WesternBlot基本原理及操作
免疫印迹(Western Blot)的基本原理、实验步骤
活性蛋白整体方案免疫印迹(Western Blot)的基本原理、实验步骤Western Blot原理Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
SDS-PAGE 可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。
固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
转移后的NC膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如5%BSA 或脱脂奶粉溶液）处理，封闭NC膜上的疏水结合位点。
用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。
用一抗处理过的NC膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。
处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。
实验操作(一)配胶1.将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
2.分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡），加入10%AP及TEMED即可。
3.封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。
封胶后静置至胶凝固。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O活性蛋白整体方案冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。
4.灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时防止气泡进入梳孔使梳孔变形。
拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。
WesternBlot原理和操作方法(全)讲解
Western Blot 原理和操作方法（全）Western Blot工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广旱挠τ?SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳.另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.重要参数①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100%其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml)②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度:蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)<104 20-301×104-4×104 15-204×104-1×105 10-151×105-5×105 5-10>5×105 2-5③分离胶:电泳凝胶浓度试剂10% 12% 15% 10% 12% 15%H2O(ml) 4.0 3.3 2.3 5.9 4.9 3.430%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 3.3 4.0 5.0 5.0 6.0 7.51.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.5 2.5 2.53.8 3.8 3.810%SDS(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.1510%AP(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15TEMED(μl) 4 4 4 6 6 6总体积(ml) 10 15④浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 4 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 1 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 1 0.510%SDS(μl) 80 4010%AP(μl) 60 30TEMED(μl) 8 4总体积(ml) 6 3蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤Western blot原理及步骤。
Western blot（简称WB）是一种常用的蛋白质分析技术，通过检测特定蛋白在混合物中的存在和量来研究蛋白质的表达和功能。
它是一种通过特异性抗体对蛋白质进行识别和检测的方法，具有高灵敏度和高特异性的特点。
本文将介绍Western blot的原理及步骤，希望能对初学者有所帮助。
一、原理。
Western blot的原理基于蛋白质的电泳分离和免疫检测。
首先，待检样品经过SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜（PVDF）或硝酸纤维素膜上。
接下来，膜上的蛋白质与特异性的一抗结合，再与二抗结合，形成特定的免疫复合物。
最后，通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量。
二、步骤。
1. 样品制备。
将待检样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，并在100℃水浴中煮沸5分钟，使蛋白质变性。
然后冷却至室温，并离心去除沉淀物。
2. 凝胶电泳。
将样品加载到SDS-PAGE凝胶孔中，进行电泳分离。
根据蛋白质大小选择合适的分离凝胶浓度和电泳条件。
3. 转膜。
将凝胶中分离的蛋白质转移到PVDF或硝酸纤维素膜上，通常使用半干法或湿法转膜。
4. 封闭。
将转膜浸泡在牛血清蛋白（BSA）或非脂奶粉的封闭缓冲液中，阻断非特异性结合位点。
5. 抗体孵育。
将特异性的一抗加入封闭转膜的缓冲液中，孵育一定时间，使一抗与目标蛋白结合。
6. 洗涤。
用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的一抗。
7. 二抗孵育。
将与目标蛋白特异性结合的二抗加入转膜的缓冲液中，孵育一定时间，形成特异性的免疫复合物。
8. 洗涤。
用洗涤缓冲液洗涤转膜，去除未结合的二抗。
9. 检测。
通过化学发光或染色等方法检测蛋白质的存在和量，最终得到Western blot结果。
总结。
Western blot技术是一种重要的蛋白质分析方法，具有高灵敏度和高特异性的优点。
掌握其原理及步骤对于科研工作者来说至关重要，希望本文能够对初学者有所帮助。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
Western Blot原理、显色分类及操作步骤
Western Blot原理、显色分类及操作步骤(2008-08-14 23:07:59)标签：western blot显色教育一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
二、操作步骤：(一) 配胶1、注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。
一、Western Blot的原理Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、操作步骤（一）蛋白质样品获得：1.所需试剂：(1)蛋白酶抑制剂mix：hjjhh储存浓度5ml mix中的加入量终浓度*PMSF（溶于乙醇）100mM 25ul 50uM*Trypsin Inhibitor 1mg/ml 250ul 50ug/ml*EGTA（pH8.0）0.5M 80ul 8mM*EDTA（pH8.0）0.5M 10ul 1mMAprotinin 1mg/ml 25ul 5ug/mlPepstatin（溶于乙醇）0.2mg/ml 50ul 10ug/mlLeupeptin 5mg/ml 100ul 0.1mg/mlBenzamidine 100mM 250ul 5mMNaF 5M 250ul 250mMNaVO4（FW183.8）0.2M 25ul 1mM注意：*代表必须加的试剂(2)细胞裂解缓冲液(培养细胞用)：1% NP40, 25 mM Hepes。
westernblot原理及过程
westernblot原理及过程
1、Western Blot的原理是：蛋白质是带电的，在聚丙烯酰胺凝胶中通过SDS-PAGE分离蛋白质后，蛋白质被固定在凝胶中。
当凝胶被转移到支持物（例如NC膜或PVDF膜）上时，蛋白质在膜上保留其电荷。
通过针对特定氨基酸序列的特异性抗体作为探针检测蛋白质的位置。
这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析。
2、Western Blot的过程大致分为以下几步：
蛋白提取：从细胞或组织中提取总蛋白质混合物。
蛋白定量：确定凝胶中蛋白质的浓度。
SDS-PAGE电泳：通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物。
电转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到支持物（例如NC膜或PVDF 膜）上。
封闭：用含有去污剂和牛血清白蛋白的溶液处理膜，以封闭膜上的任何未结合位点。
抗原-抗体免疫反应：使用特异性抗体检测目标蛋白质的位置。
蛋白检测：使用化学发光剂检测膜上的目标蛋白质。
western blot技术的原理方法注意事项
western blot技术的原理方法注意事项一、原理Westernblot是一种常用的蛋白质检测技术，其基本原理是蛋白质的印迹技术，即把蛋白质从复杂的样品中分离出来，并转移到固相支持物上，再与特异性抗体结合，通过显色或电子显微镜观察鉴定蛋白质的表达和分布情况。
二、方法1.样品处理：首先，需要将蛋白质样品进行提取、分离和纯化。
根据样品性质，可以采用不同的提取方法，如细胞裂解液、组织匀浆液等。
2.凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品转移到分离胶中，通过电泳将不同分子量的蛋白质分离。
3.免疫反应：将膜上的蛋白质与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
4.显色反应：通过化学反应，使抗原-抗体复合物显色，便于观察和拍照。
5.电子显微镜观察：对于较小的样品，可以采用电子显微镜对蛋白质进行观察和定量分析。
三、注意事项1.样品处理：提取的蛋白质样品应尽可能保持完整性和纯度，避免在提取、分离和转移过程中发生变性或降解。
2.凝胶电泳：分离胶的选择应根据待测蛋白质的分子量大小进行，以确保蛋白质能够完全分离。
同时，应注意电泳过程中的电压、电流和时间等参数，避免过度电泳导致蛋白质失活或降解。
3.免疫反应：应注意抗体滴度的选择，确保抗体能够充分识别目标蛋白质。
同时，应避免使用过期或质量不佳的抗体。
4.显色反应：应注意显色试剂盒的质量和操作步骤，确保显色反应充分且颜色易于观察。
同时，应注意显色颜色的稳定性，避免因颜色不稳定影响结果判断。
5.电子显微镜观察：应注意电子显微镜的操作步骤和设备维护，确保电子显微镜能够正确成像。
同时，应注意样品的制备和处理，确保样品能够被电子显微镜准确观察。
6.实验条件：实验过程中应注意调整实验条件，如孵育时间、洗膜次数、抗体稀释度等，以确保实验结果的准确性和可靠性。
7.重复性：在进行Westernblot实验时，应注意重复性实验的开展，以减少实验误差和提高实验结果的可靠性。
总之，Westernblot技术虽然复杂，但只要掌握了其原理和方法，并注意以上注意事项，就能够获得准确可靠的结果。
WesternBlot原理和操作方法
WesternBlot原理和操作方法样品制备是Western Blot起始的步骤之一、首先，需要从生物学样本中提取目标蛋白质。
常见的提取方法包括细胞裂解、组织均质和亲和纯化等。
提取后的样品需要经过蛋白质浓度测定，以确保加载相同数量的蛋白质。
接下来，需要将样品进行电泳分离。
这通常是通过聚丙烯酰胺凝胶（SDS-）电泳实现的。
SDS（十二烷基硫酸钠）能够破坏蛋白质的非共价键，使蛋白质呈现线性构象。
电泳根据蛋白质的分子量将其分离成不同的带状条带。
接下来是转膜的步骤。
将凝胶中分离的蛋白质转移到聚合物膜上。
这通常是通过湿式转膜实现的，其中聚合物膜与凝胶是紧密接触的。
电场将带有电荷的蛋白质从凝胶中转移到膜上。
然后进行免疫反应。
转膜后的膜需要被阻断以避免非特异性结合。
一般会使用非特异性蛋白质溶液，如牛血清蛋白（BSA）或脱脂奶粉。
然后，在阻断溶液中加入一种特异性的抗体，抗体可以与感兴趣的蛋白质结合。
抗体结合的蛋白质可以被进一步检测。
最后是图像开发阶段。
Western Blot的图像开发通常是通过酶标记二抗的荧光或酶标记产生的化学发光。
这意味着在膜上的蛋白质上有特异性抗体结合。
然后，在图像上使用相应的技术来检测抗体结合的蛋白质，以获得目标蛋白质的图像。
总结起来，Western Blot是一种广泛应用于生物学研究的技术，用于分析复杂的蛋白质混合物。
它通过电泳和免疫反应的结合，可以检测和分离出特定的蛋白质。
虽然操作过程较为复杂，但其可靠性和准确性使其成为许多实验室中常用的技术。
westernblot原理及步骤
1.western blot即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
2.原理简单来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。
通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗.经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变.以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
3.分类Western Blot显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影ii.底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL.只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带.4.其他值得一提的是,western blot 这个名称的由来很有意思.最开始做印迹工作的是一个叫做Southern的科学家,但印迹的对象是DNA 链,他把这种技术称为Southern blot,后来类似的出现了两个过程相似,但是对象不同的印迹方法,一个针对RNA,一个对蛋白质,人们分别把这两种技术的称为Northern和Western,与这两个技术的发明人没有关系了.。
westernblot原理
westernblot原理
Western Blot（西方印迹法）是一种鉴定蛋白质的细胞生物学实验技术。
它利用电泳
技术将感兴趣的蛋白质从细胞内及外的复杂的混合物环境中分离出来，然后在一特殊条件
下将其用抗体、特异性反应连接物或其他特定标记检测方法检测出来。
Western blot技术的基本原理与免疫学原理一致，即检测抗原的特异性抗体的特性。
例如，当抗原蛋白质混合物中存在特异性的抗原性基因片段时，检测抗原蛋白质的抗体将
特异性地结合到抗原基因片段上，而检测抗原蛋白质混合物中不存在的或者很少存在的其
他抗原性基因片段，则不会被特异性抗体结合，而是被特定标记检测方法检测出来。
Western blot实验技术步骤包括：1）将抗原性蛋白质混合物经过抗体特异性抗原基
因片段的凝集形成蛋白质复合体；2）利用电泳技术将能够形成蛋白质复合体的蛋白质物
质从细胞内和外的复杂环境中分离出来；3）在一定条件下用抗体或其他特定标记检测方
法将这些分离出来的蛋白质物质检测出来，根据检测结果判断各个抗原之间的关系。
Western blot实验技术的优点在于它能够快速、简单的检测抗原性蛋白质的特异性，它也可以检测在细胞内外复杂环境中出现的相对较少的蛋白质物质，尽管抗体的能力有限，受到环境的影响，但仍可以达到较高的检测精度。
由于西方印迹法可分离复杂混合物中不
同的蛋白质，因此它是生物学实验研究中必不可少的一部分，广泛应用于细胞学、分子生
物学和分子遗传学等领域。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤蛋白免疫印迹即Werstern blot，是将印迹技术与抗原-抗体反应的特异性相结合的检测技术，用于分离和检测生物标本中的某一特定蛋白。
其基本原理实混合蛋白质样本通过凝胶电泳分离后，通过特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（NC膜或PVDF 膜）上，将针对待测蛋白的特异性抗体作用于滤膜上，利用抗体上偶联的酶降解底物在滤膜上生成有色沉淀物或化学发光产物，从而显示出待测蛋白的存在及量。
Western blot原理通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
Western blot实验步骤一、样本制备1、样本的来源：细胞培养上清；细胞（胞浆蛋白、胞膜蛋白、胞核蛋白）；组织匀浆2、不同样本有不同的提取方式：蛋白完全裂解液、RIPA、胞核/胞浆3、蛋白的提取：裂解前加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂使其终浓度为1mM4、蛋白定量：BCA检测法(灵敏度高，操作简单，常用)、Bradford 检测法、Lowry 检测法、UV测量、电泳检测5、样本上样前的处理：蛋白提取液和SDS上样缓冲液（Loading buffer）以一定的比例上样6、蛋白变性：95-100℃变性5分钟（为了能使抗体接触到抗原表位，必须将蛋白的三维结构打开，因此需要将蛋白变性，核蛋白要增加裂解液体积和超声破碎次数，煮样时间延长至10-15min）二、上样与电泳原理：裂解后的蛋白质样本经过高速离心去除不溶物后，再经SDS上样缓冲液95-100℃变性5分钟，使带有强负电荷的SDS与带有弱电荷的蛋白质结合，大量的SDS可掩盖蛋白质本身的电荷量，只显示SDS的负电荷，在pH8.6~pH8.8的Tris-甘氨酸不连续SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）系统中，蛋白质的电泳与自身电荷量无关，只和其分子大小有关，从而将蛋白质按分子量大小顺序分离。
western blot 实验原理
western blot 实验原理Western blot是一种常用的蛋白质分析技术，通过将待检测样品中的蛋白质分离并转移到膜上，然后使用特异性的抗体探针进行特定蛋白质的检测。
Western blot实验主要包括以下步骤：1. 样品制备：待检测样品通常经过细胞裂解或组织研磨，提取蛋白质。
蛋白质溶液经过蛋白浓度测定后，可进行下一步实验。
2. SDS-PAGE电泳：蛋白质溶液经过加入含有SDS（十二烷基硫酸钠）的样品缓冲液，并在电泳条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel）分离蛋白质。
在电泳过程中，SDS会使蛋白质变成带负电荷的线性结构，相同大小的蛋白质在凝胶中的迁移速度也相似。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素（nitrocellulose）膜上。
转移通常通过将膜和凝胶在电流作用下接触，使蛋白质通过电场转移到膜上。
4. 阻断：将转移后的膜放入含有蛋白质的牛乳或鸡蛋清中，使未特异性结合位点被占据，阻断非特异性结合。
通过此步骤可以减少假阳性的可能性。
5. 抗体探针结合：将特异性抗体溶解在牛乳或鸡蛋清中，并将膜与抗体溶液接触。
抗体将与目标蛋白质特异性结合。
6. 信号检测：使用染色剂或酶标记的抗体来检测抗体-目标蛋白质结合的位置。
这些检测方法可以根据被标记物的类型而有所不同，如酶方法、放射性方法和荧光方法等。
7. 结果分析：使用成像系统（如X射线胶片或数码成像设备）捕捉膜上的信号，并在计算机软件中进行定量和定性分析。
Western blot技术可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰以及蛋白质相互作用等，广泛应用于生物医学研究、生物制药和临床诊断等领域。
western blot 原理
western blot 原理Western blot是一种常用的蛋白质检测方法，可用于确定特定蛋白质在细胞或组织样品中的存在与表达水平。
此方法通过将蛋白质分离、定位和检测，能够提供关于目标蛋白质的定性和定量信息。
Western blot的基本原理包括以下几个步骤：1. 蛋白质的提取与分离：首先需要从细胞或组织样品中提取目标蛋白质，常用的方法包括细胞裂解和离心等步骤。
然后，将提取得到的蛋白质样品进行电泳分离，通常使用SDS-PAGE （酶解电泳）进行蛋白质的分子量分离。
2. 蛋白质的转移：将分离蛋白质从凝胶中转移到聚丙烯酰胺（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这个步骤称为电转移。
转移蛋白质的方式通常是通过将凝胶和膜浸泡在缓冲液中，应用电流使蛋白质迁移至膜上。
3. 膜上蛋白质的定位：用一种被检测蛋白质特异性的抗体与膜上的蛋白质进行特异性反应。
抗体可以通过与目标蛋白质结合，从而形成抗原抗体复合物。
一般来说，首先将膜经过一定的预处理，如在一定的温度和时间下与非特异性的蛋白质结合来降低假阳性结果的发生。
然后，再与特异性的一抗结合，洗去非特异性的一抗，接着与特异性的二抗结合。
4. 信号的检测与显色：在本步骤中，标记有荧光物质、放射性或酶（如辣根过氧化物酶）的二抗将与特异性一抗结合的位置标记出来。
酶类辅助物质（如酶底物和显色剂）可以产生颜色或荧光，使膜上的特异性蛋白质位置可视化。
这些标记的二抗将与抗体结合的位点产生可检测的信号。
5. 数据分析：通过将成像结果进行定量或半定量分析，可以测量目标蛋白质的数量或相对表达水平。
Western blot方法的前提是已知蛋白质的抗体信息，因此以此为基础进行蛋白质的检测、表达水平的分析等。
该方法广泛应用于生物医学、分子生物学、免疫学等领域。
westernblot法原理
westernblot法原理
westernblot原理：蛋白质的电泳分离。
是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。
（一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。
然后4℃，13,g离心15min。
取上清液作为样品。
（二）电泳：制取电泳凝胶，展开sds-page。
（三）转移：（半干式转移）
1、电泳完结后将胶条割至最合适大小，用转膜缓冲液均衡，5min×3次。
2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和nc膜，浸入转膜缓冲液中10min。
3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、nc膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序摆不好，滤纸、凝胶、nc膜准确对齐，每一步除去气泡，另一头g重物，将碳板上多余的液体化成。
拨打电源,恒流1ma/cm2，迁移1.5hr。
迁移完结后，断裂电源将膜抽出,生口待测膜条搞免疫系统印迹。
Western blot的原理、操作及注意事项
Western blot的道理、操纵及留意事项之杨若古兰创作道理：通过电泳区分分歧的组分，并转移至固相撑持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物资进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng （最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白.一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗濯后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清.加入βME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于20℃保管，用时取出，直接溶解上样.2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清.加入βME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于20℃保管，用时取出，直接溶解上样.3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入βME、溴酚蓝制样.B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量缘由1.双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法.在须要快速，但不很精确的测定中，经常使用此法.硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的初期阶段是非常有益的.双缩脲法的道理是Cu2+与蛋白质的肽键，和酪氨酸残基络合，构成紫蓝色络合物，此物在540nm波利益有最大接收.双缩脲法经常使用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定.干扰物有硫醇，和具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等.可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定.2.Lowry法：此法是双缩脲法的进一步发展.他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性溶液中构成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷磷钨酸试剂（福林酚试剂），结果得到深蓝色物.此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液.其干扰物资与双缩脲法不异，而且受他们的影响更大，硫醇和很多其他物资的存在会使结果严重偏差.另外要留意的是，加入福林试剂时要特别当心，试剂只在酸性pH环境中才波动，上述提到的还原反应只要在pH10时才发生，是以，福林试剂加入到碱性的Cu2+蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸磷钨酸试剂在未被破坏之前能无效地被Cu2+蛋白质络合物所还原.3.紫外接收法：大多数蛋白质在280nm波利益有特征的最大接收，这是因为蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的原因，是以，利用这个特异性接收，可以计算蛋白质的含量.如果没有干扰物资的存在，在280nm处的接收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液.部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波利益有最大接收.有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校订，普通按下述公式粗略计算：是蛋白质溶液在280nm波利益（光程1厘米）测得的光密度值.是蛋白质溶液在260nm小波利益（光程1厘米）处所测得的光密度值.此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的.是以，对其他蛋白质和其他核酸纷歧定适用.因为各种蛋白质所含芳喷鼻族氨基酸的量分歧，是以，浓度为0.1%的各种蛋白质在280nm处的消光系数（）在0.5～2.5之间变更.所有的蛋白质在230nm以下都有强接收.例如，牛血清白蛋白的α0.1%在225nm和215nm处分别为5.0和11.7，而在280nm处测为0.58.在230nm以下的强接收是因为肽键的存在，是以，此值对所有的蛋白质都是一样的.从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10μl/ml～100μl/ml的蛋白质.蛋白质浓度可以近似地由下式得到：光密度之差求得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分发生的误差.但是，蛋白质之间的分子量差别比较大，是以，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校订.因为蛋白质的接收峰常因pH改变而变更，所以在建造尺度曲线时，必须与样品条件分歧.4. Bradford比色法：Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单敏捷.用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲零碎的干扰.分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20µl），以0.15mmol/l NaCl补足至100µl，同时以两管100µl的0.15mmol/l NaCl作空白对照.每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟.用1cm光径的微量比色杯测A595，取A595吸光值对尺度蛋白浓度作图，画尺度曲线，并测量待测样品的A595.从BSA尺度曲线中确定待测样品的浓度.测定10100µg的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体积增大5倍进行.样品浓度过高，可浓缩后进行，或在10100µg另作一尺度曲线进行测定.5．电泳估算法（我们选择此法）：样品倍比浓缩，SDSPAGE电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度.以提取癌组织总蛋白为例：① 取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5～10次，再用预冷的1×PBS洗濯3次，目的是去除样本中的血液.② 每2克组织加入3ml 1×PBS匀浆，坚持在4℃条件进行.③ 加入5×STOP Buffer缓冲液1ml，混匀，4℃下超声碎化.再加入0.5ml βME，0.5ml溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成；④ SDSPAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度.二、SDS聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）A：实际操纵1.做胶前的筹办1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子.2)检查是否有新颖的，充足10%APS，没有立刻重配.3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量.2.制胶，电泳1）装好架子.2)按照上面配方配制分离胶.(单位：ml，Total： 8ml)在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集.3)待分离胶凝集后，配制浓缩胶.(单位：ml，Total： 3.5ml)倒好后拔出事后筹办好的梳子.4)待胶凝集好后，上样，电泳. 上层胶用6080V电压，当样品至分离胶时，用100120V电压.普通电泳时间在1.5小时摆布.B ：留意事项及常碰到的成绩1）分离胶不要倒的太满，须要有必定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩后果.2）上样蛋白量不该超出30ug/mm2 (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm，则载荷面为：1mm×5mm=5mm2) .3）gel通常在0.51h内凝集最好，过快暗示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶.太慢则说明两种试剂用量不敷或者零碎实际不纯或实效.4）混合搅拌速度太快发生气泡影响聚合，导致电泳带畸形.太慢不均匀，特别是甘油.5）电泳中常出现的一些景象：︶条带呈笑容状，缘由：凝胶不均匀冷却，两头冷却欠好.︵条带呈皱眉状，可能是因为安装分歧适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完整.拖尾：样品溶解欠好.纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒.条带偏斜：电极不服衡或者加样地位偏斜.条带两边扩散：加样量过多.三、转移在电流的感化下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上.膜的选择：印迹中经常使用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等.我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，和具有更好的化学兼容性.有两种规格：ImmobilonP（0.45um）和ImmobilonPSQ(0.2um for MW<20kDa).A 半干法即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的后果.因为电流直接感化在膜胶上，所以其转移条件比较严格，但是其转移时间短，效力高.1 实验条件的选择电流1mA2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整.2 实验操纵（1）滤纸和膜的筹办(在电泳结束前20分钟应开始筹办工作).A.检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制.B.检查是否有合适大小的滤纸和膜.C.将膜泡入甲醇中，约12分钟.再转入transfer buffer中.D.将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer中.（2）转移A.在电转移仪上铺好基层滤纸.普通用三层.B.将膜铺在靠膜滤纸上，留意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer buffer到膜上，坚持膜的湿润.C.将胶剥出，去掉stack gel，当心的移到膜上.D.剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标识表记标帜出胶的地位.E.将一张靠胶滤纸覆盖在胶上. 倒上些transfer buffer，再铺两张靠胶滤纸.F.装好电转移仪，根据须要选定所需的电流和时间.G.转移过程中要随时观察电压的变更，如有异常应及时调整.靠胶滤纸胶膜靠膜滤纸3 留意事项及常碰到的成绩1）滤纸、胶、膜之间的大小，普通是滤纸>=膜>=胶.2）滤纸、胶、膜之间千万不克不及有气泡，气泡会形成短路.3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完整浸湿.而且在当前的操纵中，膜也必须随时坚持湿润（干膜法除外）.4）滤纸可以反复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸必定不克不及弄混，在不克不及分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的.5）转移时间普通为1.5 小时，( 1mA2mA/cm2，10% gel)，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小.B 湿法我们基本上不必此方法，这里暂不做介绍.C 转移后后果的鉴定1．染胶用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的后果.2．染膜有两类染液选择，可逆的和不成逆的.可逆的有ponceaus red 、Fastgreen FC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用.但是不成逆的染料，如考马斯亮兰、india ink、Amido.black 10B等，染色后膜就不克不及用于进一步的分析.四、封闭（block）封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合.经常使用的封闭液有bovine serum albumin(BSA)，nonfat milk，casein，gelatin，tween20等，我们普通用nonfat milk.在转移结束前配好5%的Milk(TBST溶解).转移结束后将膜放入milk中block(必定要放在干净的容器里，防止净化而且要足以覆盖膜)，并清洗清算好用过的滤纸，以便下次使用. Block 4°C O/N，或 RT 1小时.五、孵育一抗A.先将须要检测的抗体筹办好，并决定好它们的浓缩度.B.配好5%的Milk(TBST溶解)，按请求浓缩好抗体.留意，如需高比例浓缩，最好采取梯度浓缩.C.将浓缩好的抗体和膜一路孵育. 普通采取RT 1小时，可根据抗体量和膜上抗原量适当耽误或缩短时间.留意：为了便于后面分析结果，我们普通会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育.六、洗濯用TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉.然后5mins *5.洗濯是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗濯的后果直接影响结果布景的深浅.七、孵育二抗孵育RT1 小时. 普通采取HRP标识表记标帜的二抗，浓缩比例为1:5000.二抗的浓缩比例不克不及太低，否则容易导致非特异性的结合.留意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，和根据后面的显色条件来选择HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶链的二抗或者标记其他探针（如核素等）的.八、洗濯用TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉. 然后5mins *5.洗濯是为了洗去二抗的非特异性结合，洗濯的后果直接影响结果布景的深浅，所以洗濯必定要干净.九、显色（HRP酶）1．加强化学发光法(ECL)Ecl 显色道理：氨基苯二酰肼类主如果鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最经常使用的一类化学发光剂.鲁米诺（luminol，5＇氨基2，3二氢1，4酞嗪二酮）的分子结构及化学反应式如下：鲁米诺在免疫测定中既可用作标识表记标帜物，也可用作过氧化物酶的底物.在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的感化下，发出荧光来.试验步调：1）将两种显色底物1：1等体积混合（普通各1ml/membrane）.2）将混合物覆盖在膜概况，12分钟，摇摆使均匀.3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中.4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min.5）显影、定影.6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最好结果.留意：荧光在一段时间后会愈来愈弱.DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应发生棕色的不溶终产品.这类棕色沉淀不溶于酒精和其它无机溶剂，对于必须使用传统复染和封固介质的免疫组化染色利用特别理想.对于AP标识表记标帜的二抗我们选用BCIP and NBT 显色，它们在碱性磷酸酶（AP）感化下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强旌旗灯号.十、分析结果及其判断罕见成绩缘由分析及处理方法：见附录一、二.附录一：Troubleshooting Blotting Problems （P43－48）附录二：Western Blotting Troubleshooting Logic Tree （P390－394）附录三：试验中所用到的试剂和缓冲溶液1)5x Stop Solution (Sample buffer)pH6.7:Stock:to use:20% Glycerol 100ml take 9.5ml stock250mM Tris 15.14g bromphenol blue ortotal 475.00ml pyronine 4 to taste2) Gel solution (30% w/v acrylamide mix):total 100ml3) 2x Laemmli Separation Buffer:0.2% SDS 10ml 20% SDStotal 1000ml4) 2x Laemmli Stacking Buffer:0.2% SDS 1gtotal 500ml5) 10x Laemmli Running Buffer:1% SDS 20gtotal 2 liters6) Transfer Buffer:20% MeOH 200mltotal 1000ml7) TBST:100mM NaCl0.2% Tween20Total 1000ml8) Coomassie Stain :40%MeOH 400ml10%HAc 100ml0.1%BBR 1g Brilliant Blue R total 1000ml9) Destain:30%MeOH 300ml7.5%HAc 75mltotal 1000ml10) 10×丽春红染液配方：丽春红 2g磺基水杨酸 30g三氯醋酸 30gtotal 100ml11）DABDAB 50mg0.05mol/L TB （PH7.6） 100ml30%H2O2 3040ul先配成25倍的储存液，过滤后分装，20℃避光保管，H2O2在工作液中终浓度0.01％.。
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转膜
转膜
转膜
转膜
转膜
转膜中的要点与建议
封闭
抗体孵育
抗体孵育
直接法与间接法的比较
直接法 快速（一种抗体）
间接法 额外的二抗孵育以及条件优化
没有二抗交叉反应引起的非特 交叉反应引起的非特异性条带 异性条带
无信号二级放大 免疫反应性降低
Western Blot基本原理及操作
中山医院临床医学研究院 侯嘉云
hou.jiayun@
Michael A. Milhollen, cancer research, 2011
流程
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
蛋白提取
谢谢！
癌性，可通过皮肤吸收及呼吸道进入人体，其作用具有积累性。聚丙烯酰胺无毒， 但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分 • Bis （甲叉双丙烯酰胺）：有毒，影响中枢神经系统，切勿吸入粉末 • AP(过硫酸铵)：对黏膜和上呼吸道组织、眼睛和皮肤有极大危害性。吸入可致命 • TEMED：强神经毒性，防止误吸，操作时快速，存放时密封 • NaN3 (叠氮钠)：毒性非常大，阻断细胞色素电子运送系统
从而电泳时易烧胶 • 保持所有装置清洁； • 试剂要有正确的pH值，及妥当的保存
凝胶电泳
Staking gel Separating gel
小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥； 浓缩胶 80v左右，分离胶100v左右
上样的注意要： • 20--50ug总蛋白 或100ng纯蛋白， 可根据蛋白 表达水 平进行优化； • 尽量保持每个泳 道的蛋白量一样， 体积尽量一致； • 样品两侧的及空 置的泳道用等体积 的1×loading buffer上样
• Triton X-100：引起严重的眼睛刺激和灼伤，可因吸入、咽下或皮肤吸收而受害 • SDS (十二烷基硫酸钠)：有毒，是一种刺激物，并造成对眼睛的严重损伤的危险 • DTT （二硫苏糖醇）：很强的还原剂，散发难闻的气味，可因吸入、咽下或皮肤吸
收而危害健康，由于容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差 • Acr（丙烯酰胺）：具有很强的神经毒性，同时还有生殖、发育毒性，可能具有致
信号放大灵敏度高（多个二抗 结合位点）
免疫特异性不受标记影响
对照
内参的选择
• 目的蛋白分子量 相差5KD以上
• 实际的试验环境 组织缺氧、糖尿病： GAPDH升高 凋亡及移除核膜： Lamin 骨骼肌：beta-actin
检测方法
常见问题-信号弱或无信号
常见问题-高背景
常见散
常见问题-条带弯曲
常见问题-其他
安全注意事项
原则 操作有毒试剂，带口罩和手套 操作挥发性试剂应在通风橱中进行
安全注意事项
• PMSF：苯甲基磺酰氟是一种高强度毒性的胆碱酯酶抑制剂，它对呼吸道黏膜、眼 睛和皮肤有非常大的破坏性，可因吸入、咽下或皮肤吸收而致命
蛋白定量
蛋白定量
• 简介 以医院logo颜色为整体色系，总体以简洁、
突出ppt展现内容为主。
• 简介
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样品准备
样品制备过程中的一些要点与建议
• 收集细胞离心时转速需适当； • 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子； • 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的对蛋白 修饰的改变，制备过程应在低温进行； • 样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直 接以液体状态置 -80℃中保存，但要注意不要反 复冻； • 煮样时防止爆管
分离胶凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶制备-分离胶
灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
浓缩胶(5%)
凝胶制备-积层胶
灌制积层胶
插入梳子
制备凝胶中的要点
• AP要新鲜配制； • 混合搅拌速度太快易产生气泡影响聚合， 导致电泳带畸
形，太慢不均匀； • 分离胶勿倒的过满，需留一定的空间； • 凝胶需缓慢凝固，TEMED、AP用量过多会导致胶太硬，