三大类病毒表达载体
载体的名词解释生物学
载体的名词解释生物学生物学中，载体（Vector）是指用来传递、繁殖和表达外源DNA（或RNA）分子的工具。
在分子生物学和基因工程领域，载体扮演着至关重要的角色。
本文将探讨载体在生物学中的定义、种类、应用以及相关的研究进展。
一、载体的定义载体是指一种生物分子，能够携带外源DNA或RNA分子。
它为这些分子提供一个合适数量及合适的环境，使其稳定存在，并能进行复制、传递和表达。
载体可以是DNA、RNA或蛋白质，也可以是一个细胞、病毒、质粒等。
二、载体的种类1. DNA载体DNA载体是最常见且最重要的载体类别之一。
其中，质粒是最常用的DNA载体。
质粒是一种环状DNA分子，能够自主复制并存在于细胞质中。
质粒可以在接受外源DNA后进行基因复制，从而将外源DNA稳定的传递给目标细胞。
此外，噬菌体也是常见的DNA载体，它是一种病毒，能够感染细菌，并在细菌内复制自身。
2. RNA载体RNA载体主要指RNA病毒，它是一种只能通过RNA复制和传递基因的病毒。
RNA载体包括正义病毒和反义病毒。
正义病毒将其RNA转录成DNA并插入宿主细胞染色体中，从而实现基因传递。
反义病毒则利用RNA复制酶来生成更多的RNA病毒。
三、载体的应用1. 外源基因表达载体在基因工程中广泛应用于外源基因表达。
研究人员可以将感兴趣的基因插入载体中，然后将其导入目标细胞。
通过选择适当的载体和表达元件，外源基因可以被成功地表达出来。
这对于探究基因功能、生物制剂的生产以及疾病治疗等方面都具有重要意义。
2. 基因治疗载体在基因治疗中扮演着关键的角色。
基因治疗是一种利用外源基因修复或替代患者体内缺乏或异常基因的方法。
通过将修复好的基因插入载体中，并将其导入患者体内，可以实现基因的传递和修复，从而治疗患者的遗传性疾病。
3. 基因传递载体还可以用于基因传递研究。
通过将感兴趣的基因插入载体中，研究人员可以将其引入目标细胞，并观察和研究基因的功能和表达。
这对于揭示基因功能及相关生理机制具有重要意义。
病毒载体概述
病毒载体概述引言基因导入体系（gene delivery system）是基因治疗的焦点技巧,可分为病毒载体系统和非病毒载体系统.本章重要阐述用于人类基因治疗的病毒载体系统.用于基因治疗的病毒载体应具备以下根本前提：1.携带外源基因并能包装成病毒颗粒;2.介导外源基因的转移和表达;3.对机体不致病.然而,大多半野生型病毒对机体都具有致病性.是以须要对其进行改革后才干用于人体.原则上,各类类型的病毒都能被改革成病毒载体.但是因为病毒的多样性及与机体庞杂的依存关系,人们至今对很多病毒的生涯周期.分子生物学.与疾病产生及成长的关系等的熟悉还很不周全,从而限制了很多病毒成长成为具有实用性的载体.近20年来,只有少数几种病毒如反转录病毒（包含HIV病毒）.腺病毒.腺病毒陪同病毒.疱疹病毒（包含单纯疱疹病毒.痘苗病毒及EB病毒）.甲病毒等被成功地改革成为基因转移载体并开展了不合程度的运用.第一节病毒载体产生的道理病毒载体的产生树立在对病毒的生涯周期和分子生物学熟悉的基本之上.研讨病毒载体起首要对病毒的基因组构造和功效有充分的懂得,最好能获得病毒基因组全序列信息.病毒基因组可分为编码区和非编码区.编码区基因产生病毒的构造蛋白和非构造蛋白;根据其对病毒沾染性复制的影响,又可分为必须基因和非必须基因.非编码区中含有病毒进行复制和包装等功效所必须的顺式感化元件.各类野生型病毒颗粒都具有必定的包装容量,即对所包装的病毒基因组的长度有必定的限制.一般来说,病毒包装容量不超出自身基因组大小的105～110％.基因重组技巧的成长使病毒载体的产生成为可能.最简略的做法是,将恰当长度的外源DNA拔出病毒基因组的非必须区,包装成重组病毒颗粒.比方,本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）拔出HSV1病毒的UL44（糖蛋白C）基因的XbaI位点中,病毒基因组的其余部分不转变,构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等,1998）.因为UL44基因产品对于HSV病毒在造就细胞中产毒性沾染长短必须的,是以,该重组病毒可以在细胞中增殖传代.用这种重组病毒沾染细胞,能将lacZ基因带入细胞并高效表达.用同样的办法,将AAV-2病毒的rep和cap基因片断（4.3kb）拔出HSV1病毒的UL2（编码尿嘧啶DNA糖基化酶）或UL44（编码糖蛋白C）基因中,构建成具有供给重组AAV载体复制和包装所需的全体帮助功效的帮助病毒rHSV-rc（伍志坚等,1999）.然而,如许的重组病毒作为基因转移载体有很多缺点.起首,很多野生型病毒经由过程在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解逝世亡;或带有病毒癌基因而使细胞产生转化.是以必须经由改革使其成为复制缺点性病毒并且删除致癌基因后才干用于基因治疗.其次,拔出外源DNA的长度受到很大限制,尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒陪同病毒（AAV,4.7kb）.反转录病毒（8～10kb）.腺病毒（36kb）,假如不去除病毒基因,可供外源DNA拔出的容量就十分小.是以,必须删除更多的病毒基因以腾出地位拔出较大的外源DNA. 为了增长病毒载体拔出外源DNA的容量,除了可以删除病毒的非必须基因外,还可以进一步删去部分或全体必须基因,这些必须基因的功效由帮助病毒或包装细胞系反式供给.病毒载体大体上可分为两种类型：重组型病毒载体：这类载体是以完全的病毒基因组为改革对象.一般的步调是选择性地删除病毒的某些必须基因尤其是立早基因或早期基因,或掌握其表达;缺掉的必须基因的功效由互补细胞反式供给;用外源基因表达单位替代病毒非必须基因区;病毒复制和包装所需的顺式感化元件不变.这类载体一般经由过程同源重组办法将外源基因表达单位拔出病毒基因组中.如在传统的重组腺病毒构建办法中,将外源基因表达盒（exogenous gene expression cassette）拔出穿梭质粒（如pXCX2或pFGdX1）的腺病毒同源序列中,与帮助质粒（含有腺病毒基因组的质粒如JM17或pBHG）共转染293细胞,通细致胞内的同源重组获得含有外源基因的重组腺病毒（Graham FL and Prevec L 1995）.无病毒基因的病毒载体（gutless vectors）：这类载体在不合的病毒载体系统中的称谓不合.对于腺病毒,一般称为mini-Ad;在HSV载体系统,一般称为扩增子（amplicon）载体或质粒型载体.重组AAV载体也属于无病毒基因的病毒载体.这类载体系统往往由载体质粒和帮助体系构成.重组载体质粒重要由外源基因表达盒.病毒复制和包装所必须的顺式感化元件及质粒骨架构成.帮助体系包含病毒复制和包装所必须的所有反式感化元件.在帮助体系的感化下,重组载体质粒（包含或不包含质粒骨架）以特定情势（单链或双链,DNA第二节病毒载体的包装体系将外源基因包装到病毒壳粒中,是病毒载体临盆的焦点技巧.一般地,病毒载体的制备包含以下要素：宿主细胞固然如今已有可能对有些病毒载体（如AAV载体）进行体外（无细胞）包装（Zhou XH et al . 1998; Ding L et al. 1997）,但是这种包装体系仍然须要细胞提取物,并且包装效力相当低,远远达不到可临盆程度.至今为止,病毒载体的包装主如果在对该病毒迟钝的宿主细胞中进行的.宿主细胞不单供给了病毒复制和包装的情形前提,很多细胞成分还直接介入了病毒复制和包装的进程.病毒复制和包装所必须的顺式感化元件和外源基因的表达盒一般地,病毒复制和包装所必须的顺式感化元件和外源基因的表达盒由细菌质粒携带,构成病毒载体质粒,是被包装的对象.因为病毒复制方法的不合,有些病毒载体如单纯疱疹病毒扩增子（HSV amplicon）载体在包装时,全部载体质粒都被包装进入病毒颗粒中;而有些病毒载体如反转录病毒.腺病毒陪同病毒载体的质粒骨架部分其实不被包装到病毒颗粒中,只有病毒复制和包装所必须的顺式感化元件和外源基因表达盒被包装到病毒颗粒中.构建重组型病毒载体时,病毒复制和包装所需的顺式感化元件消失于病毒基因组中（病毒基因组可以由具有沾染性的病毒颗粒供给,也可以质粒情势供给）.先将外源基因表达盒拔出穿梭质粒携带的病毒同源序列中;将重组穿梭质粒转染至细胞中,再用帮助病毒超沾染;或将重组穿梭质粒与病毒基因组质粒共转染细胞;重组质粒与病毒基因组在细胞中进行同源重组而产生表达外源基因的重组病毒. 重组腺病毒（Graham FL and Prevec L 1995）和重组单纯疱疹病毒（Pyles RB et al. 1997;Kramm CM et al. 1997）的传统制备办法都是采取这种方法.为了使病毒载体的临盆更为便利,病毒复制和包装所必须的顺式感化元件和外源基因的表达盒除了可以用质粒携带以外,也可以用另一种病毒（往往是帮助病毒）或临盆细胞来携带.帮助元件包含病毒复制和包装所必须的所有反式感化元件.这些元件一般包含病毒基因转录调控基因.病毒DNA合成和包装所需的各类酶类的基因.病毒的外壳蛋白基因等.帮助元件的表示情势可以多种多样.经常运用的情势有：①帮助质粒（helper plasmid）,如用于产生重组腺病毒的质粒JM17,用于重组AAV包装的帮助质粒pAAV/Ad（Rolling F and Samulski J 1995）等;②帮助病毒（helper virus）,如用于HSV 扩增子载体包装的帮助病毒HSV1 tsK株;③包装细胞系如用于反转录病毒载体包装的PA317细胞.这些表示情势之间可以互相转化或归并.例如,帮助病毒可以转化为帮助质粒：传统的AAV载体临盆体系经常运用腺病毒作为帮助病毒.研讨发明,并不是腺病毒的所有基因对AAV病毒的产生都是必须的,只须要腺病毒E1a,E1b, E2a, E4和VA RNA 5种基因就行了.是以,将这5种基因置于同一个质粒中,构建成的这种新的帮助质粒就完全可以替代本来的帮助病毒（Xiao X et al. 1998; Grimm D et al. 1998 ）,不单进步了包装效力,并且防止了产品中腺病毒污染的问题.上述几种要素的不合组合,便产生了各类各样的病毒载体包装计谋.根据病毒载体临盆体系的构成身分的若干,可将其分成以下几种：单构成身分临盆体系（one-component system）：所有的构成成分都分散在临盆细胞中.经典的反转录病毒临盆体系就是由产病毒细胞（VPC）构成,重组反转录病毒由VPC细胞不竭排泄至造就上清中.这种临盆体系操纵最为简略,但是往往产量不高或不稳固.采取这种计谋,须要将重组病毒产生所须要的所有元件都稳固地置于临盆细胞中.因为很多病毒基因产品本身对细胞有损坏感化或不克不及在细胞中稳固表达,是以这种计谋在很多病毒载体的临盆中难以实行.双构成身分临盆体系（two-component system）这种临盆系同一般由"一株病毒/一株细胞"构成.典范的例子是重组腺病毒临盆体系.先用共转染的办法获得重组腺病毒毒种,再由该毒种和临盆细胞（如293细胞）构成一个双构成身分的临盆体系使病毒大量扩增.多构成身分临盆体系（multi-component system）是由两种以上的构成身分构成的临盆体系.传统的AAV载体临盆体系就是由载体质粒,帮助质粒,帮助病毒和临盆细胞4种身分构成.这种计谋的缺点是影响身分多,操纵庞杂,产量不轻易稳固,晦气于大范围临盆. 以上各类临盆体系也可以互相转化.我们实验室经由过程将上述AAV载体临盆体系的4种身分进行两两归并,即将帮助质粒和帮助病毒归并成一种重组的帮助病毒,将载体质粒和临盆细胞归并成AAV前病毒细胞株,成功地将其转化成一种双构成身分的新型高效临盆体系（伍志坚等,1999）.一般来说,成长新的包装计谋主如果为了以下几种目标：（1）削减临盆体系中的构成身分,简化操纵进程;（2）进步临盆效力,下降临盆成本;（3）防止或下降野生型病毒的产生;（4）防止运用难以与产品病毒分别的帮助病毒.第三节病毒载体的纯化办法重组病毒的纯化与基因工程产品的纯化既有很多共性,又有明显的不合之处.病毒可以看作是一个具有特定构造的生物大分子,一般都由位于中间的核酸和包裹于其外的蛋白外壳构成.有些病毒还具有脂质膜和糖蛋白或糖脂.很多分别纯化蛋白质的办法如离心和梯度离心.盐析.柱层析.超滤.透析等办法都可用于病毒的纯化.然而,因为病毒构造的庞杂性,纯化时不克不及采取蛋白质变性和复性的办法,因为一旦病毒蛋鹤产生变性,或病毒构造产生损坏,在体外就很难再重建成有沾染性的病毒颗粒.是以,在病毒的纯化进程中必须保持病毒的构造不受损坏,并且监测其沾染活性.病毒的纯化一般分为以下几个步调：初始物（start material）的收集或制备根据病毒产生方法的不合而采纳不合的方法.对于不导致细胞病变和逝世亡的病毒如反转录病毒,可不竭收集产毒细胞（VPC细胞）的造就上清作为初始物;对于在临盆病毒进程中宿主细胞产生病变和逝世亡的病毒如腺病毒,在病毒产生达到岑岭时,收集造就上清,并裂解细胞以释放细胞内的病毒.造就上清和细胞裂解液都可作为纯化的初始物.在实验室的小范围制备中,往往采取将造就上清与细胞一路反复冻融3～4次的办法制备细胞裂解液作为初始物.对于初始物体积大于500ml的较大范围的制备,则须要斟酌采取不合初始物的损益率.假如收集时大部分（90％以上）目标病毒仍消失于细胞中,为了削减操纵大体积初始物带来的便利,可以斟酌废弃上清中含有的目标病毒,而经由过程低速离心收集细胞,重悬于较小体积的缓冲液中进行细胞裂解制备细胞裂解液.对于腺病毒和AAV病毒的大范围制备都可以采取这种方法.假如经由过程延伸造就时光可以使大部分的目标病毒释放到造就液中,也可以只收集造就上清而弃去细胞,从而省去反复冻融的步调.除了用反复冻融办法裂解细胞外,还可以根据目标病毒的生物学性质采取其它不影响其沾染性的办法,如超声法.化学法（如在AAV病毒制备顶用脱氧胆酸或氯仿）等.初始物的浓缩当初始物体积较大时,要斟酌对其进行浓缩后再分别纯化.浓缩时最好同时能获得初步纯化对于后果. 在不影响目标病毒的沾染性的前提下,可选用盐析.超滤.透析等办法进行浓缩.盐析法不但可以用来浓缩初始物,同时也能达到必定的分别纯化后果.最经常运用的盐是硫酸铵;很多病毒如腺病毒.AAV病毒和单纯疱疹病毒用聚乙二醇/氯化钠体系沉淀可获得很好的后果并且不影响病毒的沾染性.目标病毒的分别纯化氯化铯密度梯度离心法至今仍是分别纯化各类病毒的最经常运用办法.主如果根据不合病毒具有特点性的浮力密度,使其与细胞裂解液中的其它成分分别开来.收集到目标病毒特异的组分后,用透析法除去个中的氯化铯,获得纯化的病毒.用这种办法有时可获得极高纯度的病毒.今朝在临床实验中运用的重组腺病毒大都是用这种办法进行纯化的.然而,这种办法也消失明显的弊病,主如果费时且操纵难度较大,反复性较差;并且氯化铯对人体有毒性.是以跟着基因治疗研讨和运用的成长,用这种办法纯化的重组病毒可能不克不及顺应人体内运用的请求.第五节安然性检测总的来说,病毒载体系体例剂的安然性检测重要涉及以下几个方面（Aderson RW 1996）：有复制才能的病毒（replication competent virus, RCV）RCV一般产生于重组病毒临盆进程中基因重组事宜.因为RCV具有复制才能,在临盆进程中一旦消失,就可能呈现优势发展,从而影响载体病毒的产量;别的,含有RCV的成品用于人体内可能导致轻微的病毒沾染或急性/慢性病毒血症.RCV是对用于基因治疗的病毒载体系体例剂安然性检测的特有项目.检测RCV的办法因不合的病毒载体而异.对于反转录病毒载体,检测有复制才能的反转录病毒（RCR）的办法主如果PG4 S+L- 剖析法;也可采取其它的变通办法.对于腺病毒载体,检测有复制才能的腺病毒（RCA）重要采取空斑剖析办法及PCR办法.帮助病毒对于临盆进程须要帮助病毒介入的病毒载体如AAV病毒载体,因为这些帮助病毒本身具有复制才能并对机体细胞有损坏性,是以检测病毒制剂中的帮助病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒的残存量十分重要.其它成分的污染检测指标包含细菌.霉菌.支原体.内毒素等及在纯化进程中所用试剂如氯化铯等的残存量.第六节病毒载体的成长偏向基因治疗研讨的快速成长对基因导入体系提出了越来越高的请求.病毒载体的成长也日新月异,包含对已有病毒载体的不竭改良和完美,和越来越多的其它病毒被改革成为新的病毒载体.病毒载体的成长偏向可归纳成以下几个方面：轻便.高效的病毒载体包装体系：斟酌到包装的高效性和操纵的轻便性,越来越多的病毒载体临盆体系将采取双构成身分体系.这种体系轻易用于病毒载体的大范围临盆（Liu XL et al.1999; Conway JE et al. 1999 ）.无病毒基因的病毒载体（gutless viral vector）：去除病毒载体中所有的病毒基因,只保存其复制和包装所必须的顺式感化元件,是病毒载体的重要成长偏向.这种计谋可最大限度地扩展载体的容量和削减病毒对细胞的直接毒性和病毒蛋白表达引起的免疫毒性. 腺病毒的微载体（mini-Ad）.AAV载体.HSV扩增子载体都是无病毒基因的病毒载体.这一成长偏向须要解决的重要问题是树立高效.安然（无帮助病毒污染）的包装体系.可调控表达外源基因的病毒载体：在很多疾病的基因治疗中,实现外源基因的可调控表达十分重要.如糖尿病的基因治疗,外源的胰岛素基因的表达最好能受血糖程度的调控;肾性贫血的基因治疗,EPO基因的表达最好能受血氧含量的调控等.今朝所研讨的表达调控体系重要包含各类药物引诱的表达"开关".个中四环素掌握体系（Tet-on和Tet-off）是人工设计的一种基因表达调控模式.这个体系在体外和动物体内实验中都表示出优越的表达调控感化（Fotaki ME et al.1997; Miller N and Whelan J 1997）.然而,因为个中的反式感化蛋白（tTA或rtTA）是异种蛋白,在机体内可能引起毒性感化和免疫反响,是以用于人体前还需斟酌其安然性和长期有用性.比来Binley K等（1999）报导了用缺氧反响元件（hypoxia response element ,HRE）腺病毒载体中外源基因的表达.缺氧可激活bHLH/PAS 家族转录因子的表达,它们可结合HRE焦点序列上,诱发其下流基因的表达.自我扩增型载体（self-amplifying vector）（Herweijer H and Wolff JA 1997）：今朝的基因转移办法基因转移的效力仍相对较低,尤其是在体内.为了进步外源基因表达总程度,除了进步基因转移效力外,另一种办法是尽量进步外源DNA在细胞中的表达程度.用自我扩增型的表达载体是达到此目标的办法之一.这些载体是以正链RNA病毒Sindbis病毒和Semliki Forest 病毒为基本的.用目标基因代替病毒的外壳蛋白编码序列,导入靶细胞中,病毒的复制蛋白大量复制重组的基因组,mRNA程度的大量增长导致高程度的转导基因表达.自我扩增型载体的表示情势可所以RNA,DNA和重组病毒.特异性复制型性病毒载体（specifically replicating vector）：指可在某种特点的组织中产毒性复制,而在其它组织中不增殖的病毒载体.这类病毒载体重要用于特异性裂解肿瘤细胞.如腺病毒突变株Onyx-015是55KdalE1B基因功效缺掉的腺病毒突变株,可以选择性地在p53基因突变的肿瘤细胞中增殖,而在正常组织细胞中不增殖.用这种突变株结合化疗治疗恶性肿瘤II 期临床成果令人鼓舞（Kirn D et al. 1998）,已进入III期临床实验,从此,很多人工改革的腺病毒突变体被用于肿瘤治疗研讨中.如将腺病毒E1基因的表达用甲胎蛋白（AFP）启动子掌握,使得该病毒只能在甲胎蛋白阳性的肝癌细胞中增殖导致细胞逝世亡.也可以将这种病毒的基因组分开装在两个互补的缺点性腺病毒载体上（Alemany R et al. 1999）,个中一个载体除了腺病毒复制和包装所必须的顺式感化元件外,只含有E1区基因,个中E1A基因的表达受AFP启动子的掌握;另一个载体为E1区缺掉的重组腺病毒.这两个载体同时沾染AFP阳性的肝癌细胞时,病毒可不竭增殖而引起细胞逝世亡;对于AFP阴性的细胞,E1A基因不表达,因而病毒不克不及增殖.相似的设计在HSV载体系统也有报导.除了用甲胎蛋白作为反式激活因子外,各类其它组织特异性表达的蛋白和调控序列都可被用来掌握病毒的增殖.嵌合型病毒载体（hybrid viral vector）：是指将不合病毒的基因元件进行组合,形成的重组杂合病毒.如腺病毒与AAV病毒的杂合体病毒,既具有腺病毒的沾染性和基因组特点（双链线状DNA）,又具有AAV病毒的染色体整合性（Lieber A et al. 1999）.各类病毒基因元件组合形成新的杂合载体的报导层见叠出,如单纯疱疹病毒扩增子与AAV病毒杂合载体（Johnston KM et al. 1997）.腺病毒与EB病毒复制子杂合载体（Tan BT et al. 1999）腺病毒与反转录病毒杂合载体（Caplen NJ et al. 1999）等,不一而足.这些杂合载体使重组病毒的特点多样化,以顺应不合基因转移目标的须要.靶向性病毒载体（targeted viral vector）：是指能特异性地结归并沾染某种细胞的病毒载体.靶向性病毒载体的产生重要有两种办法.一种办法是将病毒颗粒与某一靶向分子（Harari OA et al.1999 ）或特异性抗体（Bartlett JS et al. 1999）偶联;另一种办法是经由过程转变病毒外壳蛋白的构造,使其对细胞的亲嗜性产生转变（Reynolds P et al.1999;Krasnykh VN et al. 1996 ）.用各类其它病毒构成新型病毒载体：略.参考文献Aderson RW. 1996. 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慢病毒载体,稳定表达
慢病毒载体，稳定表达一、慢病毒逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。
主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。
慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。
最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。
慢病毒结构：2个调节基因：（1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。
（2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。
4个辅助蛋白（附属）基因：（1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生；（2）vpr和nef参与疾病的表现。
慢病毒的优势：1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因；2.可感染分裂和非分裂细胞；3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验；4.可以更换特异性启动子；5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；二、慢病毒载体慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。
可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
慢病毒包装过程：慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
蛋白表达载体常用标签综述
蛋白表达载体系统重组蛋白表达技术和重组蛋白表达载体现已广泛应用于生物学各个具体领域,尤其是体内功能研究和蛋白质的大规模生产。
GeneCopoeia的蛋白表达载体按照表达宿主的不同分为3类:B类，M类和Lv 类。
B类的表达宿主为大肠杆菌，M类的宿主为哺乳动物细胞，Lv类是慢病毒载体，宿主可以为哺乳动物细胞或原代细胞。
除了必要的复制和筛选的元件，协助表达和翻译的元件外，本文将各类载体按荧光蛋白标签、多功能标签、促溶解度标签和抗体免疫共沉淀标签四种，先将几种主流的标签功能初步介绍如下：eGFP/eCFP/eYFP/mCherry分别是增强型绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/增强型黄色荧光蛋白/单体红色荧光蛋白标签,具有不同的激发波长和发射波长，均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变和密码子优化而来。
就eGFP而言，相对于GFP，其荧光强度更强、荧光性质更稳定。
同时载体中构建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。
mCherry是从DsRed演化来的性能最好的一个单体红色荧光蛋白，可以和GFP系列荧光蛋白共用，实现多色标记体内、外实验表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白时，荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能相互没有明显影响。
这些荧光标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：1.不用破碎组织细胞、不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针。
2.其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。
3.同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测效果更快速、简便、灵敏度高而且重现性好。
4.其低消耗、高灵敏度检测的特性，十分适用于高通量的药物筛选。
现eGFP 表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。
维真生物-如何阅读基因载体图谱
如何阅读基因载体图谱1、按属性分类：病毒载体和非病毒载体病毒载体是一种常见的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入目的细胞，进行感染的分子机制。
可发生于完整活体或是细胞培养中。
可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。
用于基因治疗和疫苗的病毒载体应具备以下基本条件：（1）携带外源基因并能包装成病毒颗粒；（2）介导外源基因的转移和表达；（3）对人体不致病；（4）在环境中不会引起增殖和传播。
非病毒载体一般是指质粒DNA。
2、按进入受体细胞的类型分类：原核载体、真核载体、穿梭载体（含原核和真核2个复制子，能在原核和真核细胞中复制，并可以在真核细胞中有效表达）。
3、按功能分类：克隆载体、表达载体克隆载体：具有克隆载体的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以携带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增DNA片段（外源基因）的载体。
表达载体：克隆载体中加入一些与表达调控（具有转录/翻译所必需的DNA顺序）有关的元件即成为表达载体。
1、复制起始位点Ori：即控制复制起始的位点。
Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。
2、抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+（1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。
（5）hygr：使潮霉素β失活。
3、多克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段，它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
还要再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
三种病毒表达系统的异同点
三种病毒表达系统的异同点⼀、病毒表达系统简介病毒载体是指以病毒为基础的载体，也是⽬前最常⽤的基因导⼊⽅式之⼀。
通过对病毒基因组的遗传改造，使之能够携带外源⽬的基因和相关的病毒元件，并被包装成病毒颗粒。
病毒进⽽侵染宿主，使携带的外源基因在宿主体内表达。
病毒的基因组可分为编码区和⾮编码区。
其中，编码区包含病毒的必需基因和⾮必需基因，可分别表达产⽣病毒的结构蛋⽩和⾮结构蛋⽩；⾮编码区则含有病毒复制和包装所需的全部顺式作⽤元件。
由于野⽣型病毒常常具有致病性，为了避免实验或治疗中使⽤的病毒恢复成野⽣型，必须对病毒载体进⾏⼀系列的遗传改造。
譬如删除病毒基因组的⾮必需区，将顺式作⽤元件和反式作⽤元件分开连接⾄不同的载体上，或结合利⽤不同种病毒的必需蛋⽩等，最⼤程度地保证实验的安全性。
哺乳动物病毒表达系统常常包含⼀到多个载体，将所需的载体转染包装细胞后，在反式因⼦的作⽤下，病毒复制、包装所需的顺式作⽤元件和外源基因表达盒即可被包装，最终产⽣带有外源基因的病毒颗粒。
经浓缩和纯化后的病毒液即可⽤于侵染⽬标宿主细胞或动物体，实现外源⽬的基因在宿主体内的表达。
⼆、病毒表达系统的优势病毒的转导效率⽐常规真核表达载体⾼很多，因此特别适合于介导外源基因在难转染甚⾄⽆法转染的哺乳动物细胞中表达。
三、辉骏⽣物病毒服务简介辉骏⽣物的病毒产品包括慢病毒、腺病毒和逆转录病毒，服务项⽬包括：各类病毒载体的构建和病毒包装，以及慢病毒介导的稳定表达株建⽴等。
慢病毒表达系统：⼀种很常⽤的哺乳动物病毒表达系统；慢病毒感染宿主细胞时，可将携带的外源基因随机、稳定地整合⼊宿主细胞基因组中，实现⽬的基因稳定、长期的表达，⾮常适合于基因过表达稳定细胞株的建⽴和RNAi研究。
图1 慢病毒感染宿主细胞原理图腺病毒表达系统：⼀种很常⽤的哺乳动物病毒表达系统；但与慢病毒不同的是，腺病毒基因组及其携带的外源基因不会整合⼊宿主细胞的基因组中，⽽是游离于宿主基因组外独⽴表达，因此可实现⽬的基因瞬时、⾼丰度的表达，同时还避免了因整合⽽引发的潜在的基因突变和随机效应，安全性和可控性⾼。
腺病毒载体的分类及包装方法
腺病毒载体的分类及包装方法1.腺病毒载体分类第一代腺病毒载体：指E1或E3基因缺失的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量为6.5-8Kb；(2)适用于大多数基因治疗，且容易获得高滴度的病毒；(3)可用于表达重组蛋白质或将外源基因导入对其他转染方法不敏感的细胞株中；(4)若未经纯化使用，容易引发机体产生强烈的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用。
第二代腺病毒载体：指E2A或E4基因缺失的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量增加，可达14Kb；(2)病毒蛋白表达降低，引发机体的免疫反应比第一代弱；(3)外源基因表达时间较长；(4)病毒产量较低，且滴度降低。
第三代腺病毒载体：也称为空壳载体或辅助病毒载体，指全部或大部分腺病毒基因组缺失，仅可保留ITR和包装信号序列的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量大幅度提高，可达37Kb；(2)无病毒蛋白表达，降低了机体的免疫反应，提高了安全性；(3)外源基因可长期稳定表达；(4)需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒；(5)可反复应用，无需考虑机体的抗腺病毒中和抗体的影响。
2.腺病毒载体包装方法传统的双质粒共转染法将插入了外源基因的穿梭载体质粒与携带腺病毒基因组的质粒共转染293细胞，这两种质粒在293细胞内通过随机的同源重组（同源序列的DNA分子之间或者分子之内的重新组合），形成重组腺病毒载体基因组，并包装成病毒颗粒。
局限性：(1) 操作较复杂，因其易被亲代病毒污染，需经过多次纯化和鉴定；(2) 重组效率低，耗费时间较长。
注：此方法适用于临床。
(1)Ad-Easy法将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的质粒共转染RecA+细菌，在细菌RecA 重组酶的作用下，经抗性筛选获得重组腺病毒基因组质粒，将其酶切纯化后转染293细胞，包装成重组病毒颗粒。
特点：(1) 酶切和连接步骤少，操作简便；(2) 可选择的穿梭载体多；(3) 同源重组率达60%以上，效率相对较高；局限性：(1) 某些腺病毒基因容易发生突变；(2) 设备和技术要求较高。
基因治疗的三大类基因传递载体与基因传递效率评估
基因治疗的三大类基因传递载体与基因传递效率评估基因治疗是利用基因传递载体将修复或替代基因传递到患者的细胞中，以治疗遗传性疾病、癌症等难治性疾病的一种方法。
在基因治疗过程中，选择合适的基因传递载体和评估基因传递效率是非常重要的一步。
本文将介绍基因治疗中的三大类基因传递载体以及基因传递效率的评估方法。
第一类基因传递载体是病毒型载体。
病毒型载体可以将基因传递到目标细胞内，并整合到宿主基因组中，实现长期稳定的基因传递效果。
常用的病毒型载体包括腺病毒（Adenovirus）、逆转录病毒（Retrovirus）和腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）等。
这些病毒型载体具有高效率的基因传递能力，但也存在一些问题，比如免疫反应、随机插入等。
然而，病毒型载体在基因治疗中仍然是最常用的载体，因为它们可以针对不同类型的细胞和组织进行基因传递。
第二类基因传递载体是非病毒型载体。
非病毒型载体是指没有感染细胞的能力，通常可以通过物理或化学手段将基因传递到细胞中。
常见的非病毒型载体有质粒DNA、利用电穿孔或超声波破裂、脂质体等。
相比病毒型载体，非病毒型载体有许多优点，如安全性高、简易制备、规模化生产等。
然而，非病毒型载体的缺点是传递效率相对较低，对于某些细胞类型的基因传递效果较差。
第三类基因传递载体是基因编辑工具。
基因编辑工具一般用于精确修改基因，包括锌指核酸酶（Zinc Finger Nucleases，ZFNs）、类转录因子效应子（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和CRISPR/Cas9等。
这些工具可以通过靶向特定的DNA序列来实现基因的精确修饰，比如基因敲除、插入和突变等。
基因编辑工具具有高效的基因传递能力和精确性，但也面临着安全性和伦理问题的挑战。
为了评估基因传递效率，科研人员通常会采用多种方法来确定基因传递的效果。
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程是一种用于改变和改造生物体遗传基因的技术，它是利用分子生物学技术提高生物性状的一种新技术。
在基因工程中，需要使用一种材料将外源基因投入细胞中，这种材料就是载体。
基因工程中常用的载体有以下三种：
1. 质粒载体. 质粒载体是一种比较常见的基因工程载体，具有较强的稳定性，它是一种质粒DNA，也称为质粒DNA，不是单链DNA，它是由细菌质粒的DNA结合其它分子，形成质粒DNA的结构，具有可复制性能，可以在细菌或动物细胞中复制，具有较强的稳定性。
2. 杆状病毒载体. 杆状病毒载体是一种比较常见的基因工程载体，它由病毒的全基因组和其它分子形成，用来转移外源基因到细胞中，可以把外源基因转移到细胞核或任何其它的地方，可以实现基因工程的目的。
3. 化合物载体. 化合物载体是一种新型的载体，它是由多种不同的分子组成的，可以将外源基因转移到细胞核或其它位置，并且可以把这些基因在细胞中表达出来，从而实现基因工程的目的。
用于基因治疗的基因包括三大类
用于基因治疗的基因包括三大类。
第一类是正常基因，它是从健康人体内分离得到的，它可通过同源重组方式置换病变基因或依靠其表达产物弥补病变基因的生理功能，这些基因常用于治疗各种基因缺陷型遗传疾病如血友病、地中海贫血病等。
第二类是反义基因，它主要用于治疗获得性分子疾病，通过反义基因体内表达产物(RNA)或与病毒激活因子编码基因互补，或与肿瘤基因mRNA互补，从而阻断其表达。
第三类是自杀基因，这是一类编码能杀伤癌变细胞的酶蛋白基因，它们存在于病毒、细菌和真菌中，能将无毒的细胞代谢产物转变为有毒的化学物。
表达载体的构建是基因治疗成功与否的关键，理想的载体应该是滴度高、能感染大量的细胞、制备方便且重复性好、能定向进入目的细胞并整合到宿主染色体特异位点、能以附加体的形式稳定存在、转录单元有可调控的操纵元件、不含有能激发免疫反应的组分。
目前在基因治疗中使用的载体包括病毒型载体和非病毒型载体两类，病毒型载体包括腺病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体和反转录病毒载体等，它是基因治疗中使用的主要载体；非病毒型载体包括脂质体载体和多聚阳离子载体等。
目前已建立多种适合基因治疗的基因转移方法。
常见的体内疗法中包括病毒颗粒直接注射法、重组DNA分子直接注射法、呼吸道吸入法、基因枪转移法和电穿孔法等。
体外疗法一般采用病毒转染法。
（1）肿瘤的基因治疗。
肿瘤的发生与细胞中染色体DNA结构的变化密切相关。
随着经济和环境等各种因素的影响，恶性肿瘤的发生率不断升高，而传统治疗方法的治愈率低、复发率和死亡率高。
随着对肿瘤发病机制的研究，越来越多的肿瘤相关基因被克隆。
因此，利用基因治疗的方法对肿瘤进行治疗已成为一种重要的选择。
目前对肿瘤的基因治疗主要采取以下策略，即抑癌基因治疗法、基因修饰瘤苗法、免疫基因治疗法和自杀基因治疗法。
反义癌基因治疗是通过封闭癌基因、抑制癌基因的过度表达而实现的。
利用反义癌基因与肿瘤细胞内癌基因mRNA等结合，减少癌基因的表达或调整癌基因表达的比例。
简述基因克隆载体的主要类型
简述基因克隆载体的主要类型
基因克隆载体是指一类可以携带外源DNA片段并能够被复制的DNA分子。
常用于基因工程中，将特定基因序列克隆到载体DNA上，进而进行转化和表达。
根据不同的功能和应用，基因克隆载体可以分为多种类型，以下是主要的几种：
1. 质粒（Plasmid）：质粒是最常用的基因克隆载体之一，通常起源于细菌，具有自主复制的能力，易于操作和扩增。
质粒通常被用于基因表达、基因敲除和基因突变等领域。
2. 病毒载体（Viral Vector）：病毒载体是一类通过改造病毒而成的基因克隆载体，具有高度的转染效率和生物安全性。
病毒载体通常被用于基因治疗、免疫治疗和癌症治疗等领域。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）：人工染色体是一种可以模拟天然染色体结构和功能的基因克隆载体，通常具有高度的稳定性和扩增性能。
人工染色体通常被用于基因组学研究和治疗复杂遗传病等领域。
4. 原核表达载体（Prokaryotic Expression Vector）：原核表达载体是一类专门用于大肠杆菌等原核生物中进行基因表达的基因克隆载体。
原核表达载体通常具有高度的表达效率和易于操作的特点，被广泛应用于蛋白质制备和生物技术研究等领域。
载体构建
载体种类： 载体种类：
1.原核表达载体 2.真核表达载体 3.病毒表达载体（是真核载体的一种） 4.克隆载体
构建载体种类取决与实验的需要： 构建载体种类取决与实验的需要 本实验最常见的载体构建类型： 1. 构建基因表达载体 2. 构建microRNA表达载体 3. 构建shRNA干扰载体
基因表达载体的构建： 基因表达载体的构建 考虑问题： 考虑问题： 1. 选用什么样的表达载体？ 选用什么样的表达载体？
1）普通真核表达载体 ） 2）病毒载体 ） ①慢病毒载体（因模板从哪里来？
1）PCR从cDNA模板中扩增 ） 从 模板中扩增 2）商业化的IMAGE 克隆中扩增 ）商业化的
基因模板从哪里来？ 基因模板从哪里来？ 1）PCR从cDNA模板中扩增 ） 从 模板中扩增 引物设计最好采用巢式PCR方法 方法 引物设计最好采用巢式
5‘非翻译区 CDS区 3‘非翻译区
（内引物） 内引物） 初次PCR引物设计（外引物） 引物设计（外引物） 初次 引物设计 2）商业化的IMAGE 克隆中扩增 ）商业化的 直接设计与载体匹配的引物
在本次载体构 建：可以添加 AC,最后与C 组成三联体密 码（只要不是 终止码）
后续过程： 1.NESG1 PCR 扩增，纯化，EcoRI和KpnI酶切，纯化
2.质粒扩增，提取纯化, EcoRI和KpnI酶切线性化，低浓度琼脂糖电泳，胶回 收纯化 3.模板与线性化质粒连接
4.转化感受态大肠杆菌
5.鉴定（PCR、双酶切和测序鉴定）
选择载体的优缺点： 选择载体的优缺点： 1.普通真核表达载体 普通真核表达载体 优点：多克隆位点比较多， 优点：多克隆位点比较多，易于构建 缺点：建立稳定转染细胞时间长， 缺点：建立稳定转染细胞时间长，耗时耗力
载体的种类6
一 质粒（plasmid）载体
（一）质粒（plasmid）概述
质粒是细菌染色体外的遗传物质，为环形闭合的双股 DNA（部分质粒为RNA）。 ,存在于细胞质中，质粒编码 非细菌生命所必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、 毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代、也可 丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列
M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建 的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切 位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有 pBR322、pSC101。
质粒电泳图
2 大肠杆菌质粒的类型
F因子F进因供编子体码编菌在码向在细受细菌体菌菌表表传面面递产产色生生体性性D菌N菌A毛或毛。质。F粒因F。子因F的子因特的子性决特为定性可编以为码促可 以促的进性供菌体毛菌可在向供受体体与菌受传体菌递间色形体成D交N通A通或连质接粒结。构，F因从子而 决 定编可码使的两性个菌杂交毛细可菌在间供形体成胞与浆受内体连菌接间桥。形成交通连接结构，
（3）λ噬菌体的衍生物 λ噬菌体:λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子， 它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状DNA分子在 细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒， 裂解宿主菌再进行下一次感染；其二是溶源性生长，即感染细胞内 λ噬菌体DNA整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制，并遗传给子 代细胞，宿主细胞不裂解。平板培养时，裂解生长形成噬斑。液体 培养时，裂解生长使菌液中宿主菌最后全部被裂解而释放出大量的 噬菌体颗粒。经过改造的λ噬菌体克隆位点可插入几到几十菌体 裂解生长的特点，培养获得大量的噬菌体颗粒，并提取λ噬菌体 DNA来开展进一步的工作。
质粒载体种类
质粒载体种类
质粒载体种类繁多，可以根据其功能和用途进行分类。
以下是一些常见的质粒载体类型：
1. 克隆载体：这种类型的质粒主要用于克隆和扩增DNA片段。
它们通常具有易于克隆的限制性酶切位点，以及细菌选择标记和多克隆位点。
2. 表达载体：表达载体用于在宿主细胞中表达目的基因。
这些载体包含可调控的启动子和终止子，以及选择标记和目的基因的克隆位点。
3. 干扰基因表达载体：这种载体主要用于抑制目标基因的表达。
它们通常包含干扰RNA（RNAi）的序列，以沉默特定基因的表达。
4. 病毒载体：病毒载体可以利用病毒的特性来传递遗传物质。
它们可以携带治疗性基因或用于基因编辑，并通过感染宿主细胞来传递这些基因。
此外，还可以根据质粒的拷贝数、复制起始区、选择标记基因区、多克隆位点等特征对质粒载体进行进一步分类。
动物基因工程载体
动物基因工程载体动物基因工程载体主要是由动物病毒构建的一类载体，例如猴空泡病毒SV40载体、人腺病毒载体、杆状病毒载体，它们在动物基因工程中已越来越多的被应用。
动物病毒病毒是一类十分有害的微生物，因此，在构建病毒载体时，要十分重视病毒本身的致病性，往往是利用致病力弱的动物病毒或某些病毒的弱毒株，改造和构建成基因载体。
下面我们就几类病毒载体进行简单说明。
猿猴空泡病毒SV40载体猿猴空泡病毒SV40病毒的基因组是一种环形双链的DNA，仅为5243bp，便于基因操作SV40寄主的特异性SV40感染不同的宿主细胞，会产生不同的效应，根据效应的不同可把宿主细胞分成3种不同的类型l受纳细胞：猿猴细胞，细胞裂解l非受纳细胞： 啮齿动物（通常指仓鼠和小鼠）细胞，病毒基因组整合到寄主细胞的染色体上，细胞发生癌变l半受纳细胞：人体细胞感染SV40后，只有1%～2%的细胞会产生感染性的病毒，人体细胞就是SV40的半受纳细胞SV40的载体构建SV40的载体取代型载体混合型载体早期转录区取代载体晚期转录区取代载体SV40病毒载体的缺点由SV40构建的载体存在以下的缺点l容量小，只能插入2.5kb外源DNA片段l感染的宿主范围有限，只能在猴细胞中复制l与辅助病毒一起作用时，存在产生野生型SV40的危险反转录病毒载体反转录病毒：又称逆转录病毒，是一种整合型、单链RNA病毒。
LTR LTR GAG POL ENV编码结构蛋白编码反转录酶编码外膜糖蛋白顺式作用序列：启动子、增强子、病毒包装信号及整合必需序列等反转录病毒反转录病毒基因组结构反转录病毒载体的构建策略l保留病毒基因组的顺式作用序列l用外源基因替代病毒的反式作用序列l外源DNA片段可长达7kbl重组子在辅助病毒的作用下，可产生有感染性的反转录病毒粒子，以出芽的方式释放到细胞外，感染目标细胞l反转录形成cDNA，整合到宿主细胞染色体上，达到了基因转移的目的l重组病毒不含有反式作用序列，反转录病毒载体一般只能感染一次宿主细胞构建反转录病毒载体的一般步骤l反转录病毒顺式作用序列与外源基因进行重组l重组反转录病毒颗粒的产生LTR LTRFOREIGN cDNA GAG POLENV 包装细胞转染释放具一次感染性的“假病毒粒子”靶细胞“假病毒粒子”感染靶细胞反转录病毒载体的举例反转录病毒载体的优点l基因转移和整合效率高l反转录病毒载体宿主范围广l病毒感染宿主细胞后，细胞不发生病变，可以稳定地表达外源基因l反转录病毒较小，易于操作，克隆容量较大，l反转录病毒载体为缺陷型，安全性有保障慢病毒载体慢病毒是反转录病毒科亚科之一可分为灵长类和非灵长类两大类慢病毒载体是以HIV-1为基础发展起来的转基因载体慢病毒与反转录病毒区别反转录病毒：感染处于分裂期细胞慢病毒：对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力目前最受欢迎的基因功能研究工具之一载体质粒包装、包膜质粒共转染病毒颗粒转染靶细胞全屏l慢病毒自身的包膜蛋白替换成水泡性口炎病毒(VSV-G)的包膜蛋白：提高慢病毒承受超离心的剪切力；拓展了慢病毒载体感染细胞的类型；降低了HIV-1恢复成野生型病毒的可能l在包装质粒中删去了HIV的所有附属基因：不影响病毒的滴度和转染能力，增加了载体的安全性l删除了U3区的3′LTR区，构建了自身失活的慢病毒载体，同时去除了Tat基因使得原始的载体中只保留了Gag、Pol和Rev 3个基因。
三大类病毒表达载体
逆转录病毒载体系统
杰特伟
选用的背景：由于重组腺病毒对于一些细胞类型难以转染，比如
各种类型的原代细胞、体内细胞，同时希望基因永久性表达，即将基 因整合入靶细胞的基因组中，此时可以考虑选用逆转录病毒。
逆转录病毒简介： 反转录病毒载体是常用的病毒载体之一，是
由具有感染性的小鼠的白血病病毒改造而来，能将非病毒基因导入细 胞体内或体外进行有丝分裂。这些载体能产生病毒基因组的单一拷贝 并高效准确地整和到宿主染色体 。
杰特伟杰特伟基因载体系统基因载体系统病毒载体系统病毒载体系统非病毒载体系统非病毒载体系统腺病毒载体体腺病毒载反转录病毒载体体反转录病毒载腺伴随病毒载体体腺伴随病毒载单纯疱疹病毒载体体单纯疱疹病毒载慢病毒载体体慢病毒载裸裸dnadnadna阳离子脂质复合物dna阳离子脂质复合物dna蛋白质复合物dna蛋白质复合物细胞内包装细胞内包装细胞外包装细胞外包装dna阳离子多聚物dna阳离子多聚物dnarna嵌合物dnarna嵌合物杰特伟杰特伟公司相应的病毒表达载体质粒sirna表达载体去除去除cmv启动子动子和和egfp荧启光蛋白光蛋白质粒较小质粒较小最好最好使用使用的的荧rnai质粒之一质粒之一杰特伟杰特伟质粒sirna表达载体cmv启动子动子和和egfp荧启光蛋白光蛋白荧杰特伟杰特伟诱导性的sirna表达启动子四环素四环素强力霉素强力霉素杰特伟杰特伟teton基因表达系统的小常识gossen等构建了受四环素负调节的teton基因表达系统
常用的病毒载体的特点：
杰特伟
病毒载体
反转录病毒载体 单链 RNA 病毒 8~10kb
腺病毒载体 双链 DNA 病毒 36kb
A AV 病 毒 载 体 单链 DNA 病毒 ~5kb
HSV 病 毒 载 体 双链 DNA 病毒 152kb
【分子克隆】第七期：病毒表达载体
【分⼦克隆】第七期：病毒表达载体
病毒表达载体是以病毒基因组序列为基础，插⼊必要的表达载体元件所构建成的真核基因转移⼯具。
这些表达载体元件有①源于病毒的启动⼦和增强⼦；②病毒的复制⼦序列以及所需的反式作⽤因⼦编码基因；③poly A加尾信号。
病毒表达载体可⽤于∶①外源蛋⽩的真核表达；②基因治疗；③多价、多联活载体疫苗的研制；④基因功能的鉴定
病毒载体⼤体上可分为两种类型：重组型病毒载体和⽆病毒基因的病毒载体。
重组型病毒载体
以完整的病毒基因组为改造对象，⼀⽅⾯选择性地删除病毒的某些必需基因，缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供；另⼀⽅⾯⽤外源基因表达单位替代病毒⾮必需基因区；⽽病毒复制和包装所需的顺式作⽤元件不变。
这类载体⼀般通过同源重组⽅法将外源基因表达单位插⼊病毒基因组中。
⽆病毒基因的病毒载体
这类载体系统往往由载体质粒和辅助系统组成。
重组载体质粒主要由外源基因表达盒、病毒复制和包装所必需的顺式作⽤元件及质粒⾻架组成。
辅助系统包括病毒复制和包装所必需的所有反式作⽤元件。
在辅助系统的作⽤下，重组载体质粒（包含或不包含质粒⾻架）以特定形式（单链或双链，DNA或 RNA）被包装到病毒壳粒中，其中不含有任何病毒基因。
这类载体的优点在于载体病毒本⾝安全性好，容量⼤；缺点在于往往需要辅助病毒参与载体DNA的包装，⽽辅助病毒⼜难以同载体病毒分离开来，造成最终产品中辅助病毒污染，从⽽影响其应⽤。
实际上，⽆病毒基因的病毒载体可以看作是重组病毒载体的⼀种极端减毒情况。
重组AAV 载体就属于⽆病毒基因的病毒载体。
基因治疗中常用的载体类型及特点
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病载体在蛋白质表达中的应用
病载体在蛋白质表达中的应用基因工程领域的蛋白质表达技术在医学、农业和生物科学研究中具有广泛而重要的应用。
为了实现高效的蛋白质表达，科学家们利用病载体作为载体，有效地将目标基因导入到目标细胞中。
本文将探讨病载体在蛋白质表达中的应用，并重点关注它在蛋白质表达效率和蛋白质纯化方面的作用。
一、病载体的选择在蛋白质表达中，选择适合的病载体非常重要。
常见的病载体包括质粒、噬菌体和腺病毒等。
1.质粒是一种双链环状DNA分子，在细菌细胞中能够自复制。
质粒具有较强的稳定性和易于操作的特点，广泛应用于重组蛋白质的表达。
通过将目标基因插入质粒中并将质粒导入宿主细胞，就可以实现目标基因的高效表达。
2.噬菌体（如T4噬菌体）是一种寄生于细菌的病毒。
它可以通过感染细菌细胞来进行蛋白质表达。
利用噬菌体展示技术，科学家们可以将目标蛋白质的编码序列插入噬菌体基因组中，从而使噬菌体在感染细胞时同时表达出目标蛋白质。
3.腺病毒是一种常见的病毒载体，广泛应用于蛋白质表达和基因治疗领域。
腺病毒具有高度的感染效率和较大的基因载荷容量。
通过将目标基因导入腺病毒载体中，并将其传送到细胞中，可以实现高效的目标蛋白质表达。
二、病载体在蛋白质表达效率中的应用病载体在蛋白质表达中起到了关键作用，它能够提高表达效率并改善蛋白质产量。
这对于大规模生产重组蛋白质具有重要意义。
1.病载体的复制和分离质粒和病毒载体具有自复制的能力，它们在宿主细胞内能够独立地复制，并且可以通过适当的筛选方法分离。
这种复制和分离的机制使得病载体能够高效地扩增，并保证了大量目标蛋白质的表达。
2.病载体的启动子和调控元件病载体中的启动子和调控元件对于蛋白质表达的效率起着重要作用。
研究者可以根据需要选择适合的启动子和调控元件来调整表达水平。
例如，强启动子和调控元件可以使目标基因高水平地表达，从而增加蛋白质产量。
三、病载体在蛋白质纯化中的应用蛋白质纯化是蛋白质表达的重要环节，也是实现高纯度蛋白质产量的关键。
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慢病毒
杰特伟
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基
础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能 力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将 外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能 力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮 细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在 美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景
随后Gossen等对tTA的氨基酸序列进行了改造，构建了 受四环素正调节的Tet-on基因表达系统，该系统在没有 四环素的情况下启动子不被激活，而 在加入四环素或强 力毒素后目的基因高效表达。
四环素诱导的基因表达系统是目前应用最广泛的哺乳动 物细胞诱导表达系统，该系统具有严密、高效可控制性 强的优 点。
siRNA载体 的所有特色； 1.诱导性启动子 2.与stratagene的 adEasy 腺病毒载体
系列的兼容 4。保留少量的MCS 3.cGFP的筛选标记
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慢病毒载体系统
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逆转录病毒siRNA 载体
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siRNA的CK 载体序列
一，萤火虫荧光素酶的siRNA的阳性对照载体 二，海肾荧光素酶的siRNA的阳性对照载体 三：CGFP siRNA的阳性对照载体 四；阴性对照siRNA的载体系统
质粒siRNA 表达载体
去除CMV启 动子
和EGFP荧 光蛋白， 质粒较小，
最好 使用 的 RNAi质粒之一
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质粒siRNA 表达载体
CMV启 动子
和EGFP荧 光蛋白
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诱导性的siRNA 表达启动子
四环素
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强力霉素
Tet-on基因表达系统的小常识
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Gossen等构建了受四环素负调节的Tet-on基因表达系 统。
常用的病毒载体的特点：
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病毒载体
反转录病毒载体 单链 RNA 病毒 8~10kb
腺病毒载体 双链 DNA 病毒 36kb
A AV 病 毒 载 体 单链 DNA 病毒 ~5kb
HSV 病 毒 载 体 双链 DNA 病毒 152kb
生物学特性
适用范围
可感染分裂细胞； 整合到染色体中； 表达时间较长； 有致癌的危险； 可感染分裂和非分裂细胞； 不整合到染色体中； 外源基因表达水平高； 表达时间较短； 免疫原性强； 可感染分裂和非分裂细胞； 整合到染色体中； 无致病性；免疫原性弱； 可长期表达外源基因； 在骨骼肌、心肌、肝脏、视 网膜等组织中表达较高；
E x vivo 基 因 治 疗 ； 肿瘤基因治疗。
In vivo 基 因 治 疗 ； 肿瘤基因治疗； 疫苗。
In vivo 基 因 治 疗； E x vivo 基 因 治 疗 ； 遗传病基因治疗； 获得性慢性疾病的 基因治疗。
具有嗜神经性；可逆轴突传 递； 可潜伏感染； 容量大； 可感染分裂和非分裂细胞；
病毒表达载体
技术支持：龙桂根
Gene
Gene expression system
Gene vector system Gene delivery system
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哺乳动物表达载体的特点；
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特点：哺乳动物细胞表达载体元件包含（1）原核序列、（2）
启动子、增强子、（3）选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号 等。
诱导性的siRNA 表达启动子
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腺病毒siRNA穿梭载体
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主要分为两大类： 一； 与clontech 的adeno-x expression系统兼容 二； 与stratagene的adEasy 腺病毒载体兼容
与clontech 的adeno-x expression系统兼容 杰特伟
去除CMV启动子 和EGFP荧光蛋白，
逆转录病毒载体系统
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选用的背景：由于重组腺病毒对于一些细胞类型难以转染，比如
各种类型的原代细胞、体内细胞，同时希望基因永久性表达，即将基 因整合入靶细胞的基因组中，此时可以考虑选用逆转录病毒。
逆转录病毒简介： 反转录病毒载体是常用的病毒载体之一，是
由具有感染性的小鼠的白血病病毒改造而来，能将非病毒基因导入细 胞体内或体外进行有丝分裂。这些载体能产生病毒基因组的单一拷贝 并高效准确地整和到宿主染色体 。
选用哺乳动物表达载体的优势：
由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方
更 面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统， 接近于天然蛋白质。
外源基因进入哺乳动物细胞的方法
将外源基因导入哺乳动物细胞主要通过类方法 ：
一是感染性病毒颗粒感染宿主细胞，
二是通过脂质体法、显微注射法 、磷酸钙共沉淀法及DEAE一葡聚糖法 等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中。外源基因的体外表达一般采 用质粒表达载体，如将重组质粒导入CHO细胞可建 立高效稳定的表达系 统，而利用COS细胞可建立瞬时表达系统。
目前，病毒载体已成为动物体内表达外源基因的有力工具，在临床基因 治疗的探索中也发挥了重要 作用。
痘苗病毒由于其基因的分子量相当大(约187kb)，利用它作为载体可同时 插入几种外源基因，从 而构 建多价疫苗。另外，逆转录病毒感染效率 高，某些难转染的细胞系也可通过其导入外源基因，但要注意的是逆转 录病毒可整合入宿主细胞染色体，具有潜在的危险 性。
质粒较小， 最好使用的RNAi 质粒之一。避免了E
GFP荧光蛋白 对RNAi实验检 测可能造成的冲突。
与clontech 的adeno-x expression系统兼容 杰特伟
与stratagene的adEasy 腺病毒载体兼容 杰特伟
与stratagene的adEasy 腺病毒载体兼容
注意到，此载体 集金思特
三大类病毒表达载体
一；腺病毒（adenoviral)表达载体 二；逆转录病毒(retroviral)表达载体 三；慢病毒表达(lentiviral)载体 四；三大类病毒表达载体的差异与联系 五；其它病毒表达系统
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腺病毒表达载体
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产生的背景；人们希望基因能在哺乳动物细胞 中表达目的
基因，而传统的办法做不到。
腺病毒是一种线状DNA肿瘤病毒，基因组内有14个基因。目前
对该病毒的分子生物研究已经很深入，而且对该病毒转染后的免 疫应答也了解佷清楚，目前应用范围最广的病毒，其转染效率也 很高，不管是分裂细胞，还是静止细胞，都是如此。
缺陷：不能整合至靶细胞的基因组，只能瞬时表达，更为致命
是腺病毒的某些抗原表达，也很容易引起人体的免疫反应。
CGFP siRNA的阳性对照载体
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神经系统疾病的基 因治疗； 肿瘤的基因治疗。
基因载体系统
杰特伟
DNA/RNA DNADNADNA-
DNA
病毒载体系统
非病毒载体系统
反
腺
腺
单
慢
转
病
伴
纯
病
录
毒
随
疱
毒
病 毒 载
载 体
病 毒 载
疹 病 毒
载 体
体
体
载
体
裸
阳
蛋
阳
离
白
子
质
脂
复
质
合
离 子 多 聚
嵌 合 物
复
物
物
合
物
细胞内包装
细胞外包装
公司相应的病毒表达载体