真核细胞常见表达载体
真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控(精)
真核细胞常见表达载体1. pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统摘要 : 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。
并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。
随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。
该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。
其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。
但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是：①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制;②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及;③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。
原核&真核表达载体构建
原核、真核表达载体构建真核表达载体和原核表达载体的区别：主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。
比如说启动子，终止子在两种表达系统中是不一样的。
带有真核表达元件的是真核载体，能在真核生物内表达；带有原核表达元件的是原核载体，能在原核生物内表达。
两者都具有的为穿梭载体。
㈠原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。
原核表达载体调控原件1.启动子启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。
没有启动子，基因就不能转录。
由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。
原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。
在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。
来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。
在距转录起始位点上游35 bp 处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。
转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。
-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA 链。
原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。
2. SD序列1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统摘要: 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。
并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。
随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。
该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。
其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。
但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是：①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制;②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及;③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。
真核载体构建
42℃、90sec
不含抗生素的培养基热休克 得到细菌的克隆
37℃ 涂布选择性平板 30-60min （合适抗生素） （使质粒扩增）
37℃ 10hr
2.感染（infection）：也称转导（transduction） 由噬菌体或病毒介导外源DNA进入宿主细胞的过程 有一个：体外包装过程
lDNA ®E-coli 动、植物病毒DNA ®动植物细胞
PCR扩增
vDNA polymerase 高保真酶 primerstar probest Phusion vRich GC sequence primerstar with GC buffer v热启动PCR，Nest PCR
载体构建步骤
v Get the target DNA sequence v Select appropriate vector v PCR primer design v Obtain cell or tissue v PCR amplification v Restriction, ligation and transformation
克隆载体→表达载体
A A
双 酶 切
表达载体
限制性内切酶
连接
v PCR product:vector 1：10~ 10:1（1：3 ~ 3：1）摩尔比 v At 25 °C for 23 hours or at 16 °C overnight v Inactive T4 DNA ligase (at 70 °C for 10min )
2. 缺点：①高水平表达基因产物易沉淀、凝集、不易折叠 ②基因产物纯化工艺复杂 ③基因产物易受污染（内毒素） ④基因产物对受体菌有毒害作用 ⑤基因产物易被水解 ⑥从安全角度——并不理想 ⑦缺乏基因产物表达后加工机制
真核表达载体
真核细胞常见表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
基因工程中常用载体及其主要特点
基因工程中常用载体及其主要特点基因工程这一话题，听起来就像科幻小说里的情节，其实离我们并不遥远。
今天咱们就聊聊基因工程中的一些常用载体，简单明了，让你听得懂，明白得了！准备好了吗？那就跟我一起走进这奇妙的基因世界吧！1. 什么是载体？首先，得先搞清楚，什么是载体。
简单来说，载体就是那些能“背负”外来基因的“快递小哥”。
它们把我们想要的基因装上，然后送到目标细胞里。
这就像是你点了一份外卖，外卖小哥把美味的食物送到你家。
没有它们，我们的基因工程可就没法开展了。
想象一下，如果没有这些小哥，基因可怎么进得了细胞的大门呢？1.1 质粒载体说到载体，质粒可算是老前辈了。
质粒就像是细菌的“USB闪存”，它能自我复制，携带外来基因，简直就是基因工程的明星。
质粒的特点是操作简单、成本低，而且它们在细菌中可以很稳定地传递下去。
想想看，若是你把一张重要的文件放在闪存里，不仅可以在一台电脑上使用，还能借给朋友，这种“共享经济”在基因界也在不断上演。
质粒载体就是这样的存在，方便又实用，真是个好帮手！1.2 噬菌体载体再说说噬菌体载体。
这个名字听起来就有点威风，实际上它就是一种能感染细菌的病毒。
噬菌体载体像个特种部队，能精准地将目标基因送到细菌里。
它的特点是能在细菌中以极高的效率进行复制。
想象一下，像忍者一样悄无声息地完成任务，真是酷毙了！当然，它的使用相对复杂，需要一定的技术支持，不过一旦掌握，可是非常厉害的工具。
2. 常见的真核载体讲完细菌的载体，咱们再来看真核细胞的载体，这可得好好聊聊了。
2.1 真核表达载体真核表达载体，是为了在真核细胞中表达外来基因而设计的。
这就像是在高档餐厅里，得有专业的厨师才能把菜做好。
真核表达载体通常含有强大的启动子、终止子和选择标记。
它们能够确保外来基因在真核细胞中顺利表达。
举个例子，就像你去商场买了新衣服，得先试穿才知道合不合适，对吧？这载体也得确保外来基因在细胞中能够“穿”得合适，才能发挥作用。
载体介绍
pBR322—→插入在Ampr 中，基因型为Tetr 、Amps 、—— →在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素培 养基可生长； 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。
这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该 基因活性丧失的现象叫插入失活。
外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r Amp s Tet r
酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome, YAC）
YAC的特点： 1.只能在酵母细胞中扩增 2.克隆容量大，一般为200kb-500kb 3.构建原理，按染色体结构构建
染色体复制和遗传的三个基本组件：
1.自主复制序列（ARS） （autonomous replicating sequence） DNA复制起始点（ori） 2.着丝粒（centromere，cen） 3.端粒（telomeres，tel）
P1 噬菌体载体和 P1 人工染色体载体
P1 噬菌体 ：大肠杆菌的一种溶原性噬菌体。 P1 噬菌体载体 工作原理类似黏粒载体 外源片断70-100kb
P1 人工染色体载体 P1 噬菌体载体的改造，结合了P1 噬菌体载体和 BAC载体的优点。 克隆外源片断130-150kb
（详细介绍）质粒载体
什么是质粒？
1.“严紧型”复制控制的质粒(stringent plamid)：拷 贝数少（1-5个）； 2.“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)：拷 贝数多（10-200个）。
质粒DNA的转移
1. 质粒的类型 据能否自我转移可分为:
接合型（conjugative plasmid)
非接合型（non-conjugative plasmid) 2. F质粒(fertility factor)
载体选择
1、pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
基因表达载体的构建方法
基因表达载体的构建方法基因表达载体是一种用来携带外源基因并将其表达的工具，它可以被用于基因工程、基因治疗、蛋白质表达等领域。
构建一个高效的基因表达载体对于生物学研究和应用具有重要意义。
下面将介绍基因表达载体的构建方法。
首先，选择合适的表达载体。
常用的表达载体包括质粒、病毒、原核生物和真核生物等。
质粒是最常见的表达载体，它具有稳定性高、易于操作等优点。
而病毒载体则可以实现高效的基因传递和表达。
根据实验需要和研究对象的特点，选择合适的表达载体非常重要。
其次，设计基因的插入序列。
在构建基因表达载体时，需要将目标基因插入到载体中，并确保基因的正确表达。
为了实现这一目标，需要设计合适的引物，并利用PCR技术扩增目标基因。
此外，还需要考虑基因的启动子、终止子、信使RNA等序列的设计，以确保基因在宿主细胞中能够得到正确的表达。
然后，将目标基因插入载体。
一般来说，可以利用限制性内切酶将目标基因和表达载体进行酶切，然后利用DNA连接酶将两者连接起来。
此外，还可以利用基因克隆技术将目标基因插入到表达载体中。
在这一步骤中，需要注意选择合适的酶切位点、连接方式和连接效率，以确保插入的基因能够稳定地存在于载体中。
接着，进行载体的转化和筛选。
将构建好的基因表达载体导入到宿主细胞中，然后利用抗生素筛选、荧光筛选等方法，筛选出带有目标基因的阳性克隆。
这一步骤需要注意转化效率、筛选条件和筛选方法的选择，以确保获得高效的表达载体。
最后，验证基因表达载体的功能。
构建好基因表达载体后，需要进行功能验证，包括基因的表达水平、蛋白质的表达情况、生物学活性等方面。
通过Western blot、荧光显微镜、活性测定等方法，验证基因表达载体的功能和稳定性，为后续的研究和应用奠定基础。
总之，构建基因表达载体是一个复杂而又关键的过程，需要综合考虑载体的选择、基因的设计、插入、转化和验证等多个环节。
只有在每一个环节都做到严谨和细致，才能获得高效、稳定的基因表达载体，为生物学研究和应用提供有力支持。
真核表达载体
常用的哺乳动物细胞表达载体和组成成分有SV40病毒表达载体、痘病毒表达载体、逆转录病毒表达载体，常见的哺乳动物表达载体的组成成分有：原核DNA序列、启动子、增强子、拼接信号、终止信号和多聚腺苷酸化信号、筛选标记及真核病毒序列等。
(1)原核DNA序列：为了能在大肠杆菌中增殖，得到大量能转染哺乳动物细胞的重组DNA，哺乳动物表达载体中通常有一段原核序列，包括一个能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便于挑选含重组DNA细菌的抗生素抗性基因，以及便于把真核序列插入载体的少数单一限制性酶切位点。
当具备这些序列以后，外源的真核基因序列可由单一酶切位点插入载体中，形成的重组DNA可在大肠杆菌中增殖，经抗生素筛选后进行DNA提取，即可得到大量的所需的哺乳动物细胞表达载体。
(2)启动子：真核生物的启动子区域位于TATA区上游100bp到230bp之间，TAT区位于转录起始点上游25-30bp处。
启动子的转录效率因细胞而异。
因此需根据宿主细胞类型选择不同的启动子。
(3)增强子：增强子是使启动子的基因转录效率显著提高的一类顺式作用元件，有多个独立核苷酸序列组成。
它们的作用通常不具有方向性，在位于转录起始点的下游或离启动子很远时仍有活性。
许多增强子只能在特定的组织或细胞中起作用，即具有组织细胞的特异性，因此在构建真核表达载体的时候，应根据宿主细胞来选择增强子。
(4)剪接信号：真核基因由许多内含子和外显子组成。
被转录成mRNA前体以后，需通过剪除内含子、连接外显子才能成为成熟的mRNA。
一般mRNA拼接需要的基本序列位于内含子的5’和3’末端，因此，改变拼接位点5’和3’末端两侧的外显子序列可能会影响邻近拼接位点的使用效率，在替换外显子时应注意。
(5)终止信号和多聚腺苷化的信号：转录的终止信号常常位于多聚腺苷化位点下游的一端长度为几百个核苷酸碱基的DNA区域内。
多聚腺苷化需要两种序列：位于腺苷化位点下游的GU丰富区或U丰富区和位于腺苷化位点上游11-30个核苷酸处的一个有6个核苷酸碱基组成并高度保守的AAUAAA序列。
基因工程原理与技术-3
pBV221
rrnB
制备RNA探针的载体
两条链RNA 探针的制备程序
简化外源蛋白纯化的载体(标签载体) pBAD/His
常用的标签： 多聚组氨酸残基、 结合麦芽糖蛋白、 谷胱甘肽-s-转移 酶。
亲和层析法纯 化外源蛋白。
pBAD/His的三种变体(3种读码框)
BglII site of the MCS.
表达载体
(根据受体细胞)
原核细胞表达载体 真核细胞表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的转运)
分泌型表达载体 非分泌型表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的组成)
融合型表达载体 非融合型表达载体
大肠杆菌表达载体的特征(与克隆载体相比)：①强启动
子；如Lac、Trp、Tac、PL、PR、T7启动子。②SD序列； ③强终止子。如rrnB。
大多数)、双链线形 DNA、RNA(酵母的 杀伤质粒)。
提取的质粒有三 种构型：①闭合环形 DNA(超螺旋构型)， ②开环形DNA，③线 形DNA。
2、质粒的复制类型 严紧型：严格受宿主控制，1~3拷贝
松弛型：不严格受宿主控制，10~200拷贝
质粒的复制类型与宿主有关，如R1质粒在大肠杆菌中 是严紧型，而在奇异变形杆菌是松弛型；ColE1-K30质粒与 R1质粒正好相反。
起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制 的质粒载体。
如：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体(植物转化载 体)、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体(见下图)、大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体(pHV14、pEB10)、大肠杆菌-动 物细胞穿梭质粒载体(pBPV-BV1)，但还没有大肠杆菌-植物 细胞穿梭质粒载体。
例如，将λ噬菌体在EcoRI限制-修饰的宿主和EcoRI限制-修 饰缺陷型宿主之间反复地循环生长，筛选到完全失去了 EcoRI酶切位点的λ噬菌体。然后将突变体同野生型λ噬菌体 在体内进行重组，选择得到仅在非必需区段具有1~2个 EcoRI酶切位点的重组体噬菌体。
真核细胞表达系统
真核细胞表达系统常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒／昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。
简而言之，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作烦琐。
1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母，后来相继出现其他种类酵母，其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。
甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志，可在大肠杆菌大量扩增。
甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列，容易整合入酵母染色体中。
大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1)，在强启动子作用下，以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。
甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平，实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。
2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达，其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。
杆状病毒系统蛋白表达量很高，而且大部分蛋白质能保持可溶性。
杆状病毒基因组较大(130kb)，可容纳大的外源DNA片段；杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性，安全性较高。
目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体，能快速有效地产生重组杆状病毒。
与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比，大大简化了操作步骤，缩短了鉴定重组病毒的时间，适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠，它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质，几乎都能在细胞内准确定位，在医学研究中得到广泛应用。
虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大，更耗时，成本更高，但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。
哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。
7第七章：真核生物的克隆载体
特定克隆实验中三种酵母克隆载体选择 哪一种，从下面3个因素考虑：
• 1、转化效率（transformation frequency) ：即用每微 克的质粒DNA可以获得的转化体的数目。
YEp:10,000-100,000个（转化的细胞/每微克质粒DNA） YRp:1000-10,000个 YIp: 小于1000个
7.1.6
7.1.6 其他酵母和真菌的载体
除酿酒酵母外，其他酵母和真菌的基础分子生物学
研究还需要其他相应的克隆载体。目前在丝状真菌
基因工程中广泛使用的载体系统主要是整合型质粒
和自主复制型质粒两大类。
在多数情况下，整合型质粒（相当于YIp）能够更好
地满足生物技术领域的需要，它们可以提供稳定的
重组体，可以在生物反应器中长时间地生长。
酵母游离型质粒，YEp13
为什么人们要构建这样一种穿梭载体？
• 原因之一是很难完整地把重组DNA从转化后的酵母 菌落中取出来。而对YEp来说不存在问题，因为 YEp在酵母细胞中主要以质粒形式存在；但是对一 些把自己整合到酵母染色体上的载体来说，要想从 酵母细胞中提纯重组的DNA简直是不可能的。可是， 在有些克隆实验中，必须提纯重组后的DNA，进行 测序，以判断重组体是否已经正确构建。
3) 复制起始位点：与质粒的复制起点功能一样，是染色 体DNA复制的起始位置。
染色体结构确定后，可以通过重组DNA技术将染 色体的每一个组成部分分离开来，然后再连接在一 起，创造人工染色体。自然存在的酵母染色体有几 百个kb的长度，利用人工染色体可以携带比其他 质粒载体携带的更大的DNA分子。
YAC载体的结构和用途
质粒与C.S LEU2基因间的重组可以将YEp13整合进酵母
分子生物学：真核生物表达系统
人延长因子1基因 人巨细胞病毒立早基因 劳斯肉瘤病毒LTR 猿猴病毒40晚期基因 猿猴病毒40早期基因 腺病毒主要晚期启动子 小鼠β－珠蛋白基因
40～160 4 2 1.1 1 0.4 0.2
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（2）多聚腺苷酸化信号（加尾信号）：所 有真核细胞mRNA3ˊ末端都具有Poly(A)结 构，多腺苷酸化信号一般由位于多腺苷酸化 位点上游11～30核苷酸的保守序列AAUAAA 和一个下游的GU或U富含区组成，
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(4)复制子：哺乳动物基因表达载体的 复制子一般采用病毒基因组的复制子， 由于某些病毒可以在哺乳动物宿主细胞 内进行自主复制。不同的病毒复制子的 工作效率不同，常用于构建哺乳动物表 达载体的复制子有SV40、多瘤病毒和牛 乳头瘤病毒等的复制子。
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1、真核蛋白在原核宿主中不稳定
2、表达出来的蛋白质不能有效、正 确的折叠及二硫键配对错误 3、缺乏信号肽切除、糖基化、磷酸 化和羧化等翻译后修饰以及对原核 细胞有毒性。
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一、真核细胞表达宿主的种类及优势
不同表达系统蛋白质表达及翻译后修饰情况的比较 大肠杆菌 产率 蛋白酶消化
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pCMV-HA：为Clontech公司产品， 该质粒载体含CMV启动子，在CMV 下游的内含子为晚期SV40 19S mRNA内含子及SV40 16S mRNA内 含子，在N端有血凝素(HA)表位标签 和氨基苄青霉素抗性基因选择标记。
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病毒感染 转染
化学法
物理法
真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点：该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在,转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体（Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点：pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达.用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位.亦可用于检测克隆的启动子活性（取代CMV启动子,Acet1-Nhe1）。
3、pEGFT-Actin，增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP—Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
基因载体名词解释
基因载体名词解释基因载体是指用于携带、传递和复制基因的分子或生物体。
在基因工程和生物技术领域，基因载体通常是指能够容纳外源DNA序列的DNA分子或细胞，常被用于基因克隆、基因表达、基因转移等实验和应用中。
常见的基因载体包括质粒、噬菌体、噬菌体样粒子、大肠杆菌、酵母、昆虫细胞等。
这些载体被广泛用于基因工程实验和技术，在研究和应用中起到了至关重要的作用。
质粒是最常用的基因载体之一，是一种小型环状DNA分子，可以自主复制和传递，对于分子克隆和基因表达都非常有用。
质粒通常具有选择性标记基因（如抗生素抗性基因），可以通过选择性培养来筛选出带有目标基因的质粒。
此外，质粒还可以携带其他附加基因元件，如启动子、终止子、启动子和信号序列等，在基因表达中发挥重要作用。
另一种常见的基因载体是噬菌体，是一种感染细菌的病毒。
噬菌体可以携带外源DNA序列，并在细菌中进行复制和表达。
噬菌体可以用于高效地产生大量目标蛋白，因此在基因表达和蛋白生产中具有广泛应用。
此外，还有噬菌体样粒子，它是由噬菌体的基因组包裹在蛋白质壳中构成的粒子，可以携带大片的外源DNA序列，并在细胞中进行复制和表达，常用于基因克隆和基因转移实验。
在真核生物中，常用的基因载体包括酵母和昆虫细胞。
酵母是一种单细胞真核生物，具有较高的基因组稳定性和蛋白表达能力，在基因工程和蛋白生产中被广泛运用。
昆虫细胞也具有较高的蛋白表达能力，被广泛用于重组蛋白的产生和应用。
总的来说，基因载体是在基因工程和生物技术领域中不可或缺的工具，能够携带外源DNA序列，并在细胞中进行复制、传递和表达。
基因载体的选择和设计对于实现特定的实验目标和应用需求至关重要。
pmv261载体质粒过表达蛋白条件
pmv261载体质粒过表达蛋白条件一、概述pmv261载体是一种广泛用于真核重组蛋白表达的质粒载体，其具有高转染效率和稳定性，适用于真核细胞中的高效表达。
Pmv261载体质粒过表达蛋白条件是指在真核细胞中使用pmv261载体质粒过表达目的蛋白时，需要考虑的背景条件和表达条件。
二、背景条件1. 细胞系pmv261载体质粒过表达蛋白的条件需要考虑所选择的真核细胞系。
常用的细胞系包括HEK293、CHO、SF9等，不同细胞系具有不同的转染效率和蛋白表达水平，因此需要根据具体实验要求选择合适的细胞系。
2. 质粒构建质粒的构建和序列设计对于pmv261载体质粒过表达蛋白条件也至关重要。
需要考虑目的蛋白的大小、结构和亲水性等因素，以及信使RNA的序列和启动子的活性，以确保质粒能够高效表达目的蛋白。
三、表达条件1. 转染条件过表达条件的第一步是将构建好的pmv261载体质粒转染入选定的真核细胞系中。
转染条件需要考虑转染剂的选择、转染时间和细胞的状态等因素，以确保质粒能够高效进入细胞内并稳定表达。
2. 表达时间表达时间是指在转染后需要给予细胞一定的时间来表达目的蛋白。
对于pmv261载体质粒过表达蛋白条件，需要根据目的蛋白的稳定性和表达水平来确定合适的表达时间，以确保蛋白能够高效表达并保持稳定性。
3. 表达介导为了提高目的蛋白的表达水平，可以采用介导蛋白或者其它表达增强因子来辅助pmv261载体质粒表达目的蛋白。
在确定介导蛋白的使用条件时，需要考虑其在细胞内的活性和相互作用以及对目的蛋白表达的影响。
四、实验技术1. 转染技术在pmv261载体质粒过表达蛋白条件下，转染技术是非常关键的步骤。
常用的转染技术包括磷脂体转染、钙磷酸盐共沉淀转染、电穿孔转染等，需要根据细胞系的特点选择合适的转染技术。
2. 免疫印迹技术免疫印迹技术是用来检测目的蛋白在真核细胞中表达水平的关键技术。
在pmv261载体质粒过表达蛋白条件下，需采用恰当的抗体和检测方法对目的蛋白进行定量和定性分析。
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真核细胞常见表达载体
真核细胞, 表达载体
1、pCMVp-NEO-BAN载体
特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)
特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体
特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。
4、pSV2表达载体
特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。
SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。
此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。
5、CMV4 表达载体
特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。
含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。
但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。
其他常用克隆Vector：
pBluscript II KS DNA 15 ug
pUC18 DNA 25 ug
pUC19 DNA 25 ug
说明:
pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。
这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将
为白色菌落，而无外源DNA片段载体的细胞则为兰色菌落，由此易于筛选有无外源DNA片段的载体。
此外，这些载体中有便于测序的M13、T7和T3的通用引物进行DNA测序。
保存液: TE Buffer
TE Buffer组成:
10mM Tris.HCL(Ph 8.0)
1mM EDTA
用途:
克隆外源DNA片断.
进行基因表达.
使用M13、T7和T3引物进行测序.
存在的问题
细胞的生命活动是一个复杂的调控过程，有些生命活动的机理还不完全清晰，由于插人的目的基因不同，载体构建栗用的顺式组件不同，组装的空间位置不同，采用的表达系统不同，目的基因表达水平和阳性克隆筛选率都会有很大差异。
另外，由于所有的顺式元件存在种属和组织特异性，所构建的高效表达载体不一定在所有细胞株中均高效表达。
再者，细胞生长状态的差异，转染方法的不同培养时阉的长短，筛选药物浓度的高低，对表达量都有很大影响。
所以，需要综合评价一个表达载体和表达系统，排除一些不定因素，筛选出最佳组合
真核表达载体趋向于既有利于扩增目的基因又有利于筛选阳性克隆的载体的构建。
许多有效的应用范围广的强启动子和增强子被人发现并应用于载体中，大大提高了目的基因的表达量，另外一些强的组成型启动子，如SV40早期启动子+PHTLv，已应用于大规模生产的细胞系中。
应用以GS为筛选标志的表达载体可兼有筛选和扩增目的基因两种功能，是目前研究的重点。
以IRES连接的双顺反子表达载体已成为核表达载体的主体。
在同一启动子操纵下，筛选基因或报告基因与目的基因转录在同一mRNA上通过IRES的作用，表达出两种蛋白，因而在理论上可认为，通过了筛选或表达了报告基因的克隆必为阳性克隆，即表达目的基因的克隆，有报道说这种双顺反子的共表达率为90％。
这就大大提高了筛选率，简化了实验过程。
将强启动子、增强子和可扩增的筛选标志组装在同一载体上，构建高效表达和筛选的表达载体并将其运用于最合适的表达系统中，是当今真核表达载体构建研究发展方向。
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