中,Klenow聚合酶的主要用途有: 分子克隆中 聚合酶的主要用途有 修补经限制酶消化的DNA所形成的3′隐蔽末端; DNA所形成的3′隐蔽末端 (i)修补经限制酶消化的DNA所形成的3′隐蔽末端; ii)标记DNA片段的末端; DNA片段的末端 (ii)标记DNA片段的末端; iii)cDNA克隆中的第二链cDNA的合成 克隆中的第二链cDNA的合成; (iii)cDNA克隆中的第二链cDNA的合成; iv)DNA序列测定 序列测定. (iv)DNA序列测定.
DNA聚合酶Ⅰ DNA聚合酶Ⅰ的功能 聚合酶 5'→3'聚合活性 A. 5'→3'聚合活性
图 DNA聚合酶催化的DNA链延长
3'→5'外 B. 3'→5'外 切活性
5'→3'外切活性 C. 5'→3'外切活性 切口平移(nick translation); 切口平移( translation); 链的置换; 链的置换; 模板转换(template-switching) 模板转换(template-switching)
1,复制叉式复制 复制叉式复制是真核生物和原核生物中普遍存在的 DNA复制方式 复制方式. DNA复制方式.
2,滚环式复制 滚环式复制是单向复制的特殊方式, 滚环式复制是单向复制的特殊方式,是某些噬菌体 DNA复制的共同方式 另外某些双链DNA 复制的共同方式. DNA的合成也 DNA复制的共同方式.另外某些双链DNA的合成也 通过滚环复制的方式进行.Baidu Nhomakorabea通过滚环复制的方式进行.
DNA聚合酶 聚合酶I ① DNA聚合酶I polⅠ是由一条多肽链 DNA polⅠ是由一条多肽链 组成,分子量为109KD 109KD. 组成,分子量为109KD.酶 分子中含有一个Zn++ Zn++, 分子中含有一个Zn++,是聚 合活性必须的. 合活性必须的. DNA聚合酶有6个结合位点: DNA聚合酶有6个结合位点: 聚合酶有 模板结合位点; 模板结合位点; 引物结合位点; 引物结合位点; 引物3'-OH结合位点; 引物3'-OH结合位点; 3' 结合位点 底物dNTP结合位点; 底物dNTP结合位点; dNTP结合位点 5'→3'外切酶结合位点; 5'→3'外切酶结合位点; 外切酶结合位点 3'→5'校正位点. 3'→5'校正位点 校正位点
DNA聚合酶 聚合酶II ② DNA聚合酶II
分子量120KD 分子量120KD 100个酶分子/细胞 100个酶分子/ 个酶分子 活性是DNA I的 活性是DNA pol I的5% 具有5′→3′聚合活性和3′→5′ 5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性 具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性 没有5′→3′ 5′→3′外切活性 没有5′→3′外切活性 DNA修复有关 与DNA修复有关
(2)DNA复制的方向 DNA复制的方向
① 定点开始双向复制 原核生物和真核 生物DNA DNA复制最主要的 生物DNA复制最主要的 形式
② 定点开始单向复制 质粒colE1 质粒colE1
③ 两点开始单向复制 腺病毒DNA DNA的复制 腺病毒DNA的复制
(3)DNA复制起始,引发体的形成及所参与的酶和蛋白质 DNA复制起始, 复制起始
分散模型(dispersive 分散模型(dispersive model) 亲代双链被切成双链片段, 亲代双链被切成双链片段, 而这些片段又可作为新合 成双链片段的模板, 成双链片段的模板,新, 老双链片段又以某种方式 聚集成"杂种链" 聚集成"杂种链"
半保留复制模型 (semiconservative replication model) model) DNA在复制时首先两条链 DNA在复制时首先两条链 之间的氢键断裂两条链分 开,然后以每一条链分别 做模板各自合成一条新的 DNA链 DNA链,这样新合成的子 DNA分子中一条链来自 代DNA分子中一条链来自 亲代DNA DNA, 亲代DNA,另一条链是新 合成的. 合成的.
Stahl,1958) 半保留复制的实验证据 (Meselson 和 Stahl,1958)
复制叉与复制泡
复制开始时, 复制开始时,双链打开 从打开的起点向一个方向 形成一个的叉形或Y 形成一个的叉形或Y形 从打开的起点向 两个方向形成
2,DNA复制的半不连续性 DNA复制的半不连续性
前导链 RNA引物 RNA引物 岗崎片段 随从链 原核: 原核: 10001000-2000bp 真核: 真核: 100100-200bp
单链结合蛋白(single ② 单链结合蛋白(single strand binding proteins, SSBP) 又称为双螺旋去稳定蛋白( 又称为双螺旋去稳定蛋白(helix destabilizing protein) protein) 177个aa组成 由177个aa组成 在E.coli 中以四聚体存在 分子量为74KDa 分子量为74KDa 在原核中SSB DNA结合表现出协同效应 SSB与 结合表现出协同效应. 在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应. SSB之间的相互作用 之间的相互作用; A. SSB之间的相互作用; 第一个SSB DNA的结合改变了DNA的结构 SSB和 的结合改变了DNA的结构. B. 第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构. ③ 引发体的形成 引物酶(primase) A. 引物酶(primase) 引发体(primosome) B. 引发体(primosome)
(一)DNA复制概况 DNA复制概况
1,DNA复制的半保留性 DNA复制的半保留性
全保留复制模型 (conservative replication model) model) 两条母链彼此结合,恢复原状, 两条母链彼此结合,恢复原状, 新合成的两条子链彼此互补结 合形成一条新的双链. 合形成一条新的双链.