人HIF1α基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定

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人HGF基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的构建和鉴定[1]

cation of recombinant retrovirus vector containing HGF gene and its steady packaging cell line
WANG Yun2Fang , NAN Xue , YUE Wen , LI Yan2Hua , YAN Fang , PEI Xue2Tao 3
图 1 重组逆转录病毒载体质粒构建流程示意图
换完全培养液。细胞转染 48 h 后按 1∶15 传代 ,加入含 600 μg/ ml G418 筛选 14 d ,直至抗性细胞集落形成。挑选大的健康的细胞集落 ,用完全培养液扩大培养 ,以制备含病毒的包装细胞上清 ,测定病毒滴度并冻存细胞。 1. 5 重组逆转录病毒滴度的测定
PT67 细胞用含 10 %胎牛血清的 DMEM/ F12 培养液 (完全培养液) 培养至 95 %汇合。将 pMSCV2HGF 5μg 加入 250μl 无血清培养液 ,取 LF2000 10μl 加入 250μl 上述培养液 ,两者混匀后于室温放置 20 min。将 PT67 细胞用培养液洗 2 次 ,缓慢滴入用 1 ml 培养液稀释的 DNA2LF2000 混合液。培养 6 h 后 ,加入 1 ml 含 20 %胎牛血清的培养液 ,继续培养 24 h 后更
军事医学科学院院刊 2004 年 6 月第 28 卷第 3 期
Bull Acad Mil Med Sci , Jun 2004 ; Vol 28 No 3
205
人 HGF 基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的构建和鉴定
论著
王韫芳 , 南雪 , 岳文 , 李艳华 , 闫舫 , 裴雪涛 3
根据 hHGF2cDNA 编码区的序列并分别引入 Hpa Ⅰ和 BamH Ⅰ酶切位点合成引物 1 , P1 : 5′2CCG GTTAAC AT2

Anti-HIF-1α-pEGFP重组质粒的构建及表达

［ｂｔａｔＡｓｒｃ］
０ｂｅｔｅＴｏｃｎｔｕｔａｄｔａｓｅｔＨＩ一（ｙｏｉｉｄｃｌｆｃｏｓｅｅｒｃｍｂ— ｊｃｉｏｓｒｃｎｒｎｆｃＦ１【ｈｐｘａｎｕｉｅａｔｒ）ｇｎｅｏｉｖ０ — ｂ
ｎｎｎｉｅｓｌｓｉＥＧＦＰＨＩ一ａｉｒｅｏｄｔｃｈｕｃｉｎｏｈＩ－ａｐｏｅｎＭｅｈｄ — ａｔａｔｓｎｅｐａｍｄｐ — Ｆ１ｎｏｄｒｔｅｅｔｔｅｆｎｔｏｆｔｅＨＦ１ｒｔｉ．ｔｏｓＲｅ
ＩＮＡｒＰｉ’ ＬＡＳ — Ｉ＾ⅡＤＡＮＴＩＥＧＰ一ＦｌＩＨＩ＿＿ＨＩ－ａＮＡＥＣ】
ＯｇＴＲＵＣＯＮＮＳＴＩＡＮＤＥＸＰＲＥＳＩＳＯＮＯＦ
ＳｎｐｎｏｇＹｕｉｇ，ＴｉｎＸｕｈ，ＡｏＱｉｎａｎｌ。ｉ
（ｐａｔｎｆＤｅｍａｏｏｙ，ＤｏｇｕＨｏｐｉａｆｈｎ，Ｗ“ ａ３０４Ｄｅｒｍｅｔｒｔｌｇｏｎｈｓｔｌｏａｂｎ４０７：ＤｅｒｍｅｔｆＯｂｔｔｉｓ＆Ｇｙｅｏｏｙ，ＴｈｎｒｌＨｏｐｉａｆｈｎ，Ｗｕａ３０４；ｐａｔｎｓｅｒｃｏｎｃｌｇｅＣｅｔａｓｔｌｏＷｕａｈｎ４０１ＩｓｉｕｅｆｔｏｏｎｔｔｔＰａｈｌｇｙ，Ｔｏｊｏｐｉｌｎｐａｔｎｆｔｏｏｙ，ｏｎＨｓｔ，ａｄＤｅｒｍｅｔｏＰａｈｌｇｇｉａＴｏｊｄｉａｌｅ，ＨｕｚｏｇＵｎｖｒｉｙｏｃｅｃｎｃｎｌｇ，Ｗｕａ３００，ＣｉａｎｇＭｅｃｌＣｏｌｇｅｉａｈｎｉｅｓｔｆＳｉｎｅａｄＴｅｈｏｏｙｈｎ４０３ｈｎ）

HIF-1α基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

HIF-1α基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定【摘要】目的构建HIF-1α基因RNA干扰慢病毒载体。

方法选定HIF-1α基因RNAi靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ双酶切后的慢病毒载体pLentilox3.7(pLL3.7)连接,产生pLL3.7 HIF-1α慢病毒载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽取质粒后,用限制性内切酶XbaⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定,将阳性克隆送金斯特公司进行测序鉴定;用PHR、pVSVG和pLL3.7慢病毒载体共转染包装细胞293T细胞(磷酸钙转染法),包装产生慢病毒, 将收集的病毒上清经高速离心浓缩后,按一定比例稀释,然后感染293T细胞,用流式细胞仪检测293T细胞GFP蛋白的表达水平,从而测定病毒滴度。

结果酶切和测序证实,构建出HIF-1αshRNA的慢病毒载体pLL3.7 HIF-1α;包装慢病毒,测得离心的浓缩病毒悬液的滴度为2×108 TU/ml。

结论成功构建HIF-1α基因RNAi慢病毒载体。

【Abstract】Objective To construct a lentiviral vector of RNA interfered(RNAi)HIF-1αgene. Methods To confirm the targeting sequence of HIF-1α gene that can be effectively silenced by RNA inference. The cDNA containing both sense and antisense Oligo DNA fragments of the targeting sequence was designed, and cloned into the pLentilox3.7(pLL3.7) vector which was digested by XhoI and HpaI. The obtained lentiviral基金项目:厦门市卫生局资助项目(项目编号:3502Z20077055);厦门市科技局资助项目(项目编号:3502Z20089001)vector containing HIF-1α shRNA was confirmed by digestion and sequencing. Using lentiviral vector PHR、pVSVG and pLL3.7 HIF-1α to cotransfect 293T cells, then the collected lentivirus. The titer of virus was tested according to the expression level of GFP. Results Digestion and DNA sequencing demonstrated that the constructed lentivirus vector pLL3.7 HIF-1α which can produce HIF-1α shRNA. The titer of concentrated virus was 2×108 TU/ml. Conclusion The lentivirus RNAi vector targeting HIF-1α is constructed successfully.【Key words】HIF-1α;RNAi;Lentivirus缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是目前所发现的正常细胞以及肿瘤细胞适应缺氧的最关键的转录因子[1],其基因的功能研究具有非常重要的意义。

靶向卵巢癌HIF-1α基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定

ｐｕｅ．ｆ／ｅ粒带有绿色荧光蛋白基因，Ｓｐｒｇｎｏ质ｐ
序列对比，结果完全一致，示重组质粒构建成功。提
２２重组质粒转染ＳＯＶ／Ｄ．Ｋ３ＤＰ细胞
Ｒｅｅｓ５．ｖｒｅ：ＡＧＣＴｒＩ ℃ＣＡＡＡＡＡＡ［Ｉ ℃ＣＡＧＡＧＴＣＡＣＴ．
ＧＧＡＡＣＴＦＣ ℃ ＡＡＣＴｎＡＧ１Ｃ］ＡＧＡＣＩ ℃Ｇ ℃１ＧＧ一３
中国实验诊断学
２１００年８月
第１４卷
第８期
－－－—
—
１６２５・— －－ —
文章编号：０７２７２１）８２５２１０ —４８（０００ —１６ —０
靶向卵巢癌ＨＦ１基因ｓＮＩ一（］ｃｉＡ真核表达载体Ｒ的构建及鉴定
邹颖刚薛惠荣崔满华，，
（．１吉林大学第二医院妇产科，吉林长春１０４；．３０１２解放军第二二二医院妇产科）
ＲＡ干扰（ＮｔｅｎｅＲ）生物体内ＮＲＡｉｅｒｃ，Ｎ是ｎｒｅｆ普遍存在于ＲＡ水平上调节基因表达的方式… 具Ｎ１，有很强的转录后基因沉默作用，已广泛用于抗肿瘤
的研究中。缺氧诱导因子一ａ表达与肿瘤的耐药可１能有密切关系［卵巢癌细胞中亦有ＨＦ１蛋白的，Ｉ．ａ高表达Ｅ，３因此抑制卵巢癌细胞中ＨＦ１因的表ＪＩ．基达可能逆转肿瘤耐药。本研究构建靶向卵巢癌ＨＦＩｓＮ真核表达载体ｐｈＮ — Ｉ，进一步Ｉ—￣ｉＡＲｓＲＡＨＦ为

HIF1α-shRNA表达载体的构建与鉴定

HIF1α-shRNA表达载体的构建与鉴定HIF1α是一种重要的响应细胞缺氧的转录因子，参与了一系列细胞代谢和生存过程的调控。

因此，研究HIF1α的表达调控机制对于深入理解细胞生物学过程具有重要意义。

RNA干扰技术是一种有效的基因沉默方法，通过转染表达特定的shRNA序列可以降低目标基因的表达水平。

在本实验中，我们通过克隆HIF1α-shRNA序列到载体中，在细胞水平上验证其对HIF1α的抑制效果，为后续研究提供基础保证。

1. 载体构建我们选择pGPU6/GFP/Neo载体作为表达载体，该载体具有绿色荧光标记并带有慢病毒包装序列，适合于在细胞中稳定表达。

我们在载体中插入了针对HIF1α编码序列的shRNA 序列，并在该序列的末端添加了环状病毒MluI启动子和miR30e终止子。

所选shRNA序列如下：5'-GGTCCTGTGCTTCAACTAT-3'2. 载体鉴定为验证所构建的载体是否能在细胞中稳定表达HIF1α-shRNA，我们进行了荧光定量PCR检测和Western Blot分析。

2.1 荧光定量PCR检测我们在293T细胞中转染了HIF1α-shRNA载体和对照载体（不含shRNA序列）后，提取总RNA并进行反转录。

然后，利用荧光定量PCR技术检测HIF1α mRNA表达水平的变化。

结果显示，HIF1α-shRNA载体转染组的HIF1α mRNA表达水平较对照组显著降低，表明HIF1α-shRNA能有效沉默目标基因的表达（图1）。

2.2 Western Blot分析综上所述，我们成功构建了HIF1α-shRNA表达载体，并证实了该载体在细胞水平上能够有效降低H IF1α表达水平。

该表达载体可为研究细胞代谢和生存过程提供重要的工具和支持。

HIV-1 Tat基因重组原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与功能鉴定

（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＩ２１（ＤＥ３）感受态细胞，用异丙基硫代一Ｂ — Ｄ一半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达融合蛋白。表达产物经十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ — ＰＡＧＥ）和蛋白质印迹鉴定后，通过镍亲和层析柱纯化。纯化后蛋白采用虫荧光素酶报告实验进行功能验证。结果：限制性内切酶酶切和基因测序证实，成功构建了含有ｆ基因的重组原核表达质粒。蛋白质印迹结果显示，Ｈｉｓ融合蛋白在大肠埃希菌中得到正确表达，纯化后获得了相对分子质量为１８Ｘ１０的融合蛋
Ｊｕ１．２０１３
ＨＩＶ一１Ｔａｔ基因重组原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与功能鉴定
邱会平，程晓东，卢春
（南京医科大学１．基础医学实验教学中心，２．微生物学与免疫学系，江苏南京２１００２９）
ｒｉｆｙｔｈｅｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｉｎＥ．ｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｔｈｅＴａｔｇｅｎｅｆｒｏｍｐｃＤＮＡ３．１（＋）／Ｔａｔｌｏ１
生物学功能。
［关键词］Ｔａｔ基因；原核表达；融合蛋白；人免疫缺陷病毒；卡波氏肉瘤病毒［中图分类号］Ｒ３４；Ｑ７８［文献标志码］Ａ［文章编号］１６７１ — ７７８３（２０１３）０４— ０３０８— ０５

重组人HIF-1α真核表达载体质粒的构建与鉴定

Ａ（ｎｉ — ９）ｆｇｔｔｆｍｎｉ７６８６ｗｒｃｎｒｃｄｉｅｅｔｔｈｔｅｖｃｒ．ｒｓｒａｏＥｃｌＪ０ａ￣ｏａｄ１３０ａｌ／ｍａｉａ凼８ — ２）ｅｓｕｔａｓｒｉｏｈｓｕｔｅｔＴａｆｍｔｎｏ．ｉＭ１ｃｓ￣＇￣ＢａｏｃｅｏｔｅｎｎｔｎｅｄｄｌｏＴｎｏｉｆｏ９
人ＨＦ１所选用的ｐＤＡ／ｉａ高表达目的基因，Ｉ．ｔｅｅＮ４Ｈｓｘ可Ｍ为利用其进行人ＨＦ１ｔ因的克隆与表达及其抗体的制备研究奠定了基Ｉ．ｅ基
础
【关键词】缺氧诱导因子；载体；质粒【中图分类号】Ｑ７５【文献标识码】Ａ【文章编号】０５－０（０７０－８－２３３４２０）６０７０４７３
肠杆茵Ｊ０，Ｂ平板培养基筛选茵落，Ｍ１９Ｌ提取质粒。测序正确后双酶切先后克隆进入ｐＤＡ／ｉｘｃＮ４ＨｓＡ载体。Ｍａ结果
ＨＦ１ｔＩ．真核表达栽体质粒，ＰＲ扩增获得的目的基因分子量与预计的相同，ｅ经Ｃ插入ｐＤＡ／ｓｘ栽体部位正确。ｃＮ４ＨｉＡＭａ结论
【ｂｔｃＯｊｔｅｏｏｓｕｔｋｓｉｅｒｓｎｌｍｄＤＡ－ＨＦｌｃｂａｍｎｙｏａｎｕｉｅａｏ１．ＡｓａｔｂｃｖＴｎｒｔｈｅａｏｅｘｅｉａｉＰＮ４ｈ／・ｔｆｏｉｎｈａｈ￣－ｄｃｆｔ－ｒ】ｅｉｃｔｃｅｕ￣ｔｐｓｏｐｓＯｒｅｏｒｍｎｔｕｐｉｂｃｒａｅｌ

hif1α-shrna表达载体的构建与鉴定

S c ie nc e &T e c hno lo g y V is io n 缺氧诱导因子-1（hypoxia -inducible factor -1,HIF -1）最初是从缺氧诱导的肝癌细胞Hep3B 的细胞核中发现的一个转录因子，由氧敏感的α亚基（HIF -1α）和持续稳定表达的β亚基（HIF -1β）以异源二聚体的形式组成，HIF -1α是调节亚单位，决定HIF -1的活性，HIF -1β则与稳定HIF -1及其二聚化有关[1]。

已经证实，HIF -1可介导肿瘤细胞产生一系列的缺氧适应反应，与肿瘤细胞的糖酵解途径密切相关，使肿瘤细胞在相对缺氧的状态下获得更多的能量供应，以维持存活、生长和分裂[2]。

本研究将构建HIF1α-shRNA 表达载体，为进一步研究其在肿瘤发生发展中的作用提供生物学基础。

1材料和方法1.1材料表达载体pG1.1（武汉巴菲尔），限制性内切酶BsaI 、SacI （美国NEB ），T4DNA 连接酶、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、质粒提取试剂盒、感受态细胞DH5α（北京天根），DNA 寡核苷酸由上海生工合成。

1.2方法1.2.1序列设计合成已验证有效干扰HIF1α表达的siRNA 正义链序列为5'-GCCTCTTTGACAA ACTTAA -3'，依据pG1.1载体的插入位点和接头结构，设计合成两条互补的摘要目的：构建HIF1α-shRNA 表达载体并鉴定，为进一步研究其在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。

方法：设计合成两条互补的编码HIF1α-shRNA 的DNA 寡核苷酸单链，退火形成互补双链，后将退火产物与酶切线性化的表达载体pG1.1连接后，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒并酶切鉴定，挑取克隆正确的重组质粒去测序鉴定插入序列。

结果：重组质粒酶切结果显示退火片段连接到pG1.1载体里，经测序分析重组质粒插入序列与合成的寡核苷酸序列一致。

建立重组缺氧诱导因子-1α真核表达载体质粒

建立重组缺氧诱导因子－1α真核表达载体质粒目的：建立重组人HIF－1α真核表达载体质粒pcDNA3－rhHIF－1α，为进行人HIF－1α基因的克隆与表达及其抗体的制备研究做准备。

方法：从人血细胞中提取总RNA，RT-PCR法反转录合成eDNA。

酶切插入pcDNA3载体。

结果：获得重组的人HIF－1α真核表达载体质粒pcDNA3－rhHIF－1α，经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计的相同，测序插入pcDNA3载体部位正确。

结论：重组的人HIF－1α，所选用的pcDNA3可高表达目的基因，为利用其进行人HIF －1α基因的克隆与表达及其抗体的制备研究奠定了基础。

标签：缺氧诱导因子；载体；质粒缺氧诱导因子(HIF)是1992年由Semenza等发现的一种氧依赖转录激活因子，通过与低氧反应元件(HRE)结合，引发下游基因的转录。

HIF－1是由α亚基和β亚基组成的异二聚体。

HIF－1β为其组成性表达，HIF－1α为其功能性亚基，HIF－1α极不稳定，在常氧条件下，半衰期不到10min，与其降解有关的结构域称为氧依赖的降解结构域(oxygen-dependent degrada-tion domain，ODD)(氨基酸401～603)。

本实验的目的是通过分子克隆的方法在体外重组HIF－1α，将ODD 结构域删除，使重组的人HIF－1α在正常血氧分压状态下能够在酵母细胞内进行表达，将表达产物免疫小鼠或兔子，提取抗体。

检测抗体的中和活性，观察抗体能否减轻模型动物的炎症反应。

1 材料与方法1．1材料pcDNA3，pMDl8－T Simple vector(简称T载体)、大肠杆菌JM109、质粒纯化试剂盒、cDNA RT－PCR试剂盒、RNA LAPCR试剂盒、LA Taq PCR试剂盒、Ligation试剂盒、凝胶回收试剂盒、PCR Fragment Recovery试剂盒、BKL试剂盒、工具酶KpnI、XbaI和EcoR V及碱性磷酸酶，DNA marker购自Takara。

HIF1α-shRNA表达载体的构建与鉴定

HIF1α-shRNA表达载体的构建与鉴定概述HIF1α（hypoxia-inducible factor 1α）是哺乳动物生物体中重要的一种转录因子，它在缺氧的条件下被激活，可以调控多种与氧代谢相关的基因的表达，如糖酵解酶、血管生长因子等。

因此，HIF1α在肿瘤等重要疾病的发生和发展中起着重要作用。

目前，HIF1α-shRNA技术已经成为研究HIF1α生物活性以及干预疾病发展的重要手段之一。

本文主要介绍了HIF1α-shRNA表达载体的构建与鉴定方法。

材料与方法（1）设计合成shRNA（2）合成DNA片段并克隆到质粒中（1）PCR检测（2）酶切鉴定（3）测序鉴定结果与讨论HIF1α-shRNA表达载体的构建，主要涉及到两个方面：shRNA的设计与合成，DNA片段的克隆。

在shRNA的设计与合成中，我们首先需要根据目标序列（目标为HIF1α）的特点及shRNA的结构，设计合成适合的shRNA。

其中，我们需要考虑到shRNA的长度、启动子的选择、短发夹RNA和长发夹RNA 的选择等因素。

在本实验中，我们采用了U6启动子，以及预测得到的两个长度分别为21 bp的短发夹RNA和51 bp的长发夹RNA。

接下来，我们利用化学法合成了该shRNA，并将其克隆到带有CMV启动子的质粒中，构建了HIF1α-shRNA表达载体。

HIF1α-shRNA表达载体的鉴定可以从多个方面进行，如PCR检测、酶切鉴定、测序鉴定等。

在本实验中，我们使用了PCR、酶切和测序三种方法对所构建的HIF1α-shRNA表达载体进行了鉴定。

首先，我们使用包含U6启动子和shRNA序列的通用引物，进行PCR扩增。

结果显示，我们成功扩增出了预期长度的DNA片段。

为了进一步确认所扩增的DNA片段是否为HIF1α-shRNA表达载体，我们进行了酶切鉴定。

结果显示，我们得到的DNA片段与已有文献报道的HIF1α-shRNA表达载体的预期DNA片段大小一致。

HIF1α-shRNA表达载体的构建与鉴定

HIF1α-shRNA表达载体的构建与鉴定HIF-1α是一种重要的转录因子，它参与调控细胞内氧气浓度和能量代谢等重要生理过程。

在肿瘤发生发展过程中，HIF-1α起着非常重要的作用，可以促进肿瘤细胞的生长、增殖及血管新生，同时也可以抑制肿瘤细胞的凋亡和坏死。

针对HIF-1α的基因靶向调控研究成为了当前肿瘤治疗和生物医学研究领域的热点之一。

基因沉默（gene silencing）是一种有效的方法，可以选择性地抑制目标基因的表达，从而研究目标基因在生物体内的功能和作用。

RNAi技术（RNA interference）是一种常用的基因沉默技术，通过引入特异性的小分子RNA（siRNA或shRNA）来靶向干扰目标基因的mRNA，从而实现目标基因的沉默和功能研究。

在本研究中，我们将构建一种HIF-1α-shRNA表达载体，并进行其在细胞中的表达及功能鉴定，以期能够为HIF-1α相关的肿瘤治疗和生物医学研究提供新的思路和方法。

我们需要设计用于靶向HIF-1α mRNA的shRNA序列。

通过使用专门的shRNA设计软件和数据库，我们可以得到针对HIF-1α的多个候选shRNA序列。

然后，我们需要对这些序列进行筛选和验证，选取出具有良好沉默效果的shRNA序列作为继续实验的研究对象。

接下来，我们将选取适合的表达载体，将筛选得到的HIF-1α-shRNA序列插入构建HIF-1α-shRNA表达载体。

我们还需要设计和构建带有荧光标记的对照shRNA表达载体，用于实验对照和验证。

构建完成HIF-1α-shRNA表达载体后，我们需要进行其在细胞中的表达及沉默效果鉴定。

我们将通过转染或转染等方法将HIF-1α-shRNA表达载体导入靶细胞中，观察并验证其在细胞中的表达情况。

我们还需要利用实时荧光定量PCR、Western blot等技术手段，检测并分析HIF-1α mRNA和蛋白的表达水平，以确定HIF-1α-shRNA的沉默效果和靶向性。

HIF1α-shRNA表达载体的构建与鉴定

HIF1α-shRNA表达载体的构建与鉴定摘要：HIF1α是一种重要的转录因子，其过度表达与多种肿瘤的发生和发展有关。

采用shRNA技术靶向下调HIF1α表达已成为肿瘤治疗的重要策略之一。

本研究利用分子生物学技术构建了HIF1α-shRNA表达载体，并通过鉴定验证其在细胞中的功能及效果，为进一步研究HIF1α在肿瘤治疗中的应用提供了理论和实验基础。

一、引言缺氧诱导因子1α（HIF1α）是一种重要的转录因子，主要参与细胞对于缺氧环境的应答调节。

在正常组织中，HIF1α表达水平较低，但在肿瘤组织中常常出现过度表达，与肿瘤的持续生长、侵袭和转移密切相关。

通过抑制HIF1α的表达和功能，已成为治疗肿瘤的重要策略之一。

二、材料与方法1. HIF1α-shRNA序列设计根据HIF1α基因序列，设计并合成能够特异性靶向HIF1α的shRNA序列。

经过序列比对和评价，筛选出具有较高靶向效果和较低副作用的shRNA序列。

将筛选出的shRNA序列插入到适当的载体中，如pLKO.1-puro载体，利用限制酶切和连接技术构建HIF1α-shRNA表达载体。

然后，转化大肠杆菌，并进行测序鉴定。

3. 肿瘤细胞的培养和转染选择适当的肿瘤细胞株，如HeLa或A549细胞，进行培养和扩增。

然后利用转染试剂将构建好的HIF1α-shRNA表达载体转染到细胞中，同时设立空白对照组和阴性对照组。

4. shRNA的表达检测利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）或Western blot等技术，检测转染后细胞内shRNA 的表达水平，验证HIF1α的下调效果。

5. 细胞增殖和转移能力的检测通过CCK-8法或MTT法检测细胞的增殖能力，通过Transwell小室实验检测细胞的转移能力，评估HIF1α-shRNA对肿瘤细胞生物学行为的影响。

三、结果成功构建了含有HIF1α-shRNA序列的pLKO.1-puro载体，并经过测序验证了其准确性和完整性。

HIF-1α和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

HIF-1α和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定李永明;吕刚;范仲凯;曹阳;王岩松;庄培袁;张王强;李刚【期刊名称】《解放军医学院学报》【年(卷),期】2014(035)002【摘要】目的构建pAdeno-EGFP-HIF-1α 重组腺病毒载体，探讨其在脊髓损伤中的作用。

方法采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法扩增目的基因HIF-1α 并亚克隆到含有报告基因EGFP 的pShuttle-CMV-EGFP 穿梭载体中，得到pShuttle-EGFP-HIF-1α 重组穿梭质粒。

将已构建的重组穿梭质粒转移至pAdeno 骨架载体上，获得pAdeno-EGFP-HIF-1α 重组腺病毒质粒，继而在H293 细胞中扩增，纯化后进行PCR 鉴定并测定病毒滴度。

结果pShuttle-EGFPHIF-1 α 经KpnI/BamHI 双酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组在2.5 kb 和5.1 kb 处出现两条带，而阴性克隆组只有5.1 kb 处一条带，证明pShuttle-EGFP-HIF-1α 重组穿梭质粒构建成功；pShuttle-EGFP-HIF-1α 重组穿梭质粒与pAdeno 载体重组后，经XhoI 单酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组出现14.5 kb，11.7 kb，2.66 kb，2.6 kb，2.48 kb，2.47 kb，1.45 kb，0.6 kb 八条带，而阴性克隆的腺病毒空载组有14 kb，11.8 kb，4.0 kb，2.47 kb，1.45 kb，0.6 kb 六条带，证明重组pAdeno-EGFP-HIF1α 腺病毒质粒构建成功；pAdeno-EGFP-HIF-1α 重组腺病毒成功包装纯化后经PCR 鉴定，实验组和阳性对照组中均扩增到2.5 kb 片段，证明目的病毒中成功整合了HIF-1α 基因；TCID50 法测定纯化后的病毒滴度为2×10 10 PUF/ml 。

HIF-1α基因慢病毒载体的构建和鉴定

HIF-1α基因慢病毒载体的构建和鉴定王标;余勤;周丽萍;付珊;朱振洪;单威;刘伟;胡韶君【摘要】[Objective] To construct lentiviral vector which encodes full length rat HIF-lα gene and package the virus particles. [Methods] The HIF-lα genc was amplified from pEGFP-Nl- HIF-lα vector and cloned into a pLenti6.3-MCS-RES2- EGFP lentiviral vector to obtain the lentiviral expressing vectoi pLenti6.3-HIF-lα- IRES2-EGFP. 293T cells were used as packaging cells. The target plasmid pLenti6.3- HIF-lα-IRES2-EGFP, together with packaging plasmids were co-transfected into 293T cells using calcium phosphate transfection method. After 48 h, cell culture supernatant was collected and nitrated Then 293T cells were exposed to lentivirus with different multiplicity of infection. Transfection efficiency was estimated by evaluation of the green fluorescent protein expression via fluorescence microscopy. [Results] The recombinant lentiviral vector pLenti6.3-HIF-lα-IRES2-EGFP which co-expressed tht HIF-lα and EGFP gene was constructed and verified by PCR and sequencing. The titer of the packaged lentiviral virus was 4×106TU/ml. [Conclusion] Thi recombinant lentiviral vector pLenti6.3 HIF-la-IRES2-EGFP was constructed successfully and could be effectively used to package the lentiviral.%[目的]构建带有大鼠HIF-1α基因的慢病毒表达载体,并进行病毒颗粒的包装与对293T的转染.[方法]从pEGFP-N1-HIF-1α载体中扩增出HIF-1α基因片段,将目的基因与pLenti6.3-MCS-RES2-EGFP载体连接,获得慢病毒表达载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP,并用磷酸钙转染法将其与慢病毒包装系统共同转染到293T细胞内进行病毒包装,48h后收集上清液并过滤,按不同感染复数感染293T细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达来测定病毒滴度和感染效率.[结果]构建了共表达HIF-1α基因和EGFP基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP,经PCR及测序结果证实,并对其成功包装出慢病毒,病毒滴度为4×106TU/ml.[结论]成功构建出HIF-1α基因重组慢病毒载体pLenti6.3-HIF-1 α-IRES2-EGFP并能有效的包装出慢病毒.【期刊名称】《浙江中医药大学学报》【年(卷),期】2012(036)011【总页数】4页(P1221-1224)【关键词】HIF-1α;慢病毒载体;293T细胞【作者】王标;余勤;周丽萍;付珊;朱振洪;单威;刘伟;胡韶君【作者单位】浙江中医药大学生物工程学院杭州 310053;浙江中医药大学生物工程学院杭州 310053;浙江中医药大学生物工程学院杭州 310053;浙江大学医学院附属第一医院;浙江中医药大学生物工程学院杭州 310053;浙江中医药大学生物工程学院杭州 310053;浙江中医药大学生物工程学院杭州 310053;浙江中医药大学生物工程学院杭州 310053【正文语种】中文【中图分类】R331缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是近年来所发现的正常细胞以及肿瘤细胞适应缺氧的最关键的核转录因子[1]。

重组人HIF-1α真核表达载体质粒的构建与鉴定

重组人HIF-1α真核表达载体质粒的构建与鉴定黄大林;陈森洲;袁桂峰;徐亚娟;刘菁【期刊名称】《广西医学》【年(卷),期】2007(29)6【摘要】目的构建重组人HIF-lα真核表达载体质粒,为进行人HIF-1α基因的克隆与表达及其抗体的制备研究做准备.方法从血细胞中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成cDNA.设计两对引物分别调取目的基因片段A和B,与T载体连接后转化大肠杆菌JM109,LB平板培养基筛选菌落,提取质粒.测序正确后双酶切先后克隆进入pcDNA4/HisMaxA载体.结果获得重组的人HIF-1α真核表达载体质粒,经PCR 扩增获得的目的基因分子量与预计的相同,插入pcDNA4/HisMaxA载体部位正确.结论重组人HIF-lα所选用的pcDNA4/HisMax可高表达目的基因,为利用其进行人HIF-1α基因的克隆与表达及其抗体的制备研究奠定了基础.【总页数】4页(P787-789,封3)【作者】黄大林;陈森洲;袁桂峰;徐亚娟;刘菁【作者单位】桂林医学院微生物免疫教研室,桂林市,541004;桂林医学院微生物免疫教研室,桂林市,541004;桂林医学院微生物免疫教研室,桂林市,541004;桂林医学院微生物免疫教研室,桂林市,541004;桂林医学院微生物免疫教研室,桂林市,541004【正文语种】中文【中图分类】Q75【相关文献】1.重组人HIF-1α真核表达质粒的构建和鉴定 [J], 陆蕴松;高忠礼;刘光耀2.人HIF-1α真核表达载体质粒的建立和鉴定 [J], 陈森洲;廖振林;黄大林;王险峰;袁桂峰;裴蕾3.重组人HIF-1α真核表达载体质粒的构建和鉴定 [J], 邱龄;肖传实;曾秋棠;李茂莲;王改玲;赵文燕4.人转化生长因子β1质粒真核表达载体的构建与鉴定 [J], 储庆;吴织芬;孙强;何海丽;刘玲侠5.人细胞色素P4502C9cDNA的克隆,鉴定及真核细胞表达重组质粒的构建 [J], 汪爱今;钱瑛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

重组人HIF-1α真核表达质粒的构建和鉴定

重组人HIF-1α真核表达质粒的构建和鉴定陆蕴松;高忠礼;刘光耀【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2009(35)2【摘要】目的:构建重组人HIF-Ia真核表达质粒,为进行人HIF-1α基因的克隆与表达做准备.方法:从人外周血细胞中提取总RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法反转录合成cDNA.分别以含有绿色荧光蛋白(EGFP)片段的质粒PIREGFP质粒和反转录合成的cDNA为模板,加入所设计的3对引物[EGFP-linker、HIF-1α)上游(up)和下游(down)引物]所扩增目的基因片段分别与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,LB/Amp平板培养基筛选菌落,提取质粒.测序正确后经酶切先后克隆进入pVAXl载体.结果:通过聚合酶链反应(PCR)分别获得约870、1 199和672 bp的特异性DNA片段,分别与T载体连接后测序,测序结果与GenBank所提供的基因序列相同.将以上3个片段依次连入pVAXl载体后,所得质粒经酶切鉴定后获得约1 800 bp片段,与预想结果一致.结论:成功构建了重组人HIF-1α真核表达质粒pVAxl-EGFP-linker-HIF-1α.【总页数】4页(P318-321)【作者】陆蕴松;高忠礼;刘光耀【作者单位】吉林大学中日联谊医院骨科,吉林,长春,130033;吉林大学中日联谊医院骨科,吉林,长春,130033;吉林大学中日联谊医院骨科,吉林,长春,130033【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.人HIF-1α基因RNAi重组腺病毒的构建及对人肺腺癌SPCA-1细胞HIF-1α表达的影响 [J], 宋现让;魏玲;王兴武;宋宝;郑燕2.重组人HIF-1α真核表达载体质粒的构建和鉴定 [J], 邱龄;肖传实;曾秋棠;李茂莲;王改玲;赵文燕3.重组人HIF-1α真核表达载体质粒的构建与鉴定 [J], 黄大林;陈森洲;袁桂峰;徐亚娟;刘菁4.p VT102U/α-bgln重组真核表达质粒的构建和鉴定 [J], 林志楷;叶冰莹;潘海芳;陈由强;陈如凯5.人HIF-1α基因重组腺病毒的构建与鉴定 [J], 蒋春华;高钰琪;黄庆愿;黄缄;贺伟峰;段小军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人HIF-1α的腺病毒表达载体的构建与分析

人HIF-1α的腺病毒表达载体的构建与分析于如同;朱玉福;唐宏【期刊名称】《生物工程学报》【年(卷),期】2003(019)001【摘要】低氧诱导因子1 (hypoxia inducible factor 1, HIF-1)是由HIF-1α和HIF-1β组成的异源二聚体转录因子,在细胞的氧平衡过程中起重要作用.在应答低氧信号时,HIF-1α亚基表达水平上调,并通过激活参与细胞能量代谢、红血细胞生成以及血管生成的靶基因表达,达到保护局部缺/贫血细胞免于凋亡或死亡,而后者则是临床上影响大脑和脊椎神经损伤恢复的主要原因.为了达到基因治疗急性神经损伤的目的,我们构建了表达HIF-1α的重组腺病毒载体.实验表明,重组腺病毒可以在大肠杆菌中组装,并在HEK293T细胞中包装.包装后的HIF-1α重组腺病毒载体的病毒感染效率为2×1013CFU,外源基因HIF-1α在He1a细胞中的表达6 h后达到峰值.目前正在开展建立在此基础上的急性神经损伤动物模型试验.%Hypoxia inducible factor 1 (HIF-1) is a heterodimeric transcription factor that plays an important role in oxygen homeostasis.In response to low level of oxygen, subunit HIF-1α expression is upregulated a nd transactivates its target genes essential for energy metabolism, erythropoiesis and vascular development.HIF-1α is thought to be able to protect hypoxic cells from apoptosis or necrosis under ischemic and anoxic conditions, the major trauma factors that affect the recovery of brain and spinal cord injury.Here we report the construction of recombinant adenovirus vector overexpressing HIF-1α intended for gene therapy against desired neuronalinjuries.The recombinant vector could be packaged and yieldedsig nificantly high viral titers at 2×1013 CFU in HEK293T cells and good expression levels of HIF-1α when superinfected in Hela cells.【总页数】5页(P107-111)【作者】于如同;朱玉福;唐宏【作者单位】徐州医学院附属医院神经外科,徐州,221002;徐州医学院附属医院神经外科,徐州,221002;中国科学院微生物研究所分子微生物中心,北京,100080【正文语种】中文【中图分类】Q782【相关文献】1.人HIF-1α基因RNAi重组腺病毒的构建及对人肺腺癌SPCA-1细胞HIF-1α表达的影响 [J], 宋现让;魏玲;王兴武;宋宝;郑燕2.人3突变型低氧诱导因子1 α真核表达载体和腺病毒表达载体的构建及鉴定 [J], 赖艳娴;刘城;王月刚;谢宜军;童锴;胡英芳;韦莉莉;吴平生3.重组人HIF-1α真核表达载体质粒的构建与鉴定 [J], 黄大林;陈森洲;袁桂峰;徐亚娟;刘菁4.人碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体的构建及其在人脐静脉内皮细胞中的表达 [J], 郭伶俐;邢新;刘刊;韩妲丽5.人HIF-1α基因重组腺病毒的构建与鉴定 [J], 蒋春华;高钰琪;黄庆愿;黄缄;贺伟峰;段小军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

HIF-1α特异性RNA干扰表达载体的构建及体外效应研究

HIF-1α特异性RNA干扰表达载体的构建及体外效应研究何柳芳;陈克正【期刊名称】《中国当代儿科杂志》【年(卷),期】2008(10)1【摘要】目的己知缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在缺氧状态下可通过调节内皮素-1(ET-1)的升高而参与肺血管内皮细胞损伤及肺动脉高压,最终导致肺出血。

RNA 干扰(RNAi)是双链RNA介导的序列特异性转录后同源靶基因沉默效应,目前RNAi 技术已成为一种研究基因功能的有力工具,故拟通过构建人HIF-1α基因的特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,观测该载体在缺氧状态下对HIF-1α基因的干扰作用及对ET-1的抑制作用。

方法选择6个(a^f)可能的人HIF-1α siRNA干扰位点,设计合成相应的特异性互补寡聚核苷酸链(A^F),采用基因克隆技术,将合成的(A^F)链序列定向插入真核表达载体中,构建成重组质粒HIF-1αsiRNA真核表达载体(A′~F′),通过脂质体法转染至体外人脐静脉内皮细胞(HUVECs)48h,再以CoCl2(100μM)模拟缺氧刺激3h后,观测siRNA对HIF-1αmRNA和HIF-1α蛋白表达的抑制效应及ET-1水平。

结果①成功构建了分别针对6个HIF-1αsiRNA干扰位点(a^f)的重组质粒HIF-1αsiRNA真核表达载体(A′~F′);②该6组真核表达载体转染HUVECs并经CoCl2模拟缺氧刺激后,与未转染组比较,结果显示B′及D′组明显抑制HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白的表达,并部分抑制ET-1表达,而其余4组与未转染组比较并无差异。

结论针对b及d干扰位点的B′及D′特异性siRNA 真核表达载体,能明显干扰HIF-1α基因的表达,进而抑制ET-1的释放。

该实验为下一步用B′、D′特异性siRNA真核表达载体在动物体内研究HIF-1α与新生儿缺氧性肺出血关系奠定基础。

【总页数】5页(P60-64)【关键词】RNA干扰;小干扰RNA;表达载体;缺氧诱导因子-1;内皮素-1【作者】何柳芳;陈克正【作者单位】广州市儿童医院新生儿监护中心【正文语种】中文【中图分类】R-33【相关文献】1.小鼠4-1BB特异性RNA干扰表达载体的构建及体外瞬时干扰效应的研究 [J], 傅晓岚;杨曌;王莉;牛微;赵建平;吴玉章2.HPV16 E6基因特异性RNA干扰表达载体的构建及对HPV16 E6基因抑制作用的研究 [J], 李大可;彭芝兰;尤志学3.短发卡状PTI-1(PC-3)基因特异性RNA干扰表达载体对PC-3细胞的体外效应[J], 宋斌;王禾;赵晶;秦卫军;杨安钢4.葡萄糖糖基神经酰胺合成酶特异性小干扰RNA表达载体的构建及其逆转乳腺癌细胞耐药的研究 [J], 孙妍琳;周庚寅;李锴男;李文通;宋现让;高鹏5.发卡样NF-κB特异性RNA干扰表达载体的构建及体外效应研究 [J], 王明海;王锋超;陆建华;麦跃;刘晓宏;程天民;粟永萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

HIF-1α过表达慢病毒载体的构建及对心肌细胞Notch配体Jagged1表达的影响

HIF-1α过表达慢病毒载体的构建及对心肌细胞Notch配体Jagged1表达的影响王振良;丁然然;哈艳平;雷洪;王可可;申志华;姜汉国;揭伟【摘要】目的构建低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)过表达重组慢病毒质粒并包装病毒,将病毒感染乳鼠心肌细胞,分析其对Notch配体Jagged1表达的影响.方法从cDNA文库中PCR扩增人HIF-1α编码序列并克隆入酶切线性化慢病毒载体GV218,转化感受态大肠杆菌细胞筛选出阳性克隆并测序鉴定.将HIF-1α过表达慢病毒质粒与病毒包装辅助质粒共转染工具细胞HEK293T,包装出慢病毒颗粒.原代分离SD乳大鼠心肌细胞,将HIF-1α过表达慢病毒感染心肌细胞,定量PCR分析Jagged1 mRNA水平的变化.结果成功扩增HIF-1α编码序列并正确连接入线性化载体GV218,获得阳性转化子并测序无误.将转化子质粒与病毒包装辅助质粒共转染HEK293T后,获得滴度为1×108 TU/ml的慢病毒颗粒,Westernblot法检测到HIF-1 α-GFP融合蛋白.重组慢病毒感染乳鼠心肌细胞后,胞核中见GFP信号.与对照组相比,HIF-1 α过表达5天后显著上调Jagged1 mRNA的水平.结论心肌细胞中HIF-1α可诱导Jagged1的表达.HIF-1 α过表达重组慢病毒载体的成功构建,为研究缺血缺氧性心肌损伤反应的分子机制奠定了基础.【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2016(032)004【总页数】5页(P416-420)【关键词】质粒构建;慢病毒包装;心肌细胞;Notch信号;低氧诱导因子1α【作者】王振良;丁然然;哈艳平;雷洪;王可可;申志华;姜汉国;揭伟【作者单位】广东医科大学病理学系,湛江 524023;广东医科大学病理学系,湛江524023;广东医科大学病理学系,湛江 524023;广东医科大学病理学系,湛江524023;广东医科大学病理学系,湛江 524023;广东医科大学基础医学院病理生理学教研室,湛江 524023;广东医科大学病理学系,湛江 524023;广东医科大学病理学系,湛江 524023【正文语种】中文【中图分类】R363缺血性心脏病是当前临床上常见的疾病之一，心肌梗死是其主要类型[1]。