三大类病毒表达载体

慢病毒
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慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基
础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能 力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将 外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能 力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮 细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在 美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景
随后Gossen等对tTA的氨基酸序列进行了改造，构建了 受四环素正调节的Tet-on基因表达系统，该系统在没有 四环素的情况下启动子不被激活，而 在加入四环素或强 力毒素后目的基因高效表达。
四环素诱导的基因表达系统是目前应用最广泛的哺乳动 物细胞诱导表达系统，该系统具有严密、高效可控制性 强的优 点。
siRNA载体 的所有特色； 1.诱导性启动子 2.与stratagene的 adEasy 腺病毒载体
系列的兼容 4。保留少量的MCS 3.cGFP的筛选标记
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慢病毒载体系统
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逆转录病毒siRNA 载体
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siRNA的CK 载体序列
一，萤火虫荧光素酶的siRNA的阳性对照载体 二，海肾荧光素酶的siRNA的阳性对照载体 三：CGFP siRNA的阳性对照载体 四；阴性对照siRNA的载体系统
质粒siRNA 表达载体
去除CMV启 动子
和EGFP荧 光蛋白， 质粒较小，
最好 使用 的 RNAi质粒之一
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质粒siRNA 表达载体
CMV启 动子
和EGFP荧 光蛋白
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诱导性的siRNA 表达启动子
四环素
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强力霉素
Tet-on基因表达系统的小常识
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Gossen等构建了受四环素负调节的Tet-on基因表达系 统。
常用的病毒载体的特点：
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病毒载体
反转录病毒载体 单链 RNA 病毒 8~10kb
腺病毒载体 双链 DNA 病毒 36kb
A AV 病 毒 载 体 单链 DNA 病毒 ~5kb
HSV 病 毒 载 体 双链 DNA 病毒 152kb
生物学特性
适用范围
可感染分裂细胞； 整合到染色体中； 表达时间较长； 有致癌的危险； 可感染分裂和非分裂细胞； 不整合到染色体中； 外源基因表达水平高； 表达时间较短； 免疫原性强； 可感染分裂和非分裂细胞； 整合到染色体中； 无致病性；免疫原性弱； 可长期表达外源基因； 在骨骼肌、心肌、肝脏、视 网膜等组织中表达较高；
E x vivo 基 因 治 疗 ； 肿瘤基因治疗。
In vivo 基 因 治 疗 ； 肿瘤基因治疗； 疫苗。
In vivo 基 因 治 疗； E x vivo 基 因 治 疗 ； 遗传病基因治疗； 获得性慢性疾病的 基因治疗。
具有嗜神经性；可逆轴突传 递； 可潜伏感染； 容量大； 可感染分裂和非分裂细胞；
病毒表达载体
技术支持：龙桂根
Gene
Gene expression system
Gene vector system Gene delivery system
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哺乳动物表达载体的特点；
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特点：哺乳动物细胞表达载体元件包含（1）原核序列、（2）
启动子、增强子、（3）选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号 等。
诱导性的siRNA 表达启动子
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腺病毒siRNA穿梭载体
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主要分为两大类： 一； 与clontech 的adeno-x expression系统兼容 二； 与stratagene的adEasy 腺病毒载体兼容
与clontech 的adeno-x expression系统兼容 杰特伟
去除CMV启动子 和EGFP荧光蛋白，
逆转录病毒载体系统
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选用的背景：由于重组腺病毒对于一些细胞类型难以转染，比如
各种类型的原代细胞、体内细胞，同时希望基因永久性表达，即将基 因整合入靶细胞的基因组中，此时可以考虑选用逆转录病毒。
逆转录病毒简介： 反转录病毒载体是常用的病毒载体之一，是
由具有感染性的小鼠的白血病病毒改造而来，能将非病毒基因导入细 胞体内或体外进行有丝分裂。这些载体能产生病毒基因组的单一拷贝 并高效准确地整和到宿主染色体 。
选用哺乳动物表达载体的优势：
由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方
更 面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统， 接近于天然蛋白质。
外源基因进入哺乳动物细胞的方法
将外源基因导入哺乳动物细胞主要通过类方法 ：
一是感染性病毒颗粒感染宿主细胞，
二是通过脂质体法、显微注射法 、磷酸钙共沉淀法及DEAE一葡聚糖法 等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中。外源基因的体外表达一般采 用质粒表达载体，如将重组质粒导入CHO细胞可建 立高效稳定的表达系 统，而利用COS细胞可建立瞬时表达系统。
目前，病毒载体已成为动物体内表达外源基因的有力工具，在临床基因 治疗的探索中也发挥了重要 作用。
痘苗病毒由于其基因的分子量相当大(约187kb)，利用它作为载体可同时 插入几种外源基因，从 而构 建多价疫苗。另外，逆转录病毒感染效率 高，某些难转染的细胞系也可通过其导入外源基因，但要注意的是逆转 录病毒可整合入宿主细胞染色体，具有潜在的危险 性。
质粒较小， 最好使用的RNAi 质粒之一。避免了E
GFP荧光蛋白 对RNAi实验检 测可能造成的冲突。
与clontech 的adeno-x expression系统兼容 杰特伟
与stratagene的adEasy 腺病毒载体兼容 杰特伟
与stratagene的adEasy 腺病毒载体兼容
注意到，此载体 集金思特
三大类病毒表达载体
一；腺病毒（adenoviral)表达载体 二；逆转录病毒(retroviral)表达载体 三；慢病毒表达(lentiviral)载体 四；三大类病毒表达载体的差异与联系 五；其它病毒表达系统
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腺病毒表达载体
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产生的背景；人们希望基因能在哺乳动物细胞 中表达目的
基因，而传统的办法做不到。
腺病毒是一种线状DNA肿瘤病毒，基因组内有14个基因。目前
对该病毒的分子生物研究已经很深入，而且对该病毒转染后的免 疫应答也了解佷清楚，目前应用范围最广的病毒，其转染效率也 很高，不管是分裂细胞，还是静止细胞，都是如此。
缺陷：不能整合至靶细胞的基因组，只能瞬时表达，更为致命
是腺病毒的某些抗原表达，也很容易引起人体的免疫反应。
CGFP siRNA的阳性对照载体
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神经系统疾病的基 因治疗； 肿瘤的基因治疗。
基因载体系统
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DNA/RNA DNADNADNA-
DNA
病毒载体系统
非病毒载体系统
反
腺
腺
单
慢
转
病
伴
纯
病
录
毒
随
疱
毒
病 毒 载
载 体
病 毒 载
疹 病 毒
载 体
体
体
载
体
裸
阳
蛋
阳
离
白
子
质
脂
复
质
合
离 子 多 聚
嵌 合 物
复
物
物
合
物
细胞内包装
细胞外包装
公司相应的病毒表达载体