Western Blot Protocol (large)

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Western Blotting Protocol-中山大学(参考)

Western Bloting (张雪雁)操作步骤：1.做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。

待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。

2.蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算准确，分装到EP管或，按5ul/100ul样品的浓度加β—巯基乙醇，然后以PCR仪95℃变性10分钟。

3.上样、电泳：1）上层胶为安全凝固（大约15分钟）后，两只手同时向上用力取下梳子。

以蒸馏水仔细清洗各泳道内残留得碎胶。

2）将SDS—PAGE胶转移到电泳槽中，如果只做一块胶，对面以玻璃板平衡。

1х电泳缓冲液充满电泳槽后，以玻璃棒将电泳槽中的气泡尽量赶除。

3）先以少量加有溴酚蓝1х上样缓冲液标记各泳道。

4）变性过的各管蛋白质样品以加有溴酚蓝1х上样缓冲液补齐至50ul。

蛋白Marker也补齐至50ul。

5）以一定顺序将蛋白样品和Marker，用微量移液器加至泳道。

上样过程中，手要稳，避免将泳道划破，样品自枪头打出时要缓慢，以免样品自泳道飘出。

剩余未加样的泳道以50ul上样缓冲液平衡。

6）加样完毕，红对红，黑对黑将电泳槽和电泳仪接好，打开电源，电压调至60-100V之间。

一般来说样品在上层胶时电压可稍高，进入下层胶后较低的电压容易将个分子量蛋白粉理清楚。

溴酚蓝自胶内跑出后电泳结束。

4.电转：1）准备PVDF膜及滤纸。

PVDF大小8.2х5～5.5，滤纸按电转海绵大小剪，一块胶准备四张滤纸。

2）将PDVF膜置于干净的容器中，倒入适量甲醇浸泡1～3分钟，然后浸泡于电转浸泡液中。

3）小心取出两层玻璃之间的胶，切去上层胶。

在电转液中完成如下：电转孔板黑色面铺放海绵一张，依次铺放滤纸两张，胶一块，PVDF膜一张，滤纸再两张，海绵再一张，然后小心扣好孔板，将其黑色面对黑色面扣入电转架，将电转架放入电泳槽。

电泳槽内置小冰盒一个，整个电泳槽置于大冰盒中。

4）接好电源，按蛋白分子量大小调整电压。

Western blot protocol

Western blot1.蛋白提取：细胞或者组织匀浆液Ripa裂解液的配置：总体积：100ml向烧杯中加入30ml millipore水，置于搅拌器上，放入搅拌子搅拌，加入0.876g 氯化钠，加入0.5g 脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate)，加入1ml NP-40，加入1m 10% SDS，加入5ml 1M Tris-Cl (ph=8.0)，待溶解完全并混匀后转移到量筒中，并用millipore水洗几次烧杯，然后倒入量筒中，定容到100ml，倒入到试剂瓶中，标记备用。

配置细胞裂解液：1ml ripa buffer+5ul 0.1M PMSF + 1ul 1ug/ul leupeptin + 5ul 1M DTT（二硫苏糖醇）Protease Inhibitor Target Protease Working ConcentrationSerine proteases 0.1 – 1 mMPMSF (Phenylmethylsulfonylfluoride苯甲基磺酰氟)Benzamidine（苯甲脒）Serine proteases 1 mMPepstatin A （胃酶抑素）Thiol proteases（巯基蛋白酶） 1 μg/mlLeupeptin（亮抑酶肽）Thiol proteases 1 μg/mlAprotinin （抑肽酶）Serine proteases 5 μg/mlAntipain （抗蛋白酶）Thiol proteases 1 μg/mlEDTA and EGTA Metalloproteases 0.1 – 1 mM检测磷酸化的蛋白时需加入氟化钠NaF和钒酸钠Na3VO4来保护磷酸化的蛋白不会被磷酸酶还原。

在做磷酸化的signal transduction时必需添加。

蛋白提取：细胞：向培养皿中加入细胞裂解液，置于冰上摇10分钟，收集裂解液，4度离心，最大转速离心15分钟，收集上清液，备用，（分装，放到-20度保存）组织：向新鲜组织中加入裂解液，用匀浆器裂解混匀，4度离心，最大转速离心15分钟，收集上清液，备用，（分装，放到-20度保存）2.制胶：根据待测蛋白大小制备不同浓度的胶分离胶：见配胶浓度表对于1mm制胶版需至少5ml分离胶浓缩胶：见配胶浓度表需3ml浓缩胶H2O 30% acrylamide(丙烯10%APS TEMED 1.5M Tris(8.8) 1.0M Tris(6.8) 酰胺)2.3ml 1.3ml 50ul 5ul 1.3ml8%分离胶（5ml）2.1ml 0.5ml 30ul 3ul 0.38ml5%浓缩胶（3ml）3.玻璃板用酒精棉球擦一遍，晾干，短板向外夹好在绿色架上。

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Western Blot Protocol1.SDS-PAGE试剂的配制1)40%丙烯酰胺溶液(Acrylamide)2)10%过硫酸铵溶液(APS)3)TEMED4)分离胶缓冲液4X Buffer (pH 8.8)5)浓缩胶缓冲液4X Buffer (pH 6.8)6)10X电泳缓冲液(Running buffer)2.制胶1)10%分离胶的制备ddH2O 4.92ml 9.98mlTris-HCl缓冲液（pH 8.8，1.5mol/l） 2.5ml 5ml40%丙烯酰胺 2.48ml 4.96ml10% APS 100μl 200μlTEMED 4μl 8μl10%分离胶10ml 20ml2)灌注分离胶在加完TEMED后，速在两玻璃板间灌注丙烯酰胺溶液，预留1.5cm灌注浓缩胶（约在夹子高度稍低），应排除凝胶底部玻璃与板间的气泡。

用移液枪在丙烯酰胺溶液上层覆盖无水乙醇约4ml（至溢出），凝胶静置室温30min。

30min后，分离胶聚合凝固，倾倒出上层覆盖的无水乙醇，并用滤纸吸尽残留的液体。

3)5%浓缩胶的制备ddH2O 2.5ml 5mlTris-HCl缓冲液（pH 8.8，1.5mol/l）1ml 2ml40%丙烯酰胺0.46ml 0.92ml10% APS 40μl 80μlTEMED 2μl 4μl浓缩胶4ml 8ml4)灌注浓缩胶在加完TEMED后，迅速在已经聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶至溢出，并立即插入梳子，避免产生气泡。

凝胶静置30min。

浓缩胶聚合凝固，小心拔出梳子，立即用ddH2O洗涤加样槽，以去除未聚合的丙烯酰胺。

3.加样1)蛋白样品变性在浓缩胶聚合的同时，将蛋白抽提液和加样缓冲液在沸水中加热5分钟，使蛋白变性。

2)灌注电泳缓冲液电泳槽中加满电泳缓冲液（ph8.3的Tris-Gly）。

3)蛋白加样用移液枪加样槽中加入样品和分子量蛋白标准品（Markers）。

所有加样槽均加样，空白孔用加样缓冲液代替，第一个孔加Markers5μl，其余孔加样品30μl。

蛋白印记WesternBlotprotocol

蛋白印记WesternBlotprotocolWestern blot for PAR-2一、试剂的配制1. PMSF(100 mM)的配制:0.1742 g PMSF → 10 ml异丙醇（－20℃保存）2. 裂解液的准备:购自碧云天公司，分强，中，弱三种（三个小瓶,各50 ml）.在提取总蛋白之前3－5min，将分装裂解液（强）融化置于冰上,每个肌条300－500ul裂解液不要超过450ul,(1ml加入100 mM的PMSF10 μl（使PMSF 的终浓度为1 mM），置于冰上。

(－20℃保存）3.2X Sample Buffer(要用才配或配好后置于-80℃)1倍DTT加上9倍的2X Laemmli Buffer(1). DTT (Di-dithiothreitol) 1M1.542 g DTT →10 ml的10 mM Sodium acetate(醋酸钠)（pH=5.2）中10 mM Sodium acetate(醋酸钠)：0.082 g 无水醋酸钠→ 100 ml dH2O(2). 2X Laemmli Buffer (100 ml) (置于－20°C，经常使用时置于4°C)Glycerol （甘油）20 mlβ-mercaptoethanol （β-me，β-巯基乙醇） 5 ml （恶臭，注意安全）20﹪SDS （十二烷基硫酸钠）10 mlBromophenol Blue（溴酚蓝）20 mg1.5M Tris-Cl（三羟甲基氨基甲烷）pH=6.820 ml (90.855 g Tris→420 ml dH2O,浓盐酸滴定至pH=6.8，定容至500 ml ) dH2O 45 ml4.30％ A+B溶液29．2 g Acrilamide (丙烯酰胺)0．8 g Bis－acrilamide (甲叉双丙烯酰胺)Add dH2O dilute to 100 mL and filter 避光4°C储存注意：该两种药品有毒，配药时注意安全PS. Acrylamide 及Bisacrylamide 是neurotoxin会穿过皮肤，配药时要穿实验衣及戴口罩。

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Western blot 步骤(1)蛋白样品制备离心收集菌体。

加入200μl SDS-PAGE loding buffer重悬菌液，100°C煮6min，然后上样。

(2) SDS-PAGE电泳上样蛋白量为15μl。

(3) 转膜1、制备足够转移缓冲液以用于平衡凝胶和膜以及润湿滤纸。

2、从玻璃板上取下凝胶，去除所有浓缩胶。

3、将凝胶浸入转移缓冲液中10~15 分钟。

4、滤纸在转移缓冲液中至少浸泡10分钟。

5、准备PVDF膜：剪取一张PVDF膜以及4张转膜滤纸(膜与滤纸的面积应等于或略大于凝胶)。

PVDF膜在甲醇中润湿膜10 秒；接着小心将膜放入双蒸水水中浸泡2 分钟；然后小心地把膜放入转移缓冲液中平衡至少10 分钟。

6、转膜（并标记MARKER）打开转膜装置依次铺上第一层滤纸，第二层滤纸，胶，PVDF膜，第三层滤纸，第四层滤纸，每次都用15ml离心管擀出气泡。

膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。

接线，盖上盖子，开电源跑00:30~2:00h。

如果要看转移后的效果，可转膜完成后用丽春红染液对膜进行染色，具体的操作步骤如下：1、将膜置于培养盒中。

2、加适当体积的丽春红S，在脱色摇床中染色５分钟，观察转印效果。

3、去除染液（可重复使用），双蒸水洗膜两次，每次5 分钟，这时如果膜上有转印的蛋白时，可以看见数条蛋白条带及泳道痕迹。

(4) 封闭：将膜(如膜干应先用甲醇湿润)用PBST稍漂洗2次，每次5min。

浸泡于封闭液(BLOTTO+T)中于37℃2小时(三维摇床50/分)。

(5) 洗膜：在培养皿中用PBST洗两遍，每遍约5min。

稀释一抗：用预先配制的BLOTTO+T来6倍稀释一抗。

配制一抗（稀释6倍）：0.33ml血浆+0.67ml BLOTTO+T。

(6) 膜与一抗孵育：把膜转至另一干净培养皿，加进一抗，于室温用三维摇床摇4℃过夜。

(7) 稀释二抗：取出培养皿，把膜移至另一培养皿，加进预制的PBST约15ml，洗4次，每次5min。

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一．绘制BSA标准曲线(目的：测蛋白浓度)1.方法：BCA法(生工)2.需要配的试剂：1× PBS溶液10× PBS溶液：Na2HPO48 mMNaCl 136mMKH2PO4 2mMKCl 2.6mM3.注意：① 用分光光度计测定A562吸光值时，所需样品最小体积为1ml，即，加样体积为：1× PBS—0.5ml，BCA工作液—0.5ml；① 由于缓冲液1× PBS与BCA工作液是1:1等体积加的，所以，BSA被稀释为初次用1× PBS配制的梯度浓度的1/ 2，即，在绘制标准曲线时，BSA的终浓度需要÷ 2，切记！二．提取总蛋白1.试剂：配制时佩戴手套、口罩。

(1)单一母液：① 1M Tris (pH=8.0)：4℃保存称取12.114g Tris-base，加少于100ml蒸馏水溶解，调pH后，定容至100ml。

① 0.5M EDTA (pH=8.0)：4℃保存称取14.61g EDTA，加少于100ml蒸馏水，加固体NaOH至pH约为8.0时，EDTA方开始溶解，溶液状态变化过程：白色乳浊液——白色胶状物——白色乳浊液——无色透明液。

① 20% SDS：常温保存称取20g SDS，加蒸馏水定容至100ml.④100× PMSF (100 mM): 4℃保存称取261.3 mg PMSF，加15 ml 异丙醇溶解。

(2)复合母液：2× extraction buffer : 40ml1M Tris (pH=8.0) 2 ml0.5 M EDTA (pH=8.0) 160 μl20% SDS 4 mlWater 33.84 ml2.取样：取细胞浓度为2×107的藻液1ml于1.5ml EP管中，厌氧箱中离心1-2min，将沉淀物于液氮中速冻后置于-80①保存；3.提取总蛋白：3.1 根据样品数量计算所需的提取试剂体积：1个样品——1ml 1× extraction buffer3.2 配制1× extraction buffer:试剂：① 2× extraction buffer① 100× PMSF3.3 提取：将-80①保存的样品取出，置于冰上，加入步骤2.2配制的1× extraction buffer 1ml, 涡旋至EP管底部无沉淀黏着后，4①，12,000 rpm离心10 min，用1ml移液枪小心吸取上清于另一干净的1.5 ml EP管中，置于冰上。

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Western Blot protocol一、试剂准备1.蛋白裂解液配方：2. 1.5 mol/L Tris.HCL(PH 8.8)O 800 mlTris base (MW 121.1) 181.7g dd H2溶解之后用浓盐酸调PH至8.8（一般加几滴即可，可以在调之前先测溶解液的PH，然后再估计浓盐酸的使用量），然后定容至1L。

高压灭菌后保存。

3. 1 mol/L Tris.HCL(PH 6.8)Tris base (MW 121.1) 30.9 g dd HO 200 ml2溶解之后用浓盐酸调PH至6.8（，可以在调之前先测溶解液的PH，然后再估计浓盐酸的使用量。

一般）然后定容至250 ml，经高压灭菌后使用。

4.10% AP （过硫酸铵）:O 溶解后分装，-20℃保存。

0.1 g过硫酸铵 + 1.0 ml Dd H2O加100 g SDS加热至68℃助溶，然后用浓盐酸调节PH 5.10% SDS：用900 ml的H2至7.2，最后定容至1L。

6.分离胶( 12% )[常用]：7.浓缩胶( 5% )：8. 5 × Running Buffer（储存液）:9. 1 × Running Buffer （工作液）：200 ml的5 × Running Buffer + 800 ml的ddO。

H210.转膜缓冲液：3.03 g Tris base + 14.4g甘氨酸溶解在少量的蒸馏水中，完全溶解后加100ml的甲醇，再用蒸馏水定容至1L。

11.10 × TBS ( 储存液) ：24.2 g Tris base + 80 g NaCl 溶解，用Hcl调PH至7.6，最后定容至1L。

O。

12.1 × TBS （工作液）：100 ml的10 × TBS + 900 ml的dd H213.TBST：含0.1% 吐温—20的1 × TBS。

western blot 操作步骤

Western blot protocol一. sample preparation:1．收细胞: 将4˚c 离心机首先预冷至4˚c ，10cm盘用15ml管，15cm盘用50ml 管，1000rpmx5min,弃细胞medium，以少量预冷PBS洗去残留medium，加入相应体积的PBS, 分两次刮下细胞 (optional: 此时细胞可以置于-80˚c store);2．2000rpmx5min，4˚c；3．去上清，每个样品加入裂解液500-600ul（10cm盘）裂解液（lysis buffer 同western blot, -20˚c store, add protein inhibitor freshly），transfer到1.5ml的EP管中，冰上30min；4． 12000rpm，15min，4˚c；5．收集上清，测浓度：在Cuvett 中加入4ul样品+1ml protein assay solution（5×，用水稀释成1×），OD595nm测蛋白浓度，二. SDS-PAGE制胶及电泳（1st day）将大小玻璃板洗净，并用70% ethanol喷淋，以彻底洗净油渍；将2块玻璃板擦净后，之间放置塑胶垫片，底部对齐，安装于固定架上，并将固定螺丝对称扭紧（越紧越好，这样胶才不会漏）；将固定好的玻板架置于底座，下方放置垫片，并将两侧固定旋钮卡紧；适当倾斜玻板架，以100% ethanol 注入2块玻板间，观察5-10分钟，是否漏胶；确定不漏后，开始配制10%分离胶，其他浓度见分子克隆：10%分离胶1块胶2块胶H2O 11.9 23.830% Acrydelamide 10 20pH 8.8 Tris-cl 7.5 1510% SDS 0.3 0.610%AP(-20°c) 0.3 0.6TEMED 0.012 0.024Total Vol. 30 60最后加入AP和TEMED，一旦加入TEMED，混匀后，迅速倒入玻板间，并用70%乙醇封闭，以使界面平整；等待半小时凝胶聚合；并立即以Marker笔标记界面的位置，以便观察是否漏胶；待分离胶凝固后(约需30min)，可以看到一条明显的界线，此时可以倒出70%乙醇，倾斜放置胶架, 等待70%乙醇彻底挥发，可用干净打印纸在两块玻璃板之间拭干残留液滴；配制浓缩胶：1块胶(ml) 2块胶(ml)H2O 5.5 1130% Acrydelamide 1.3 2.6pH 8.8 Tris-cl 1.0 2.010% SDS 0.08 0.1610%AP(-20°c) 0.08 0.16TEMED 0.008 0.016Total Vol. 8 16将浓缩胶迅速倒入槽内，并45度倾斜缓慢插入梳齿，一边插入，一边注意梳子底部是否有气泡，如果有，就把所在气泡的梳齿小心拔出少许，以消除气泡，此动作快速又小心，以防止胶凝固；于上样前检测蛋白浓度，确定上样量，如下图1，其后将样品总蛋白浓度与每天所需检测的蛋白分子名称根据分子量列表（列于同一页，作为实验记录，便于随时阅读和保存，见excel 文件）将梳齿缓慢取出（这样可以避免将加样孔拔变形），以刀片移去碎胶，用dd H2O冲洗，准备电泳槽，将凝胶架置于槽内，上槽加满new running buffer, 下槽加入used running buffer，至淹没下方导线;接通电极，注意电极方向，70-85v, Overnight, or 200v, daytime.电泳结束后取出胶架，润湿后再把胶取出。

western blot protocol

Western Blot protocolSDS-PAGE：SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis【原理】Western Blot又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。

是检测混合样品中单一特定蛋白的常用技术。

Western Blot间接法基本原理：首先利用SDS-PAGE对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体（例如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

转移后的PVDF膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。

印迹首先用蛋白溶液（如5%的BSA 或脱脂奶粉溶液）处理以封闭PVDF膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。

处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。

处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。

目前有结合各种标记物的抗特定IgG 的抗体可以直接购买作为二抗，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。

该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。

在Western Blot实验中，还有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色，这种方法叫直接法。

与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。

所以一般情况下都釆用间接法进行检测。

【实验耗材】•PVDF膜[MILLIPORE (IPVH00010)]•NC膜•滤纸[BIO-RAD (1703967)]【实验仪器】•PowerPac Basic电泳仪[BIO-RAD (041BR89156)]•Trans-Blot Turbo System 半干转转膜仪[BIO-RAD (690BR006827)]自制胶通常使用Bio-rad半干转转膜仪•iBlot Dry Blotting System 干转转膜仪[Invitrogen (25-0912)]需用Invitrogen 预制转印包•Chemi Doc XRS+显影仪[BIO-RAD (721BR04128)]【试剂】••5×量取100mL of 5×电泳液至500mL量筒中，加超纯水至500mL刻度线，配好后的电泳液在1个月内使用。

western blot 检测相关参数及常见问题

Western Blot（WB）检测注意事项及相关参数发布日期：2009-11-16 来源：生技网信息中心浏览次数：985成功完成Western Blot检测，必须满足4 个条件：（1）转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来,如果蛋白质还截留在凝胶中,将无法在膜成功完成Western Blot检测，必须满足4 个条件：（1）转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来,如果蛋白质还截留在凝胶中,将无法在膜上进行分析（2）在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析（3）在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上（4）被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测此外，成功进行WB检测，必须设置合适正确的对照，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性。

一般需要设置的对照如下：阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性内参对照：检测标本的质量和二抗系统空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果附一：WB检测基本过程及相关参数1、获取细胞或组织裂解物1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer,亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量2)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！2、蛋白定量常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。

定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C 备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白3、蛋白质的分离根据目的蛋白的性质，利用电泳方法将其进行分离。

为提高电转移的效率，通常采用SDS/PAGE技术。

分离实验结束后，首先将样品墙的上边缘用小刀去除，然后在胶板的右上角切一个小口以便定位，小心放入转移缓冲溶液中待用。

western blot 操作流程

Western blot protocol第一部分：样品制备（一）、所需试剂：1. Western及IP细胞裂解液(KGP701)：Western及IP细胞裂解液分装后存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；2. PMSF（100mM）：sigma；3. PBS（二）、所需耗材：离心管、细胞刮、各种规格的枪头（三）、所需仪器：各种量程的移液器、4℃高速离心机（四）、操作步骤：1．在每mL 冷Western及IP细胞裂解液加入10μL 100mM PMSF，混匀。

冰上保存数分钟待用；2. 倒掉已处理好的细胞的培养液，预冷的PBS冲洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液，将培养瓶置于冰上；3. 加入上述适量配制好的Western及IP细胞裂解液（107个细胞加入Western及IP细胞裂解液1 mL～2 mL），用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触；4. 裂解完毕后，迅速用细胞刮将细胞刮于培养瓶一侧（动作须块），然后用枪将细胞碎片和裂解液转移至1.5ml EP管中（操作在冰上进行），10000转/分，4℃离心5 min（离心机需要预冷）；5. 取上清转移至新的预冷的离心管中，蛋白定量（BCA法）；第二部分：测定蛋白浓度（一）、所需试剂：凯基BCA蛋白含量检测试剂盒（KGPBCA），分装后存于-20℃冰箱中，避免反复冻融。

（二）、所需耗材：Ep管、96孔板、离心管、细胞刮、各种规格的枪头（三）、所需仪器：各种量程的移液器、振荡器、37℃烤箱、酶标仪（四）、操作步骤：1. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀；2. 取一块96孔板，按照下表加入试剂：3. 把96孔板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30min，然后在562nm下比色测定。

以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；4. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；5. 根据标准曲线计算样品实际浓度（单位：μg/μl），将所有样品浓度用裂解液调至4μg/μl；6. 分装保存于-80℃,避免反复冻融。

Western Blot 详细实验步骤

Western Blot protocol1，制样：将获得的细胞用PBS洗涤，300gx4℃x5min,弃去上清。

加SDS loading buffer 搅拌转移到1.5ml离心管。

放到干浴锅100℃煮10min，放入冰上5min，最后存入-20℃冰箱待用。

2，将样品取出待用，可100℃煮2min，待上样。

3，配胶：浓缩胶5%，分离胶8%，10%或12%（分子大用低浓度，分子小用高浓度Caspase3 35kD，12%浓度(活性形式17kD)；DAPK1/p-DAPK1 160KD 18%浓度）：ddH2O，30%Acrylamide, 1.0M/1.5MTris-HCL, 10%SDS, 10% AP, TEMED按比例加。

1）夹好板子，用ddH2O捡漏，5min。

2)按照顺序加入试剂配胶配分离胶（50ml管子），混匀。

3）加胶7ml，大致与夹子的门平齐。

随后轻轻加3ml乙醇液封页面。

静置30min。

4）将乙醇倒掉，用ddH2O清洗3遍。

5）制备浓缩胶，加入3ml左右只玻璃板界面，插入梳子。

6）静置30min后拔掉梳子。

取下玻璃板用ddH2O 冲洗边缘。

7）若不立即使用可用保鲜膜将其包好放在4℃冰箱。

（TEMED在灌胶前加入）4，上样：1）固定好玻片，加入running buffer 没过底板，盖上盖子。

2）浓缩胶75-80V 30min左右，分离胶100V-120V 1h左右。

5，转膜：1）取出玻璃板，用切胶器轻轻撬动取掉小玻片，切去浓缩胶（将分离胶放入放入ddH2O水中浸泡5min，重复三次）再放入trans buffer中放置10min。

2）剪一块与胶一样大的PVDF膜放在甲醇中浸泡，使其带正电。

3）将PVDF，海绵垫，滤纸放入trans buffer浸泡几分钟。

4）在黑色面板依次放入海绵垫，至少3层滤纸，胶，转移膜，注意不能有气泡，再放滤纸，海绵垫形成夹心结构。

(大分子用0.4 um PVDF 膜，小分子用0.25um PVDF膜)。

western blotting protocol(WWZ-070610)

Western blotting protocolBy Wei-Zhang Wang-070610 A.溶液和试剂注意：溶液的配制最好用Milli-Q或同等纯度的水!所有下面所用容器使用前都必须洗干净，并用双蒸水润洗，最后晾干。

A1. 抑制剂：蛋白酶抑制（35mg/ml PMSF）：用无水乙醇稀释为35mg/ml，室温下避光保存，可使用3－4个月。

（MW：172.4g）丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂（5M 氟化钠（NaF））：取2.1克氟化钠置于10ml Milli-Q 水中，然后vortex剧烈震荡使其充分溶解，最后分装成10μl/管，置于-20℃保存（解冻后必须1小时内使用）。

酪氨酸磷酸酶抑制剂(1M 钒酸钠（Sodium Orthovanadate）)：称一定量的钒酸钠置于水中，用盐酸调pH至10.0，加热沸腾至完全溶解且溶液为无色，待溶液冷却至室温后再调pH至10.0，加热至溶液变无色，冷却后再调pH至10.0，如此反复操作至室温下pH 稳定在10.0即可，最后定容至浓度为1M。

此配制方法是参考网上的WB protocol，实际是否如此配制尚未实践过！A2. 1×PBS（pH7.4）Stock 终浓度Tris-HCL(pH6.8 at 25℃) 1M Tris(pH6.8) 1.25ml 62.5mMSDS 0.4g 2％(w/v)Glycerol(甘油) 2ml 10%DTT(二硫苏糖醇) 1M 1ml 50mMBromophenol blue(溴酚蓝) 0.01%(w/v)A4. 转移缓冲液：74.5g甘氨酸,15gTris碱加水定容至1000ml，成5×stock，4℃保存。

使用前稀释成1×：取200ml 5×stock转膜缓冲液，然后加入600mlddH2O，最后加入200ml无水甲醇至1L，4℃预冷2h以上。

A5. Tris-甘氨酸电泳buffer(pH8.3)：Tris base 15.1g 和94g甘氨酸，溶解在900ml水中，然后加入5g SDS，再加水至1000ml，成5X。

Western_Blot_protocol

Western Blot Protocol(一)取材当天提蛋白，来自cell culture中的传代cell line。

1.取种有细胞的六孔板，真空吸去培养液，PBS洗3遍。

2.加入裂解液，裂解液配方：1份PI（蛋白质抑制剂，10×原液加PBS稀释至1×），1份TritonX-100（10×原液加PBS稀释至1×），8份PBS。

3.用刮刀把细胞从板底刮下来，将带有细胞的裂解液转移至1.5ml appendoff管中，置于冰上40min。

(二)制胶1.配10%ammonium persulfate(APS)【APS粉末+DW】（注：配好后4℃保存，1-2month）。

准备好30%Acrylamide（Bis Solution）【30%丙烯酰胺】、DW、10%SDS、1.5M Tris（PH8.8）、1.0M Tris(PH6.8)、10%SDS、TEMed（4℃）。

2.拿架子、干净玻片,放海绵架好架子，玻片厚内薄外。

3.配分离胶：按比例抽取DW、30%Acrylamide、1.5M Tris（PH8.8）、10%SDS、10%APS、TEMed【每块胶10ml】。

将分离胶打入板内（到绿线位置）。

随即加入DW压平。

等20min待分离胶凝结。

8%分离胶10ml20ml30ml40ml50mlDW 4.69.213.918.523.2 30%Acrylamide 2.7 5.38.010.713.31.5M Tris（PH8.8）2.5 5.07.510.012.510%SDS0.10.20.30.40.510%APS0.10.20.30.40.5TEMed0.010.020.030.040.05 10%分离胶10ml20ml30ml40ml50mlDW 4.07.911.915.919.8 30%Acrylamide 3.3 6.710.013.316.71.5M Tris（PH8.8）2.5 5.07.510.012.510%SDS0.10.20.30.40.510%APS0.10.20.30.40.5TEMed0.010.020.030.040.05 12%分离胶10ml20ml30ml40ml50mlDW 3.3 6.69.913.216.5 30%Acrylamide 4.08.012.016.020.01.5M Tris（PH8.8）2.5 5.07.510.012.510%SDS0.10.20.30.40.510%APS0.10.20.30.40.5TEMed0.010.020.030.040.054.倒去DW，水洗3遍，吸干水。

western blot protocol 最终版

Western blot实验方案【实验目的】了解western blot原理，掌握有关的操作方法。

【实验原理】Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

【实验仪器、材料和试剂】（1）仪器、用具：高速冷冻离心机、振荡器、-80℃冰箱、-20℃冰箱、酶标仪、水浴锅、涡旋器、SDS电泳仪、PH自动控制加液机、摇床、半干转膜仪、湿转膜仪、凝胶成像系统、托盘、量筒、1L烧杯、小烧杯、冰盒、孵育盒、纤维垫、玻璃棒、有齿镊子、无齿镊子、表面皿、搪瓷盘、移液器、细胞刮刀、计时器（2）耗材：15mL离心管、50mL离心管、1.5mL EP管、96孔板、普通滤纸、whatman 3mm 滤纸、PVDF膜、一次性枪头、棉球、保鲜膜（3）材料：人乳腺癌MCF-7细胞株、人乳腺癌MDA-MB-231细胞株（4）试剂：75%酒精、0.25%胰蛋白酶、PBS、RIPA裂解液、PMSF、bradford蛋白定量检测试剂盒、1.0mol/L Tris•HCl (pH6.8)、1.5mol/L Tris•HCl(pH8.8)、10%AP、TEMED原液、30%丙烯酰胺(29：1)、10%SDS阴离子去污剂、Sample Loading Buffer (5X)、BSA牛血清白蛋白、Running Buffer(5X)、transfer buffer、无水甲醇溶液、脱脂奶粉、10XTBS缓冲液、Tween-20、β-actin、一抗、带HRP二抗、DAB显色试剂盒、Stripping Buffer膜再生利用液（5）需要配制：分离胶、浓缩胶、封闭液（抗体稀释液）、洗脱液需要稀释：加样缓冲液、电泳缓冲液、转膜液其余按照说明书操作。

WesternBlotprotocol实验步骤

WesternBlotprotocol实验步骤Western Blot protocol主要试剂及缓冲液的配制1). 30%丙烯酰胺：将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为100ml的⽔中。

搅拌器帮助溶解，滤纸过滤除杂质，避光保存于4度冰箱。

2). 10% SDS：称量10g⼗⼆烷基硫酸钠，加⼊80ml超纯⽔中，加热搅拌溶解，加⽔⾄100ml室温保存备⽤。

3).10x蛋⽩电泳缓冲液：30.2gTris、188g⽢氨酸、10gSDS、加⽔⾄1000ml4).20×转膜缓冲液：Tris 29g，Glycine 144g，SDS 2g 加⽔定容⾄1000ml配制1×转膜缓冲液200ml (甲醇 40ml，20×transfer buffer 10ml，H2O 150ml)5).1.5M Tris 8.8：（注意温度对tris PH值的影响）18.15 g Tris 溶于80ml超纯⽔中，加浓盐酸调PH值8.8，定容⾄100ml。

⾼温灭菌后室温保存。

6).1M Tris 6.8：12.11g Tris 溶于80ml 超纯⽔，加浓盐酸调PH值6.8，定容⾄100ml。

⾼温灭菌后室温保存。

7). 10×PBS：NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4.12H2O 35.85g，KH2PO4 2.4g，⽤盐酸调PH⾄7.4，加⽔定容⾄1000ml8). 1xPBST(0.05% Tween 20)：10×PBS 100ml，H2O 900ml， Tween 20 50ul9).10%（W/V）过硫酸铵：临时配，0.1g过硫酸铵溶于1ml 超纯⽔，4度冰箱保存3天10). 丽春红染液储存液(0.1%（W/V）丽春红，5%（V/V）⼄酸)：，丽春红0.04g，冰醋酸2ml，超纯⽔ 38ml11). 封闭液：5%（W/V）脱脂奶粉溶于1X PBST 中，使⽤时现配。

WesternBlot最全攻略：从protocol到问题解决

WesternBlot最全攻略：从protocol到问题解决蛋白免疫印迹（western blotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测3个部分组成，是根据抗原抗体特异性结合检测样本中某种蛋白的方法，与ELISA不同的地方在于WB是一种半定量的检测方法。

操作流程如下：下面详细介绍一下每个操作步骤：一、样本的制备（1）样本一般是组织和细胞，根据样本类型的不同，选择合适的裂解液：样本类型裂解液全细胞NP-40、RIPA细胞质（可溶性）Tris-HCl细胞质（细胞骨架）Tris-Triton膜结合部分NP-40、RIPA细胞核RIPA、核裂解液线粒体RIPA（2）抑制剂，根据研究的目的蛋白进行选择，假如要检测磷酸化的蛋白含量，就要对磷酸酶进行抑制，现在很多公司都有多种抑制剂的混合物抑制剂靶点浓度2μg/ml抑肽酶胰蛋白酶、血纤维蛋白溶酶亮抑酶肽溶酶体1-10μg/ml胃蛋白酶抑制剂A Asp蛋白酶1μg/mlPMSF Asp蛋白酶1mMEDTA 镁和锰金属蛋白酶1-5mMEGTA 钙金属蛋白酶1mM氟化钠丝氨酸和苏氨酸磷酸酶5-10mM原钒酸盐酪氨酸磷酸酶1mM焦磷酸盐丝氨酸和苏氨酸磷酸酶1-2mMβ-甘油磷酸盐丝氨酸和苏氨酸磷酸酶1-2mM（3）要加入loading buffer（BME、DTT，目的是减少蛋白高级结构的形成）主要成分主要功能SDS 使蛋白变性并带上负电荷BME或DTT 减少二硫键的形成溴酚蓝离子型染料，可观察蛋白迁移甘油增加样品密度，起沉降作用（4）煮沸变性：一般是99°C，10min，水浴锅煮沸时，防止EP 管盖弹开，使水浴锅内的水进入。

二、凝胶电泳（1）配胶。

这里说的都是SDS变性胶，先配分离胶，再配浓缩胶。

根据目标蛋白分子量的大小，选择合适的分离胶浓度，分子量越高，分离胶的浓度越低。

浓缩胶一般用的都是5%。

配胶时需注意以下几点：①玻璃板清洗后，为了使表面的水快速晾干，可以在烘箱中放置几分钟，拿出来的时候一定要晾到室温再灌胶，不然很容易产生气泡；②配胶用的试剂一般都是在4度冰箱保存，当我们按比例配好混合液的时候，要等混合液恢复室温时，再灌胶，不然也很容易产生气泡；③加水液封时，速度要慢，可用1ml枪沿着胶板上沿反复移动，不然很容易将分离胶冲变型。