AQP1真核表达载体的构建及其在FRT细胞的表达

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真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控

真核细胞常见表达载体1. pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。

更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。

插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。

注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。

2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。

Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。

此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。

借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。

亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。

Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+ Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。

原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。

而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。

如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。

（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。

（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。

真核表达载体pIRES—EGFP—PDGF—B的构建及在293T细胞中的表达

摘要目的：构建人基因血小板衍化生长因子Ｂ（ＤＦＢ真核表达载体ｐＲＳＥＦ．ＤＦＢ，ＰＧ —）ｌＥ．ＧＰＰＧ — 并在２３９Ｔ细胞中进行瞬间表达。方法：采用ＰＲ方法从购自美国典型培养物保藏中心含有ＰＧ — ＣＤＦＢ基因全长ｃＡＤＮ序列的质粒中扩增出ＰＧ — 的ｃＡ片段，并与真核表达载体ｐＲＳＥＦＤＦＢＤＮＩＥ．ＧＰ连接双酶切鉴定，最后采用Ｌｐｆｃａｎ００将重组质粒转入２３ｉｏｔｅ２０ｅｍｉ９Ｔ细胞中，用荧光显微镜和Ｗｅｔｒｌ进行表达鉴定。利ｓｎｂｏｅｔ结果：真核表达载体ｐＲＳＥＦ．ＤＦＢ被成功构建，酶切鉴定正确，ｌＥ — ＧＰＰＧ双载体能在２３９Ｔ细胞内正确地表达成熟的ＰＧ．ＤＦＢ蛋
ｔｅｄｖｌｐｅｔｏｉｒｃｎｅ［］ＪＬｂＣｉｄ，０６１７ｈｅｅｏｍｎｆｌｅａｃｒＪ．ａｌＭｅ２０，４ｖｎ（）５－６２：８６．
［］宋霆婷，玉华，４姜李妙玉，ＭＰ等．ＡＫ反义寡核苷酸对肝癌细胞恶性表型的逆转作用［］Ｊ．实用医学杂志，０，１１）２１— ｌ８２５２（９：ｌ６２１．０［］王顺祥，晓慧，周少英，．５吴等乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人肝癌细胞株乙酰肝素酶表达的影响ｆ］实用医学杂志，０５２Ｊ．２０，１

pEGFP_N3_t_PA真核表达质粒的构建及其在成纤维细胞中的表达

3山东省优秀中青年科学家科研奖励基金资助项目(2004BS01012);　33通讯作者:E -mail :grli66bethesda @ 收稿日期:2008-06-20pEGFP -N3-t -PA 真核表达质粒的构建及其在成纤维细胞中的表达3王　栋何成强杨桂文李国荣33(山东师范大学生命科学学院动物抗性生物学重点实验室,250014,济南∥第一作者24岁,男,硕士生)摘要　目的　利用基因工程技术克隆人组织纤溶酶原激活物(t -PA )基因并构建一种能高效、安全表达t -PA 的pEG FP -N3-t -PA 真核表达重组质粒,为进一步研制转基因动物奠定基础.方法　采用高效T riz ol 试剂快速从黑色素瘤细胞中提取总RNA ,RT -PCR 获得t -PA cDNA ,并将真核表达质粒pEG FP -N3和t -PA 基因片段分别双酶切,将回收的pEG FP -N3大片段(4.7kb )与t -PA 基因片段(1.1kb )重组.对pEG FP -N3-t -PA 质粒进行酶切鉴定和基因测序鉴定.脂质体介导pEG FP -N3-t -PA 转染成纤维细胞(NIH 3T 3),并用RT -PCR 法从mRNA 水平检测t -PA 的表达情况,用倒置荧光显微镜检测、分析其在NIH 3T 3细胞中的表达.结果　成功地从黑色素瘤细胞中克隆了t -PA 基因,并构建了以pEG FP -N3为载体的真核表达质粒载体,并能在真核细胞中表达、分泌t -PA.结论　含t -PA 基因真核表达质粒构建成功.关键词　组织纤溶酶原激活物;　真核表达质粒载体;　基因克隆;　成纤维细胞中图分类号　Q 344.13组织型纤溶酶原激活剂(tissue -type plasminogen activator ,t -PA )是一种丝氨酸蛋白酶,在体内广泛分布于血管内皮细胞、脑、成熟的卵母细胞、输卵管、胰腺等组织[1].它是由527个氨基酸组成的单链丝氨酸蛋白酶,具有选择性地在纤维蛋白表面活化纤溶酶原的性质,除参与机体凝血和纤溶的平衡调控外,还具有高效、特异的溶栓作用,是目前防治血栓性疾病最有效的药物之一[3,4].本研究用逆转录-聚合酶链式反应(Reverse T ranscriptase RT -PCR )技术,成功地从黑色素瘤细胞中克隆了人t -PA cDNA ,构建了含t -PA 基因的pEG FP -N3-t -PA 真核表达重组质粒载体,以期为探讨基因防治、以及转基因动物的研究奠定基础[1,2].1　材料与方法1.1　主要试剂　pEG FP -N3真核表达质粒由本实验室保存,总RNA 提取试剂盒,质粒提取试剂盒,RT -PCR 试剂盒,大肠杆菌菌株E .coli DH5α由天根生化公司提供,限制性内切酶,T 4DNA 连接酶,Ex T aq 酶、pM D18-T 载体由大连宝生生物公司提供;Lipofectamine 2000购于Invitrogen ;黑色素瘤细胞,成纤维细胞系(NIH 3T 3)由本实验室保存.其余试剂为电泳纯或分析纯.1.2　t -PA 基因引物设计　从G enBank 中查找下载人的t -PA 基因序列,由MEG A 4.0分析软件对t -PA 序列进行分析,阅读其框架,选取其具有功能的1060bp 的片段,根据引物设计原则设计一对引物,其5′端引物引入Hind Ⅲ酶切位点,3′端引物引入BamH I 酶切位点,并分别在上、下游引物的5′端引入4个保护碱基.上游引物是:5′-CG AT CG AAG CTT CG ATG T CTT AT C AGGG AAAC AG TG ACTG CT -3′(Hind Ⅲ);下游引物是:5′-C ATG ACGG AT CCCGG T CG C ATG TTG T C ACG-3′(BamH I ).1.3　t -PA 基因cDNA 克隆　依据T rizol 试剂盒说明,从人黑色素瘤细胞中提取总RNA ,按逆转录试剂盒使用说明进行RT -PCR 反应合成cDNA 第一链,然后以其为模板进行PCR 反应.取逆转录产物1μl ,加入5μl 10×Reaction Bu ffer ,4μl dNTP 混合物(2.5mm ol ΠL ),1μl Pyrobest DNA 聚合酶(2U Πμl ),t -PA 上游引物、下游引物各1μl ,加ddH 2O 至总体积50μl.将反应体系置于PCR 仪中,94℃预变性5min ,94℃30s ,56℃45s ,72℃1min ,31个循环后72℃延伸10min.1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,并按回收试剂盒说明对RT -PCR 产物快速纯化回收.1.4　PCR 扩增产物的克隆和鉴定　PCR 产物回收后,在T 4DNA 连接酶的作用下,与pM D18-T 载体连接,16℃水浴4h ,连接产物转化入E .coli DH5α感受态细胞.37℃培养过夜,挑取转化生长的阳性菌落,应用质粒提取试剂盒提取重组质粒,分别用PCR 和双酶切对重组质粒进行鉴定.并送菌种至华大基因科技公司对阳性克隆片段进行双向测序分析.9012008年12月第23卷　第4期山东师范大学学报(自然科学版)Journal of Shandong N ormal University (Natural Science )Dec.2008V ol.23N o.41.5　pEG FP -N3-t -PA 真核表达重组质粒的构建[5]　用Hind Ⅲ和BamH I 双酶切回收的t -PA 片段定向插入用同法酶切的pEG FP -N3载体启动子下游,得到重组质粒pEG FP -N3-t -PA.构建过程见图1.1.6　pEG FP -N3-t -PA 重组质粒的鉴定　用构建的pEG FP -N3-t -PA 重组质粒转化E .coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,扩增,提取并纯化重组质粒DNA ;将重组质粒用双酶切(Hind Ⅲ和BamH I )鉴定.1.7　pEG FP -N3-t -PA 真核表达重组质粒转染成纤维细胞　将NIH 3T 3细胞培养至对数生长期,接种于6孔板,待细胞密度为70%～80%时,用Lipofectamine 2000转染试剂盒进行转染,转染方法按说明书进行.重组质粒量为2μg Π孔.加入转染试剂和质粒后,细胞放置37℃5%C O 2孵育箱孵育4h ,去除转染复合物并加入含10%小牛血清的新鲜培养液,培养24～48h ,荧光显微镜下观察.1.8　RT -PCR 法检测质粒转染成纤维细胞后t -PA 基因的mRNA 表达　收集培养的成纤维细胞(1.5×106个Πm l ),按T rizol 试剂盒说明书提取总RNA ,并以它为模板进行RT -PCR ,扩增t -PA cDNA ,其程序同前.图1　pEG FP -N3-t -PA 构建图图2　人黑色素瘤细胞中t -PA 基因的RT -PCR 产物1.DNA M arker D L2000;2、3、4、5.t -PA 基因RT -PCR 扩增产物.图3　pM D18-T -t -PA 重组质粒的鉴定结果1.重组质粒pM D18-T -t -P A 经PCR 扩增t -P A 基因产物;2.质粒pM D18-T -t -PA ;3.重组pM D18-T -t -PA 经Hind Ⅲ和BamH I 双酶切;4.DNA M ark D L2000plus.2　结果2.1　t -PA 基因片段的扩增　用所设计的引物,对人黑色素瘤细胞中的t -PA 进行RT -PCR 扩增,其扩增的基因片段大约为1.1kb ,其中含酶切位点、起始密码子和终止密码子,结果见图2.2.2　t -PA 基因片段与pM D18-T 质粒连接和重组质粒的鉴定　纯化的PCR 产物经T 4DNA 连接酶与pM D18-T 质粒连接后,转化DH5α,随机挑选出阳性重组子菌落进行扩增培养,用PCR 法扩增出约1.1kb 的t -PA 基因片段;同样用Hind Ⅲ和BamH I 双酶切重组质粒也可分离到1.1kb 的基因片段和开环质粒pM D18-T (2.6kb ).结果见图3.2.3　测序结果及比对分析　将华大公司测序结果与G ene Bank 中的t -PA cDNA 序列进行比对,结果完全一致,见图4.2.4　t -PA 基因片段与pEG FP -N3质粒连接和重组质粒的鉴定　纯化的PCR 产物经T 4DNA 连接酶与pEG FP -N3质粒连接后,转化DH5α,随机挑选出阳性重组子菌落进行扩增培养,用PCR 法扩增出约1.1kb 的t -PA 基因片段;同样用Hind Ⅲ和BamH I 双酶切重组质粒也可分离到1.1kb 的基因片段和开环质粒pEG FP -N3(4.7kb ),结果见图5.2.5　pEG FP -N3-t -PA 质粒转染NIH 3T 3细胞后融合蛋白的表达　采用脂质体法将pEG FP -N3-t -PA 质粒转染NIH 3T 3细胞24h 后,倒置荧光显微镜下观察,见转染后的NIH 3T 3细胞发出的绿色荧光,说明质粒转染NIH 3T 3细胞后有融合蛋白的表达,见图6.2.6　RT -PCR 法检测t -PA 基因转染成纤维细胞后t -PA mRNA 表达水平　经对pEG FP -N3-t -PA 转染的细胞总RNA 进行扩增,结果转染重组质粒组扩增出约1.1kb 左右的cDNA 片段,见图7.11第23卷山东师范大学学报(自然科学版)第4期　图4　DNAstar 将测得序列与G enBank中已知序列E01466比对结果图5　pEG FP -N3-t -PA 重组质粒的鉴定结果1.D N A M ark D L2000plus ;2.重组质粒pEG FP -N3-t -P A 经H indⅢ和BamH I 双酶切后产物;3.质粒pEG FP -N3-t -PA ;4.重组质粒pEG FP -N3-t -P A 经PCR 扩增t -P A 基因产物.图6　pEG FP -N3-t -PA 质粒转染 NIH 3T 3细胞后融合蛋白的表达图7　t -PA 转染NIH 3T 3RT -PCR 结果1.DNA M arker D L2000;2.重组质粒pEG FP -N3-t -PA 转染NIH 3T 3细胞后t -PA 基因RT -PCR 扩增产物;3.重组质粒pEG FP -N3-t -PA 经PCR 扩增t -PA 基因产物;4.未转染质粒的NIH 3T 3细胞t -PA 基因RT -PCR 扩增产物.3　讨论人组织型纤溶酶原激活剂(t -PA )由于对血栓具有较好的特异性亲和作用,溶栓效果好,溶栓后再出血的发生率低,在心肌梗塞症状发作后的短时间内给药效果明显,安全性高已经成为治疗血栓性疾病的首选药[5].但是其半衰期短,需持续用药,费用极为昂贵又使其大规模应用于临床受到了限制,因此将外源性t -PA基因导入体细胞,使之在局部持续分泌出活性较高的基因产物,以防治血栓形成的方法,具有良好的应用前景[6,7].用质粒携带目的基因转染靶细胞可以获得良好的目的基因表达,并且质粒制备简单,成本低,较少产生抗原性,重复使用性好,安全性高,适合临床应用[8].我们选用的真核质粒pEG FP -N3是一种新型真核表达载体,能在大多数哺乳动物细胞内高效表达,该载体除保留有能在多种细胞中促进重组蛋白高表达的人巨细胞病毒(C M V )增强启动子及易于插入外源基因片段的多克隆位点外,还含有EG FP 报告分子,当其和目的基因一起融合表达时,无需加任何底物、荧光性质稳定、对细胞无毒性、使用方便.这为我们后期转基因动物的鉴定及基因表达位置的确定奠定了基础.本研究通过应用基因重组技术,成功构建了pEG FP -N3-t -PA 真核表达载体;将该载体转染NIH 3T 3细胞,荧光显微镜下观察证实该载体在真核细胞内可成功表达t -PA -EG FP 融合蛋白,这为今后血栓相关性疾病的t -PA 基因治疗研究奠定了坚实的基础,也进一步为利用显微注射法制备转基因动物铺平道路.111第4期王　栋,等:pEG FP -N3-t -PA 真核表达质粒的构建及其在成纤维细胞细胞中的表达第23卷　第23卷山东师范大学学报(自然科学版)第4期　4　参考文献[1]　H oylaerts M,Rijken D C,Iijnen H R,et al.K inetics of the activation of plasm inogen by human tissue plasm inogen activator[J].J Biol Chem,1981,(257):2912[2]　张永忠.转基因动物的应用与展望[J].山东师范大学学报(自然科学版),2001,16(1):83～87[3]　C ollen D.On the regulation and control of fibrionlysis[J].Thromb Haem ostasis,1980,43(1):77[4]　Bell L D.Chem ical synthesis,cloning and expression in mammalian cells of a gene coding for human tissue-type plam inogen activator[J].G ene,1998,63(4):155[5]　萨姆布鲁克J,拉塞尔D W.分子克隆实验指南第三版[M].黄培堂等译.北京:科学出版社,2002.45～105[6]　W augh J M,K attash M,Li J.et al.G ene therapy to prom ote thromboresistance:Local overexpression of tissue plasm inogen activator to prevent arterialthrombosis in an in viv o rabbit m odel[J].Proc Natc Acad Sci US A.1999,96(3):1065～1070[7]　张会亮,王建英,等.tPA特性及其利用转基因乳腺生物反应器生产研究进展[J].山东医药,2008,48(1):143～144[8]　庄文忠.动植物生物技术的交叉渗透及展望[J].山东师范大学学报(自然科学版),2002,17(1):79～80CLONING OF THE t-PA GENE AN D CONSTRUCTION OFpEGFP-N3-t-PA EXPRESSION VECTORWang D ong He Chengqiang Y ang G uiwen Li G uorong(C ollege of Life Science,K ey Laboratory for Animal Anti-S tress,Shangdong N ormal University,250014,Jinan,China)Abstract　Objective T o construct a recombinant eukary otic expressing vector pEG FP-N3-t-PA including functional region of human tissue-type plasminogen activator(t-PA)gene to provide a basis for further study on the research of transgenic animals.Methods The t-PA cDNA was obtained from melanoma cell with RT-PCR and inserted into the Hind III and BamH I site of the plasmid pEG FP-N3,then,pEG FP-N3-t-PA was trans fected into NIH 3T3mediated by Lipfectin2000T M.The recombinant plasmid was proved success ful by restriction enzyme digestion and DNA sequencing.The expression of the chimeric protein was con firmed by fluorescent microscope and the t-PA expression level was tested by RT-PCR.The t-PA gene was cloned and the pEG FP-N3-t-PA vector was constructed.The t-PA expression in the eukary otic cell could be detected in the group with trans fected t-PA gene.The recombinant eukary otic expression plasmid is success fully constructed.K ey w ords　T issue-type plasminogen activator;　Eukary otic expression plasmid;　gene cloning;　NIH3T3 211。

真核表达载体pIRES2—AcGFP1—Ascl2的构建及表达

真核表达载体pIRES2—AcGFP1—Ascl2的构建及表达作者：陈彦霞刘津麟李涯松来源：《中国现代医生》2014年第21期[摘要] 目的构建真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Ascl2，并在真核细胞HEK293T细胞中表达，为今后研究Ascl2基因在Tfh细胞的相关分子机制奠定实验基础。

方法 PCR方法扩增健康人外周血单个核细胞中Ascl2基因，连接至pIRES2-AcGFP1质粒的多克隆位点中，构建pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒。

通过脂质体转染法对HEK293T细胞进行转染。

Realtime-PCR及Westernblot方法分析转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒的HEK293T细胞中Ascl2表达情况。

结果经Realtime-PCR及Westernblot方法，证实Ascl2基因能够在HEK293T细胞中正确表达。

结论成功建立表达Ascl2基因的pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒，并能在HEK293T细胞中表达，为进一步研究Ascl2在自身免疫性疾病中Tfh细胞的相关机制奠定了实验基础。

[关键词] Ascl2；HEK293T细胞；Tfh细胞；自身免疫性疾病[中图分类号] R73-3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）21-0005-03滤泡辅助性T淋巴细胞（T follicular helper，Tfh）是近年研究发现的CD4+T细胞的新亚群[1]。

它的特征性标志为CXCR5+、PD-1+、ICOS+、CCR7-、Bcl-6+。

Tfh细胞在机体的生发中心形成和B细胞分化中起重要作用，在对维持机体的免疫平衡发挥重要作用，它的功能失调与自身免疫性疾病及免疫缺陷病中扮演重要角色[2-4]。

新近研究发现一种bHLH（basic Helix-Loop-Helix，碱性螺旋-环-螺旋）转录因子：Ascl2（achaete-scute homologue 2）在Tfh细胞中选择性的表达上调[5]。

小鼠Atrogin-1基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

小鼠Atrogin-1基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达袁磊;吴国豪;张波【期刊名称】《中国临床医学》【年(卷),期】2009(016)005【摘要】目的:构建小鼠Atrogin-1基因真核表达载体,研究其功能,并探讨其在癌性恶液质骨骼肌萎缩中的作用机制.方法:提取小鼠C2C12细胞RNA,反转成cDNA,PCR合成含有酶切位点的Atrogin-1 cDNA全长,酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1, 构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1, 经鉴定及测序证实cDNA片段大小和序列正确,然后用其转染293T细胞,Western blot法检测Atrogin-1蛋白的表达.结果:pcDNA 3.1-Atrogin-1含大小、序列正确的Atrogin-1cDNA片段,转染pcDNA3.1-Atrogin-1的293T细胞裂解液中能检测到Atrogin-1蛋白高表达.结论:成功构建了Atrogin-1基因真核表达载体pcDNA 3.1-Atrogin-1,并在真核细胞中表达了目的蛋白,其是研究癌性恶液质的重要工具.【总页数】3页(P662-664)【作者】袁磊;吴国豪;张波【作者单位】复旦大学附属中山医院普外科,上海,200032;复旦大学附属中山医院普外科,上海,200032;复旦大学附属中山医院普外科,上海,200032【正文语种】中文【中图分类】Q782【相关文献】1.小鼠Ras激酶抑制剂(KSR)基因氨基端和羧基端真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达 [J], 杨雪琴;周清华;朱文;朱大兴;马力;李昌林;王艳萍;陈小禾;马家宝2.EGFP-CIDE-3及DsRed 1-CIDE-3融合基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达和定位 [J], 谷雨;李青;叶菁;李烦繁;闵婕;张丽英;马钰;李航;刘芳3.大鼠NeuroD2基因的克隆、真核表达载体的构建及其在小鼠MSCs细胞中的表达 [J], 姬菩忠;赵兴绪;秦文;宋学文;张勇;赵红斌4.柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2基因真核表达载体的构建及在293T细胞中表达 [J], 王晔;姜连连;韩红玉;薛璞;赵其平;董辉;朱顺海;舒凡帆;黄兵5.鸡MHCⅠα和β2 m链基因真核表达载体的构建及其在293T 细胞中的表达 [J], 戴银;胡晓苗;赵瑞宏;侯宏艳;沈学怀;潘孝成;周学利;张丹俊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人PSF真核表达载体构建及其在CHO细胞中的表达

第２９卷第３期２１０２年６月
贵州大学学报（自然科学版）ＪｕｎｌｆｕｈｕＵｉｒｔＮｔｒｌｃｎｅ）ｏｒａｏｉｏｎｅｓｙ（ａａＳｉｃｓＧｚｖｉｕｅ
Ｖｏ．２．３１９Ｎｏ
Ｊｎ０２ｕ．２１
ｍｉｉｅｒｃｎｄｎｐｏｅｎ・ｓｏｉｔｄｐｉｉｇａ・ｄｎｔａｔｂｉｉｇｒｔｉ－ｓｃａｅｓｌｃｎｆｃ－ａ
公司，鼠二抗购自ＫＬ公司，Ｃ抗ＰＥＬ曝光底物购自
碧云天公司，曝光底片（ｕｉｌ，ＡＩ自ＳｇＦｊｆｍ）ＤＰ购ｉｉ— ｍａ公司。１２引物设计．
Ｔ４连接酶，限制性内切酶ＨｎｌｉｄＩＩ和Ｘａ，ｘａｂＩＥＴｑ
火１ｍｎ７ｉ，２℃延伸２ｍｉ，５个循环后７ｎ３２℃延伸
ＤＡ聚合酶，ｒｏ试剂盒均购自ＴＫＲｉｅＮＴｉｌｚａａａＢｏｃｔ
ｔ，ＰＦ，子量１０ｋａ与多嘧啶序列（ｏ — ｏＳ）分ｒ０Ｄ，Ｐｌｙ
ｐｒｉｉｅｔｃｂｎｉｇｐｏｅ，ＦＢ）合成为剪ｙｉｄｎａｔｉｄｎｒｔｎＦ结ｍｒｉ接复合体＿，与前体ｍＮ的剪接加工＿。１参］ＲＡ２］
摘
要：目的是构建人ＰＦ基因真核表达载体ｐＧＰＮＳ并在检测其在ＣＯ细胞株中的表ＳＥＦ —１ＰＦ，Ｈ
达情况。应用ＤＡ重组技术和ＰＲ方法从人宫颈癌Ｈｌ胞中扩增ＰＦ基因，入ｐＧＰＮＣｅａ细Ｓ插ＥＦ—

FXR1真核表达载体的构建及鉴定

ｄｓｇｓＣｏｎｃｕｉｎＴｈｏｓｒｃｉｎｏｅａｙｔｃｅｒｓｉｎｖｃｏＣＭＶ — ＨＡ／ＦＲ１ｗｌａｏｄｔｏｏｄｎｉ－ｅｉｎ．ｌｓｏｅｃｎｔｕｔｏｆｕｋｒｏｉｘｐｅｓｏｅｔｒｐＸｌｌｙａｆｕａｉｎｆｒｉｅｔｆｉ
ＭＶ—Ｈ／Ｘ１真核表达载体。结论ＡＦＲ
ｐＭＶ—Ｈ／Ｘ１真核表达载体的构建为进一步在细胞内鉴定ＦＲ１ＣＡＦＲＸ
互作蛋白奠定了基础，从而对研究ＦＲ在脆性ｘ综合征中的作用机理具有深远意义。Ｘ１
关键词：脆性ｘ综合征；Ｆ１因；免疫共沉淀ＸＲ基
白奠定基础。方法以ｐＥＴｐ一ＦＲＹＳｒ３Ｘ１为模板进行聚合酶链反应（Ｃ特异扩增ＦＲＰＲ）Ｘ１基因片断，扩增片将
段经Ｅｏ和Ｘｏ双酶切后克隆到ｐＭＶ—ＨＡ载体，ｃＲＩｈＩＣ酶切鉴定阳性克隆并测序鉴定。结果成功构建了ｐ．Ｃ
ｎｎｔｐａｍｉｆｐａｌｓｄｏＣＭＶ — ＨＡ／ＦＸＲ１ｗａｓｖｒｆｅｙｅｚｍｅｄｇｓｉｎａｄｓｑｅｅａｌｓｓｅｉｄｂｎｙｉｅｔｏｎｅｕｎｃｎａｙｉ．ｉＲｅｕｔＴｈｏｔｕｔｏｓｌｓｅｃｎｓｒｃｉｎ
基础研究・
ＦＲ真核表达载体的构建及鉴定Ｘ１
杨阳，马云。符向辉。何淑雅
（南华大学生物化学与分子生物学教研室，湖南衡阳４１０）２０１

Pin1基因真核表达载体的构建及在宫颈癌HeLa细胞中的表达

ｆｏＨｅｅｌｒｍＬａｃｌｓｂｙＲＴ— ＰＣＲ。ｔｎｌｇａｅｔｈｅｉｔｄｗｉｈｐＥＧＦＰ— ｏｆｍｅｏｂｉｎａｍｉＣ１ｔｏｒｒｃｍｎａｔｐｌｓｄｐＥＧＦＰ— ｎ１ａｒｎｓｅｔｄｉｏＨｅＬａＰｉｎｄｔａｆｃｅｎｔ
宫颈癌Ｈｅａ细胞，Ｌ在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达，疫印迹法证实存在ＧＰＰｎ免Ｆ－ｉｌ蛋白高表达；Ｇ４８经１筛选获得单细胞克隆。结论重组质粒ｐＧＦ－ｉｌ体外转染Ｈｅａ胞后，的基因能够在细胞内有效表达，测方ＥＰＰｎＬ细目检法简便可靠，为利用转染该目的基因的细胞进行下一步研究提供了实验基础。
Ｈｅａ细胞中的表达。方法Ｌ
入增强绿色荧光蛋白表达质粒ｐＧＰＣ，质体法转染Ｈｅａ细胞，光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达，疫印ＥＦ－１脂Ｌ荧免
迹法检测ＧＰＰｎＦ — ｉｌ蛋白的表达。结果Ｒ — ＣＴＰＲ扩增出人Ｐｎ基因；ｉｌ构建ｐＧＰＣ一ｉｌ组质粒，外成功转染入ＥＦ — １Ｐｎ重体
摘要目的
构建一种含人肽基脯氨酰顺反异构酶Ｐｎｉｌ的质粒，以绿色荧光蛋白作为报告基因，察其在宫颈癌观
从人宫颈癌Ｈｅａ胞中，Ｒ — ＣＬ细以ＴＰＲ方法扩增出人Ｐｎ基因全长ｃＮＡ序列（Ｄ）插ｉｌＤＣＳ，

人血管生成素1真核表达载体的构建

中国医疗前沿China Healthcare InnovationM ay ,2008Vo l ,3No.102008年05月第3卷第10期作者简介唐莹(),女,助教,辽宁中医药大学解剖教研室。

血管生成素1(angiogenin-1,ang-1),是目前已知的调节新生血管形成和血管渗透的一种重要的因子,它不仅与血管的生成与重塑密切相关,还与淋巴管的调控有关,在一些疾病的发生与发展中起到重要的作用。

因此,构建Anng-1的真核表达载体,可以为进一步研究Ang-1的作用提供基因研究的基础。

1材料与方法1.1材料Xho I 、BamH I 、T RIZOL 总RNA 提取试剂、RT-PCR 试剂盒、琼脂糖、质粒纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒均购自Promega 公司。

天然绿色荧光真核表达载体pEGFP 购自Clonetech 公司。

T4DNA 连接酶、电泳MARK ER 购自大连宝生物公司。

pGEM-T 载体购自上海闪晶。

大肠杆菌DH5α由本实验室保存。

其余生化试剂购自华美生物工程公司。

1.2方法1.2.1胎盘组织总RNA 的提取取正常新鲜胚盘组织,加入TRIZOL 总RNA 提取试剂,提取总RNA 。

用适量无RNase 水溶解RNA,260nm/280nm 比色定量,鉴定纯度。

甲醛变性胶电泳鉴定RNA 完整性。

1.2.2逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)用Pr omega RT-RNA PCR 试剂盒进行RT-PCR 逆转录特异扩增人Ang-1CDNA 。

人血管生成素-1(Ang-1)上游引物P1CCGCTCGAG CGATGA CAGTT TTCCTTTCCTTTGC 1ul,下游引物P2CGGGA TCCTCAAAAATCTAAAGGTCGAATCAT 1ul,混匀后,进行PCR 反应。

PCR 反应条件:94℃2min 1cycle-94℃1min-55℃1min 35cycles-72℃2.5min-72℃10min 1cycle 。

pEGFP-N1-PP1α真核表达载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达

安徽医科大学学报
ＡｔＵｉｒｔｉＭｅｉｎｌｎｕ００Ｆｂ４（）ｃｎｅｉｔｄｃａｉＡｈｉａｖｓａｓｉｓ２１ｅ；５１
・１７・
ｐＧＰＮ一Ｐｏ真核表达载体的构建ＥＦ — １Ｐｌ￣及其在骨肉瘤细胞中的表达
（反应体系为２ｌ总ＲＡ１ｇ１Ｒｘｌ０：Ｎ、０ＸＴＭｉ２ｔ、ｘＭｇ１４＊、ＮＰ混合液２ｔ、ｌｏｄ１ｘ、ＭＶＣ２ｔｄＴ１ｌＯｉ —Ｔ５１ＩＡｘｇｌ
反转录酶０６ｔ，ＲＡｉ糖核酸酶抑制剂０５．＊ｌＮｓｎ核．ｔ、Ｎｓ．ｅ补足至２１，ＣｘＲａｅｆｅ水ｌｒ０）ＰＲ扩增Ｐ１引Ｐ
常规试剂均为进口分装或国产分析纯。
１２实验方法．
中图０００ — ０７—０４２２１）１０１４
蛋白磷酸酶与蛋白激酶通过蛋白质的可逆磷酸化过程共同参与调节大多数细胞功能及信号转导途径，而在细胞的生长和凋亡中发挥极为重要的作从
能具有高度的一致性，其中Ｐ１这Ｐ仪是其发挥活性作用的主要部分。目前对于Ｐ１功能研究较多，Ｐ
Ｉｏ试剂（于Ｉｖｔｇｎ公司）明书提取细胞总ｚｌ购ｎｉｏｅｒ说ＲＡ，按Ｐｏｅａ反转录试剂盒说明书合成ｃＮＮｒｍｇＤＡ
崔
摘要目的

Apoptin原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

第29卷第5期2008年10月西安交通大学学报(医学版)Jo ur nal of X i an Jiao to ng U niv ersity (M edical Scie nce s)V ol.29N o.5O ct.2008Apoptin 原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达王健生1,张明鑫1,段小艺2,王峥4,周苏娜1,张广健3,王全颖5,杨广笑5(1.西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤外科;2.西安交通大学医学院第一附属医院核医学科;3.西安交通大学医学院第一附属医院胸外科,陕西西安 710061;4.四川大学华西医院,四川成都 610041;5.西安华广生物工程公司,陕西西安 710025)摘要:目的构建A poptin 的原核表达载体,并制备抗原物质A poptin 融合蛋白。

方法在获得A poptin 融合基因的基础上,成功构建了Apo ptin 的高效原核表达载体pET 28a(+) A po ptin,将该质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)受体菌中,以IPT G 对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。

结果转化有Apoptin 的原核表达载体pET 28a(+) Apoptin 的大肠杆菌E.coli BL 21(DE3)经IP T G 诱导后,经SDS P AG E 分析,在相对分子质量约17000的位置出现目的蛋白条带,大小与A po ptin 融合蛋白一致。

结论 Apo ptin 原核表达载体pET 28a (+) Apoptin 能够表达出A po ptin 融合蛋白,为进一步的Apoptin 研究和制备Apoptin 抗体奠定了基础。

关键词:A poptin;原核表达载体;pET 28a(+);大肠杆菌中图分类号:Q 786 文献标识码:A 文章编号:1671 8259(2008)05 0496 03Constru ction of a prokaryotic expression vector forApoptin and expression in E.coliWang Jiansheng 1,Zhang M ingx in 1,Duan Xiaoyi 2,Wang Zheng 4,Zhou Suna 1,Zhang Guangjian 3,Wang Quanying 5,Yang Guangx iao 5(1.Department of Oncolog y Surg er y;2.Department of Nuclear M edicine;3.Departm ent of T horacic Surgery,the First Affiliated H ospital,M edical School of Xi an Jiao to ng U niversity,Xi an 710061; 4.West China H o spital,Sichuan U niversity,Chengdu 610041; 5.Xi an H uag uang Bioengineering Com pany,Xi an 710025,China)ABSTRAC T:Objective T o c onstr uct an Apo ptin pr o kar yo tic vec tor ,aiming to pr o duce antig enic fusio n pr o teinApo ptin.Methods The Apo ptin gene w as amplified fr o m the te mplate o f plasmid pSSC HG /N T 4A poptin HA 2 TA T by PCR.T he A po ptin w as sub cloned into the m ultiple c lo ne sites o f plasmid pET 28a (+)to g et the pr o kary ot ic ve ctor o f pET 28a (+) Apo ptin,which w as tr ansf o rmed into E.coli BL21(D E3).Ex pr essio n o f E.co li BL 21(D E3)was induced by IP TG.T he specific pr ote in expr ession wa s detec ted by SD S PAG E.Results T hefusio n pr ote in w as ex pr esse d with high ef fic iency in E.coli BL21(DE3)tra nsfo rm ed by pET 28a (+) Apo ptin afte r induction w ith I PT G.T he specific f usio n pr ote in had an appar ent r elated molecular weight o f about 17000ku as indicate d by SD A PAG E analysis.Conclusion T he Apo ptin pro kar yo tic ex pressio n vecto r with pET 28a (+)Apo ptin can ef fect ive ly e xpre ss Apo ptin fusion pr o tein,lay ing a f o undatio n fo r f ur ther study o f A poptin and pr epar ation o f a nt ibodies ag ainst A po pt in.KEY WORDS:Apo pt in;pr okar y otic expr essio n v ecto r;pET 28a (+); E.co li 收稿日期:2008 04 16 修回日期:2008 06 30基金项目:教育部博士点专项科研基金赞助项目(No.20060698055)作者简介:王健生(1970 ),男(汉族),教授,博士生导师.主要从事肿瘤临床与基础研究.E m ail:w an gjsh@mail.x 目的基因或载体对正常组织的毒性和肿瘤细胞对治疗的耐受等是限制肿瘤基因治疗临床应用的瓶颈。

PAP蛋白重组表达载体的构建及在原核和真核细胞中的表达

ＰＡＰ的内化，提高其抗病毒效果。

由于编码ＰＴＤ的１０个氨基酸的核苷酸序列仅为３０ｂｐ，本实验采用在引物中直接引入该编码序列的方法实现ＰＴＤ与ＰＡＰ的基因重组。

同时引入在两个引物（Ｐ１和ＩＣ。

２）中分别构建原核大肠杆菌表达中所需的ＢａｍＨＩ和ＰｓｔＩ酶切位点。

具体步骤详见图１。

ＰＴＤ－ｐｒｉｍｅ吖ＣＧ曼昼盘里￡９＿岫ＨＤＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＴＧＡＡＴＣＣＡＡＴｅＡＴＣＴＡＣＡＡＴＧ）ＰＴｎＰＡＰ图１．ＰＴＤ－ＰＡＰ的合成模式图通过ＰＣＲ扩增，用ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ加Ａ后电泳得到了约８００ｂｐ的扩增片段。

回收后的片段与ｐＰＧＥＭ－ＴＶｅｃｔｏｒ连接。

转入大肠杆菌ＤＨ５Ｑ中，经蓝白筛选，选取白色菌落行ＰＣＲ鉴定见可扩增出约８００ｂｐ的片段；提取ＰＣＲ阳性菌株的质粒，经ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ双酶切，电泳示可约８００ｂｐ和３Ｋｂ处两条条带（见图２）。

株的质粒，经ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ双酶切，电泳示可约１Ｋｂ和３Ｋｂ处两条条带（图４）。

图４ｐＰＧＥＭ—ＴＶｅｃｔｏｒ／ＴＡＴ－ＰＡＰ重组体酶切图示：１．分子量标准为ＢＬ２０００：２．酶切片段。

图中可见酶切下略大于１Ｋｂ片段，相当于Ｔａｔ加上ＰＡＰ序列的大小，支持二者重组成功。

将酶切鉴定阳性菌株质粒测序示ｒＩ钒序列和ＰＡＰ序列正确连入ｐＰＧＥＭ．ＴＶｅｃｔｏｒ中。

１．３．２Ｔａｔ与ＰＡＰ的基因重组体中Ｔａｔ显性负突变体的构建前期的工作共获得的ＨＩＶ的Ｔａｔ显性负突变体共六个：ｐＭｌ：Ｃｙｓ２２＋Ｇｌｙ；ｐＭ２：Ｈｉｓ３３／Ｃｙｓ３４一Ａｌａ／Ｓｅｒ；ｐＭ３：Ｔｈｒ４０／Ｌｙｓ４１一Ａｌ矶～ｌａ；ｐＭ４：Ｌｙｓ５０一ＳＴＯＰ；ｐＭ５：Ａｒ９５２一Ｌｅｕ；ｐＭ６：Ｔｈｒ４０／Ｌｙｓ４１／Ｃｙｓ５０一Ａｌａ／Ａｌａ／ＳＴＯＰ。

之后验证了突变Ｔａｔ对ＨＩＶ－１Ｔａｔ活性的影响：结果说明不同Ｔａｔ突变蛋白都对正常Ｔａｔ有一定程度的抑制作用，其中以ｐＭ５最大，达８５％，另外ｐＭ３可达４０％。

重组人sCR1真核表达载体的构建表达及其生物学活性

重组人sCR1真核表达载体的构建、表达及其生物学活性【摘要】目的: 采纳酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体（sCR1）, 研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性。

方式: 从人外周血中提取总RNA, 应用RT PCR取得人sCR1全长cDNA, 然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中, 构建含人sCR1的重组质粒（pPIC9k sCR1）, 经测序鉴定正确, 电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中, 将经G418抗性挑选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定, 经甲醇诱导, 表达产物经SDS PAGE分析和Western blot鉴定, 通过Ni2+NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定。

结果: 取得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k sCR1, 经G418挑选及PCR鉴定取得高拷贝整合的重组酵母细胞株, 经甲醇诱导含pPIC9k sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。

此蛋白在SDS PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带, 在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体（mAb）识别。

经Ni2+NTA agarose亲和层析纯化后取得较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性。

结论: 人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达, 而且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。

【关键词】可溶性补体受体1 毕赤酵母细胞生物学活性真核表达载体补体受体1（complement receptor type l, CR1）又称C3b/C4b 受体, 在人白细胞表面被命名为CD35分子, 是最先定型的补体受体, 也是目前所知最重要的一种补体受体。

Weisman等[1]于1990年第一次研制出缺乏跨膜区和胞内区的可溶性补体受体1（soluble complement receptor type l, sCR1）是CR1细胞外片段。

人促红细胞生成素基因和AcGFP1共表达真核表达载体的构建及鉴定

与 T 载体连接，选择正确的重组子经 R 玉和 H 玉双
酶切后亚克隆入 pIRES2
，并与人工合成的外显子 1
序列相连，构建 phEPOIRES2
荧光真核表达载体
(图 1)。重组质粒经 PCR 扩增及玉 / H 玉双酶切进
鉴定，可获得 5 300 和 1 598 bp 的 DNA 片段（图 2）。
Fig.6.Expression of phEPOIRES2
CHO（A)
and goat fibroblasts（B)
GFP 在减少转基因胚胎移植的盲目性，提高转基因动物
生产的效率等方面存在着巨大的潜力（林爱星等，1997）。本
研究成功构建了phEPOIRES2
表达载体，通过优化
转染条件，观察到
human erythropoietin gene; pIRES2
; CHO; goat fibroblast
人促红细胞生成素(human erythropoietin，hEPO)是一种
3EP：5'CGGGATCC TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG3'；
由肾脏分泌的酸性糖蛋白激素。它是一种红细胞造血刺激因
图 4.不同 DNA 浓度的转染效率 FIg.4.Transfection efficiency of different DNA concentration
图 5.不同转染时间的转染效率 Fig.5.Transfection efficiency of
different transfection times
基因的表达，证实构建是成功的，
从而为在细胞水平上确定转基因阳性细胞作为核供体，开展
表达
的转基因山羊研究提供了基础资料。

人Dcp1a基因真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的定位

人Dcp1a基因真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的定位赵雷;王申森;黄映辉;张丽娜【期刊名称】《生命科学研究》【年(卷),期】2018(22)1【摘要】人脱帽酶Dcp1a (human mRNA decapping enzyme 1a)是mRNA降解过程中的重要成员之一,构建其真核表达载体,并对其表达和细胞内定位进行分析,可为进一步研究Dcp1a的功能提供基础.本研究以HeLa cDNA文库为模板,采用PCR方法扩增Dcp1a cDNA全长序列并克隆到pmCherry-N1载体.转化大肠杆菌DH5α后,挑取阳性克隆提取质粒,分别进行Xho Ⅰ/Sal Ⅰ双酶切及测序鉴定.将重组质粒用VigoFect转染试剂转染HeLa细胞,随后用RT-PCR和Western-blot 检测Dcp1a在HeLa细胞中的表达,并采用激光共聚焦显微镜观察Dcp1a的亚细胞定位情况.通过DNA测序分析证实目的基因Dcp1a的序列完全正确,人Dcp1a 基因真核表达载体pmCherry-N 1-Dcp1a构建成功,并在HeLa细胞中获得表达;激光共聚焦显微镜观察显示Dcp1a蛋白定位在细胞质中,而且HeLa细胞中过表达Dcp1a在胞质中明显形成了P小体(processing body,P-body).实验结果为进一步探讨该基因的功能及其与P小体的相关性奠定了基础.%Human mRNA decapping enzyme 1a (Dcp1a) is one of the important members of mRNA decay.Construction of its eukaryotic expression vector and analysis of its expression and cellular localization can provide a basis for further study of the function of Dcp1a.In this study,HeLa cDNA library was used as the template resource.The full-length cDNA sequence of Dcp1a was amplifiedby PCR method and subcloned into pmCherry-N1 vector.After transformation into E.coli DH5α,the positive clones were picked for plasmid extraction and identification by Xho Ⅰ/Sal Ⅰ double digestion and sequencing analysis.Then the recombinant plasmid was transfected into HeLa cells with VigoFect transfection reagent,and the expression of Dcp1a in HeLa cells was detected by RT-PCR and Western-blot.The cellular localization of Dcp1a was observed by confocal microscopy.The results demonstrated that the sequence of Dcp 1a gene was completely correct.The eukaryotic expression vector pmCherry-N1-Dcp1a was successfully constructed and Dcp 1a was overexpressed in HeLa cells.The confocal results showed that Dcp1a was localized in the cytoplasm and its overexpression in HeLa cells significantly induced the formation of processing bodies (P-bodies).These results lay the foundation for further study on the functions of Dcp1a and its correlation with P-bodies.【总页数】8页(P19-25,50)【作者】赵雷;王申森;黄映辉;张丽娜【作者单位】北京工业大学生命科学与生物工程学院,中国北京100124;北京工业大学生命科学与生物工程学院,中国北京100124;北京工业大学生命科学与生物工程学院,中国北京100124;北京工业大学生命科学与生物工程学院,中国北京100124【正文语种】中文【中图分类】Q7【相关文献】1.HIV-1整合酶真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达和定位 [J], 谷万港;张丽;张旋2.HIV-1整合酶真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达和定位 [J], 谷万港;张丽;张旋;3.IKCa1基因shRNA真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达 [J], 聂丹;刘玲;詹平;汪春燕;毛熙光;任黔川4.RIG-I蛋白2CARD结构域真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达定位[J], 张丽丽;程丽鑫;张华;曹宏伟;杨琦;闫江翠;张雅婷;陈宁;丁筠;邹德华;李兴志;郑亮5.人OAZ-ORF2基因真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达 [J], 姜立;马文丽;柯杰兵;彭翼飞;李晋;徐兵;郑文岭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

S1P1真核表达载体的构建及在HEK293细胞膜上的表达

S1P1真核表达载体的构建及在HEK293细胞膜上的表达胡为民;杨健;唐恩洁;敬保迁;任碧轩【期刊名称】《川北医学院学报》【年(卷),期】2008(23)1【摘要】目的构建含人I型1-磷酸鞘氨醇受体(SIPI)-全长cDNA序列及HA和/或EGFP标签的真核表达载体,并观察其在HEK293细胞上的表达.方法合成2条HA寡核苷酸,克隆人S1P1-Myc-EGFP-N1载体.以HA-S1P1-Myc-EGFP-N1为模板,用PCR的方法扩增HA-S1P1并克隆人pcDNA3.1(+)载体.限制性酶切消化、PCR、测序的方法鉴定,载体经Polyfect转染入HEK293细胞.G418筛选出稳定细胞株.用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测S1P1在HEK293细胞上的表达.结果限制性酶切消化、PCR、测序结果证实载体构建成功.S1P1表达在HEK293稳定细胞株的表面.结论成功构建带有HA和/或EGFP标签的S1P1真核表达载体,表面表达S1P1的HEK293稳定细胞株可作为我们进一步研究的细胞模型.【总页数】4页(P22-25)【作者】胡为民;杨健;唐恩洁;敬保迁;任碧轩【作者单位】川北医学院基础医学院微生物与免疫学教研室;川北医学院免疫学与分子生物学研究所,四川,南充,637007;川北医学院基础医学院微生物与免疫学教研室;川北医学院基础医学院微生物与免疫学教研室;川北医学院免疫学与分子生物学研究所,四川,南充,637007;川北医学院免疫学与分子生物学研究所,四川,南充,637007;川北医学院免疫学与分子生物学研究所,四川,南充,637007【正文语种】中文【中图分类】R392.1【相关文献】1.SK2和 JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在 HEK293细胞中的表达 [J], 罗天霞;樊红琨;芮丹丹;孙佳翕;马小芳;章茜2.人STAT4基因真核表达载体构建和在HEK293细胞中表达 [J], 李轩岸;黄玉梅;姚芳玲;范洁琳;雷光华;黎明3.牛乳状瘤病毒13型pEGFP-E5-N1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 [J], 庞峰;史巧芸;朱华培;徐开莲;赵天靖;李亚颖;彭冬梅;李国华;周海龙4.水牛髓样分化因子88融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 [J], 匡文华;王凤阳;张晓茹;成鹰;杜丽;雷明;焦寒伟;张冬琳;郝永昌;祁超5.pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的表达 [J], 徐婧;侯赋园;王德彬;李竣;胡鑫;杨光忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

潜伏膜蛋白1基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达

潜伏膜蛋白1基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达刘晓佳;谭宁;田晶;曾思恩【期刊名称】《蚌埠医学院学报》【年(卷),期】2014(39)5【摘要】Objective:To construct a eukaryotic expression vector containing latent membrane protein 1 ( LMP1 ) and to detect its expression in human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells. Methods:The cDNA segment encoding LMP1 from human nasopharyngeal carcinoma cell line C15 was acquired and cloned into a eukaryote expression vector pEGFP-C1 after double digestion. The recombinant vector was identified by restriction enzyme analysis and nucleotide sequence determination. The eukaryotic expression plasmid pEGFP-C1-LMP1 was transiently transfected into CNE2 cells. The location and expression of LMP1 was detected by laser scanning confocal microscope. Results:Digested with SalⅠand BglⅡ,the recombinant vector was examined by agarose gel electrophoresis,and the result was in accordance with the anticipated objective strap size. The LMP1 was correctly inserted into pEGFP-C1;the sequencing results were identical with those reported in GenBank. GFP-LMP1 could be detected in both cell membrane and cytoplasm of CNE2. Conclusions:Recombinant plasmid pEGFP-C1-LMP1 is constructed successfully in vitro,which can also express in the cytoplasm of CNE2 in human nasopharyngeal carcinoma.%目的：构建真核细胞中表达潜伏膜蛋白1(LMP1)基因的增强荧光表达载体,观察其在鼻咽癌细胞中的表达。

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达刘娟;孙永涛;李光玉;刘秋平;翟嵩;王福祥【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2004(29)10【摘要】目的构建人中性粒细胞多肽1(HNP1)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础.方法从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNP1基因cDNA片段,将纯化PCR产物与 pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO中.用脂质体转染COS-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达.结果从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达.结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO/HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础.【总页数】3页(P894-896)【作者】刘娟;孙永涛;李光玉;刘秋平;翟嵩;王福祥【作者单位】710038,西安,第四军医大学唐都医院;710038,西安,第四军医大学唐都医院;710038,西安,第四军医大学唐都医院;710038,西安,第四军医大学唐都医院;710038,西安,第四军医大学唐都医院;710038,西安,第四军医大学唐都医院【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白真核表达载体的构建和鉴定 [J], 何莹;罗阳;王英翔;陈安;胡川闽2.人源多肽抗生素LL-37真核表达载体的构建 [J], 陆建荣;王惠民;凌勇武;黄松平;常秋月3.天然内生抗菌多肽elafin真核表达载体的构建及在真核细胞的表达 [J], 杨捷;周向东4.多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2真核表达载体的构建及在SHG-44细胞的表达[J], 金美芳;潘浩;郭向红;仇灏;吴士良5.人中性粒细胞多肽1,3真核表达载体的构建与鉴定 [J], 刘娟;孙永涛;杜德伟;李光玉;刘秋平;翟嵩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。