蛋白质组学
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蛋白质组学
断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性
两性电解质(Carrier ampholytes)
蛋白酶抑制剂（protease inhibitors）：PMSF等
防止细胞裂解时蛋白酶释放出来降解蛋白质。
9、蛋白质的分级提取（用蛋白质组学方法得到蛋白质）
根据溶解性差异：最大优点？
1、水溶液提取，溶解亲水性蛋白质
14、蛋白质染色方法
胶内：考马斯亮蓝R-250(CBB R-250)：所需时间较长；灵敏度不高
银染：灵敏度高；对下一步的酶切肽谱提取存在困难
CBB G-250、负染
荧光染料染色：差异蛋白质组学研究，灵敏度250pg与银染相近，但线性范围高于银染。
以及放射性同位素标记等
转移到膜（PVDF、硝酸纤维素膜）上：酰胺黑(Amido Black)、丽春红S(Ponceau S)
大大增加蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性
去污剂(Detergents):SDS、TritonX-100、NP-40、CHAPS等
破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出
还原剂(Reducing Agents)：β-巯基乙醇、DTT或TDF（二硫赤藓糖）和三丁基膦(TBP)等
（1）明确研究目标，获得尽可能多的感兴趣蛋白。
（2）不同类型的蛋白质需要不同的方法
（3）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两种方法
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品（特别是溶解性低的蛋白如膜蛋白）在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
防止在样品制备过程中发生样品降解（如酶性或化学性降解等）。
蛋白质组学
1、蛋白质组（proteome）
两性电解质(Carrier ampholytes)
蛋白酶抑制剂（protease inhibitors）：PMSF等
防止细胞裂解时蛋白酶释放出来降解蛋白质。
9、蛋白质的分级提取（用蛋白质组学方法得到蛋白质）
根据溶解性差异：最大优点？
1、水溶液提取，溶解亲水性蛋白质
14、蛋白质染色方法
胶内：考马斯亮蓝R-250(CBB R-250)：所需时间较长；灵敏度不高
银染：灵敏度高；对下一步的酶切肽谱提取存在困难
CBB G-250、负染
荧光染料染色：差异蛋白质组学研究，灵敏度250pg与银染相近，但线性范围高于银染。
以及放射性同位素标记等
转移到膜（PVDF、硝酸纤维素膜）上：酰胺黑(Amido Black)、丽春红S(Ponceau S)
大大增加蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性
去污剂(Detergents):SDS、TritonX-100、NP-40、CHAPS等
破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出
还原剂(Reducing Agents)：β-巯基乙醇、DTT或TDF（二硫赤藓糖）和三丁基膦(TBP)等
（1）明确研究目标，获得尽可能多的感兴趣蛋白。
（2）不同类型的蛋白质需要不同的方法
（3）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两种方法
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品（特别是溶解性低的蛋白如膜蛋白）在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
防止在样品制备过程中发生样品降解（如酶性或化学性降解等）。
蛋白质组学
1、蛋白质组（proteome）
蛋白质组学(Proteomics)
4.蛋白质组研究的新技术 蛋白质组研究的新技术 双向凝胶电泳存在繁琐、不稳定和低灵敏度等 缺点。发展可替代或补充双向凝胶电泳的新方法已 成为蛋白质组研究技术最主要的目标。目前，二维 色谱 (2D-LC)、二维毛细管电泳 (2D-CE)、液相色 谱－毛细管电泳 (LC-CE) 等新型分离技术都有补充 和取代双向凝胶电泳之势。另一种策略则是以质谱 技术为核心，开发质谱鸟枪法(Shot-gun)、毛细管 电泳-质谱联用 (CE-MS)等新策略直接鉴定全蛋白质 组混合酶解产物。随着对大规模蛋白质相互作用研 究的重视，发展高通量和高精度的蛋白质相互作用 检测技术也被科学家所关注。此外，蛋白质芯片的 发展也十分迅速，并已经在临床诊断中得到应用。
蛋白质组学（Proteomics）
主讲：甘光华
一.概念
蛋白质组学（Proteomics）一词，源于蛋白 质（protein）与 基因组学（genomics）两个 词的组合，意指“一种基因组所表达的全套 蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所 表达的全部蛋白质。蛋白质组本质上指的是 在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋 白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋 白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关 于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面 的认识，这个概念最早是由Marc Wilkins 在 1995年提出的。
四.蛋白质组学技术 蛋白质组学技术
蛋白质组学技术的发展已经成为现代生 物技术快速发展的重要支撑，并将引领生物 技术取得关键性的突破。蛋白组学技术主要 包括双向凝胶电泳、等电聚焦、生物质谱分 析及非凝胶技术。
1.双向凝胶电泳 双向凝胶电泳 双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等 电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不 同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白 质在二维平面上分开。由于双向电泳技术在蛋白质 组与医学研究中所处的重要位置，它可用于蛋白质 转录及转录后修饰研究，蛋白质组的比较和蛋白质 间的相互作用，细胞分化凋亡研究，致病机制及耐 药机制的研究，疗效监测，新药开发，癌症研究， 蛋白纯度检查，小量蛋白纯化，新替代疫苗的研制 等许多方面。近年来经过多方面改进已成为研究蛋 白质组的最有使用价值的核心方法。
蛋白质组学
研究意义背景
研究意义
研究背景
蛋白质组学书籍随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生 命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因 组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯 片、基因表达序列分析(Serial analysis of gene expression, SAGE)等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的， 其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从DNA mRNA蛋白质，存在三个层次 的调控，即转录水平调控(Transcriptional control )，翻译水平调控(Translational control)，翻译后水 平调控(Post-translational control )。从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表 蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相 关性更差。更重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等则 几乎无法从mRNA水平来判断。毋庸置疑，蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构 和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修 饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。虽然蛋白质的可变性和多 样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生 命过程。传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求。这是因为：(1)生命现象的发生 往往是多因素影响的，必然涉及到多个蛋白质。(2)多个蛋白质的参与是交织成网络的，或平行发生，或呈级联 因果。(3)在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的，并不象基因组那样基本固定不变。
蛋白质组学
致病微生物的蛋白质组研究
蛋白质组的一个重要应用是在阐明新抗生素作用机理的研 究上.当今,细菌对大多数抗生素都有了抗性,寻找作用于细菌 内新的靶子的研究工作已经展开,找到了许多有效的抗菌化合 物.但目前遇到的困难在于难以揭示新的化合物的作用靶子及 其作用机理.有时虽在体外发现新化合物能够使某种蛋白质失 活,但在体内是否有这种现象和这是否是抗菌的主要机制仍然 未知,现在双向电泳分析提供了一个有效手段.例如在研究抑制 核糖体类抗生素对细菌的作用机制时,对12种作用于翻译过程 的不同阶段和核糖体内不同分子的抗生素加以考察,发现其中8 种诱导冷休克反应的一系列蛋白质,另4种诱导一系列热休克反 应的蛋白质,因此预计新的作用于核糖体的化合物也是诱导这 两种反应,并且籍此可以推测大肠杆菌对冷热的反应发生于核 糖体水平上.蛋白质组研究的重要优势在于能够从整体水平上 分析不同条件下蛋白质谱的变化.例如作为一种差异显示技术, 这一技术已被用于比较结核分枝杆菌与牛结核分枝杆菌蛋白的 不同,结果发现一些在基因水平上很类似的蛋白在蛋白质水平
生物化学专题
主讲教师 杨婉身 晏本菊 陈惠
蛋白质组学的含义
蛋白质组(Proteome)一词最早由澳大利亚学 者 Ｗｉｌｋｉｎｓ等于1994年提出,指的是由一 个基因组geneome或一个细胞、组织表达的所有 protein。蛋白质组学(proteomics)是在蛋白质水 平上定量、动态、整体性地研究生物体。 同基因组学一样,蛋白质组学不是一个封闭的、 概念化的、稳定的知识体系,而是一个领域。它旨 在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式, 其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞 内定位、相互作用研究等,最终揭示蛋白质功能, 是基因组ＤＮＡ序列与基因功能之间的桥梁。
蛋白质组学研究的内容
蛋白质组学
蛋白质组学阐明生物体各种生物基因组在细胞中表达的全部蛋白质的表达模式及功能模式的学科。
包括鉴定蛋白质的表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能和相互作用等。
百科名片蛋白质组学（Proteomics）一词，源于蛋白质（protein）与基因组学（genomics）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。
蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，这个概念最早是由Marc Wilkins 在1995年提出的。
前言蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。
通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，我们可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，它们可成为新药物设计的分子靶点，或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志。
确实，那些世界范围内销路最好的药物本身是蛋白质或其作用靶点为某种蛋白质分子。
因此，蛋白质组学研究不仅是探索生命奥秘的必须工作，也能为人类健康事业带来巨大的利益。
蛋白质组学的研究是生命科学进入后基因时代的特征。
基本策略蛋白质组(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一个基因组(genOME)，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(PROTein). 蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别，它随着组织、甚至环境状态的不同而改变. 在转录时，一个基因可以多种mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰. 故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物，蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目. 蛋白质组学(Proteomics)处于早期“发育”状态，这个领域的专家否认它是单纯的方法学，就像基因组学一样，不是一个封闭的、概念化的稳定的知识体系，而是一个领域. 蛋白质组学集中于动态描述基因调节，对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定，鉴定疾病、药物对生命过程的影响，以及解释基因表达调控的机制. 作为一门科学，蛋白质组研究并非从零开始，它是已有20多年历史的蛋白质(多肽)谱和基因产物图谱技术的一种延伸. 多肽图谱依靠双向电泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和进一步的图象分析；而基因产物图谱依靠多种分离后的分析，如质谱技术、氨基酸组分分析等.研究基础90年代初期开始实施的人类基因组计划，在经过各国科学家近10年的努力下，已经取得了巨大的成就。
蛋白质组学-医学院研究生课程2014-概论
人类与黑猩猩的基因对比研究
人类基因组有7个区域可能经历了25万年来的 “选择性清洗”，也就是突变基因具有明显竞 争优势。经过数百代繁殖后，突变种变成了种 群里的优势种，相应的突变基因也变成了正常 基因。人类基因组中经过“选择性清洗”的， 就包括与语言相关的基因。
研究人员发现，黑猩猩的Y染色体中有5个基 因已经退化，而人类Y染色体中则没有这种现 象。培格因此表示：“如果说在过去的600万 年中，人类Y染色体有基因遗失的话，这种遗 失程度也是很小的。我认为，我们可以自信地 驳斥Y染色体‘末日’理论。人类Y染色体在 今后的600万年里都不会消失。”
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藏人与汉人的基因组比较
测定了50个藏族人的外显子组。发现了适应高海拔环境的一些候 选关键基因。其中最强的自然选择的信号来自一个叫做内皮PerArnt-Sim结构域蛋白1（endothelial Per-Arnt-Sim (PAS) domain protein 1，EPAS1）的基因。该基因是一个转录因子，与缺氧反 应有关。EPAS1的SNP显示藏族人与汉族人样本有78%的不同。 这是迄今为止在人类基因中发生的最快的等位基因频率的变化。 该SNP与血红蛋白含量的联系证明EPAS1的功能是适应缺氧环境 。因此，通过群体基因组的研究，发现了一个基因与适应高原环 境有关。
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人类基因组与尼安德特人的比较
The observation that the Neandertal genome appears as closely related to the genome of a Chinese and a Papua New Guinean individual as to the genome of a French individual is particularly surprising as there is, to date, no fossil evidence that Neandertals existed in East Asia or Papua New Guinea. Green et al. thus suggest that gene flow between Neandertals and modern humans occurred prior to the divergence of European and Asian populations. Based on comparative genomic data, as well as a mathematical model of gene flow, the authors further estimate that between 1 and 4% of the genomes of people in Eurasia may be derived from Neandertals.
蛋白质组学
2021/6/7
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主要研究内容
• 1、了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类 • 2、明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的 • 3、描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部
位，如与药物结合并且决定其活性的部位。
2021/6/7
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与基因组学的关系
2021/6/7
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The study of proteins expressed by genomes
• 2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2003年 9月、2004年8月以及2005年8月召开了中国蛋白质组学首届、第 二届及第三届学术大会，2004年10月在中国北京召开了第三届国 际蛋白质组学会议。
• 科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863” 计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为 重点项目。
2021/6/7
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等点聚焦（IEF）
2021/6/7
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IPG 胶条平衡
• 胶条由一向转移到二向必须进行胶条平衡，目的主要是进行蛋白质的 烷基化及让电泳介质达到与二向SDS-PAGE相同的缓冲体系。烷基化 的目的是对蛋白质自由巯基进行修饰，是断开的二硫键不会再重新形 成。
2021/6/7
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SDS - PAGE
• 我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较 大的进展。
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蛋白质组学的相关技术及应用
• 双向电泳技术： • 原理：双向电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）是等电聚焦电泳和
SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照等电点分离），然后再进行 SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。
Chapter 5 蛋白质组学
2) ESI原理
电喷雾电离方法是利用高电场使 质谱进样端的毛细管柱流出的液滴 带电，在N2的作用下，液滴溶剂蒸 发，表面积缩小，表面电荷密度不 断增加，直至产生的库仑斥力与液 滴表面张力达到雷利极限，液滴爆 炸为带电的子液滴，这一过程不断 重复使最终的液滴非常细小呈喷雾 状，这时液滴表面的电场非常强大， 使分析物离子化并以带单电荷或多 电荷的形式进入质量分析器。
Image ScannerⅡ扫描仪
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高灵敏度，高分辨，在扫描弱图 像时不需散光板，能检测极微量 的样品 硬件和软伯的校正功能，提高扫 描质量 完整的14-bit图像解析度，准确定 量有利于线性范围＞3.7OD 可选择波长，以降低背景，增加 灵敏度 多种扫描速率有利于更快的图像 摄录 应用广泛，适用于湿胶，杂胶膜， 胶片等各种应用 与各种软件配合，能分析各种1D 和2D电泳图
●四极杆—飞行时间分析器
四极杆—飞行时间分析器是由四极杆分析器和飞行时间分析 器串联构成，四极杆分析器用于离子选择，其后有一个六极 杆射频场用于离子的碰撞，诱导解离产生子离子，母离子和 子离子的检测均由最后的飞行时间检测器完成。
5）主要质谱仪
MALDI-TOF/MS; ESI-Q-TOF/MS; MALDI-TOF-TOF/MS; ESI-MS/MS; HPLC-ESI-MS/MS.
4）飞行时间质量检测器
线性飞行时间质量检测器； 反射飞行时间质量检测器； 多级质量分析检测器：包括三级四极杆分 析器(triple-quadrupole analyzer)、离 子阱分析器(ion trap analyzer)和四极 杆—飞行时间质量分析器(quadruple-time of light analyzer)。
蛋白质组学名词解释
蛋白质组学名词解释蛋白质组学（proteomics）是研究蛋白质组成、结构、功能和相互作用的科学领域。
蛋白质组学通过高通量技术手段和生物信息学方法，对细胞、组织或生物体中的蛋白质进行系统性的研究和定量分析。
以下是一些常用的蛋白质组学相关名词的解释。
1. 蛋白质组（proteome）：指在特定条件下一个个体或一类细胞或组织中所表达的全部蛋白质的集合。
蛋白质组由所有不同的蛋白质及其变体组成。
2. 蛋白质组学技术（proteomic techniques）：包括质谱分析、蛋白质分离与纯化、蛋白质结构与功能研究等一系列的实验技术，用于研究蛋白质的组成、结构和功能。
3. 二维凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis）：一种分离和检测蛋白质的方法，通过将蛋白质样品在两个方向上（按等电点和分子量）先后进行电泳分离，然后通过染色或质谱分析进行识别和定量。
4. 液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）：一种将液相色谱与质谱结合的技术，用于对蛋白质样品进行分离和鉴定，可以提供高分辨率和高灵敏度的分析结果。
5. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）：一种质谱分析技术，利用基质分子吸收激光的能量，将样品中的蛋白质分子转化为离子，然后测量离子的质荷比，从而确定蛋白质的分子量。
6. 蛋白质识别（protein identification）：通过质谱分析，将实验测得的质谱图与数据库中已知蛋白质的质谱比对，确定分析样品中的蛋白质身份。
7. 蛋白质定量（protein quantification）：通过质谱信号的强度或含量标准品的比对，确定分析样品中蛋白质的相对或绝对含量。
蛋白质组学介绍
数据解读与挖掘
蛋白质相互作用网络
利用蛋白质组学数据构建蛋白质相互作用网 络，揭示蛋白质之间的功能关联和调控机制 。
蛋白质功能注释
基于蛋白质组学数据对蛋白质进行功能注释，预测 其生物学功能和参与的生物过程。
疾病标志物发现
通过比较正常和疾病状态下的蛋白质组学数 据，发现与疾病相关的生物标志物，用于疾 病诊断、治疗和预后评估。
02
蛋白质组学研究技术
蛋白质分离技术
01
双向电泳技术
通过等电点和分子量的差异分离 蛋白质，是蛋白质组学研究中的 基础技术。
02
高效液相色谱技术
利用不同物质在固定相和流动相 之间的分配差异进行蛋白质分离。
03
表面增强拉曼光谱 技术
通过将蛋白质吸附到特定的增强 基底上，利用拉曼光谱进行蛋白 质的定性和定量分析。
基因敲除和敲入技术
通过基因工程技术手段改变基因的表达，研 究蛋白质的功能。
荧光共振能量转移技术
用于研究蛋白质在细胞内的定位和动态变化。
蛋白质互作分析技术
用于研究蛋白质与其他分子之间的相互作用， 如酵母双杂交、免疫共沉淀等。
蛋白质相互作用研究技术
酵母双杂交技术
01
利用酵母细胞中两种蛋白相互作用的原理，发现蛋白质之间的
特点
蛋白质组学具有全局性、动态性和功 能性的特点，能够全面揭示蛋白质的 组成和功能，并研究其在生命活动中 的变化规律。
研究内容与目标
研究内容
蛋白质的分离与鉴定、蛋白质表达与调控、蛋白质相互作用和蛋白质功能研究等。
研究目标
阐明生物体中蛋白质的组成、结构和功能，揭示生命活动的本质和规律，为疾病诊断和治疗提供理论依据。
发病机制
蛋白质组学
•凝胶图像扫描 •图像加工 •斑点检测和定量 •凝胶配比 •数据分析 •数据呈递 •2-DE数据库建立
（二）质谱技术
2-DE分离的蛋白经切胶回收、酶解后进行质谱分析
Edman测序：将蛋白肽链逐步化 学解聚，色谱鉴定酶解下来的氨 基酸，反推氨基酸序列
质谱测序：将蛋白肽链打碎电离，
通过测定分子碎片的荷质比，推 算出氨基酸组成和序列
三、荧光差异凝胶电泳技术2-DIGE
目的：显示不通样品中蛋白表达的差异，寻找差异表达蛋白
2-DIGE的定量原理
四、同位素亲和标签技术ICAT
2-DIGE的不足： 无法对分子量极高和极低、等电点极酸和极碱、含量极低的蛋白进行分离 ICAT的改进： 使用带有生物素和氘标记的ICAT标签标记 蛋白分子，利用8道尔顿的分子量差实现 相对定量
第二节 蛋白质的大规模分离鉴定技术
一、蛋白质二维电泳-质谱技术 （一）蛋白质二维电泳技术2-DE
IEF
SDS-PAGE
蛋白质的结构
蛋白质是两性电解质，在不同PH下所 带的电荷不同：等电聚焦IEF 蛋白质的分子量和分子形状不同，电 泳迁移率不同：SDS-PAGE
2-DE数据库
蛋白质分离后可建立2-DE数 据库，用于鉴定和比较
（三）根据系统发育谱进行互作蛋白的预测
功能相关的(functionally related)基因，在一 组完全测序的基因组中预期同时存在或不存 在，这种存在或不存在的模式(pattern)被称 作系统发育谱；如果两个基因，它们的序列 没有同源性，但它们的系统发育谱一致或相 似。可以推断它们在功能上是相关的。
输入细胞核：-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val输出细胞核：-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Leu-Asp-Ile输入线粒体：+H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-LeuCys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu输入质体：+H3N-Met-Val-Ala-Met-Ala-Met-Ala-Ser-Leu-Gln-Ser-Ser-Met-Ser-Ser-Leu-Ser-Leu-SerSer-Asn-Ser-Phe-Leu- Gly-Gln-Pro-Leu-Ser-Pro-Ile-Thr-Leu-Ser-Pro-Phe-Leu- Gln-Gly输入过氧化物酶体：-Ser-Lys-Leu-COO输入内质网：+H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-GluAla-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys- Glu-Val-Phe-Gln返回内质网：-Lys-Asp-Glu-Leu-COO-（KDEL） 由质膜到内体：Tyr-X-X-Φ
（二）质谱技术
2-DE分离的蛋白经切胶回收、酶解后进行质谱分析
Edman测序：将蛋白肽链逐步化 学解聚，色谱鉴定酶解下来的氨 基酸，反推氨基酸序列
质谱测序：将蛋白肽链打碎电离，
通过测定分子碎片的荷质比，推 算出氨基酸组成和序列
三、荧光差异凝胶电泳技术2-DIGE
目的：显示不通样品中蛋白表达的差异，寻找差异表达蛋白
2-DIGE的定量原理
四、同位素亲和标签技术ICAT
2-DIGE的不足： 无法对分子量极高和极低、等电点极酸和极碱、含量极低的蛋白进行分离 ICAT的改进： 使用带有生物素和氘标记的ICAT标签标记 蛋白分子，利用8道尔顿的分子量差实现 相对定量
第二节 蛋白质的大规模分离鉴定技术
一、蛋白质二维电泳-质谱技术 （一）蛋白质二维电泳技术2-DE
IEF
SDS-PAGE
蛋白质的结构
蛋白质是两性电解质，在不同PH下所 带的电荷不同：等电聚焦IEF 蛋白质的分子量和分子形状不同，电 泳迁移率不同：SDS-PAGE
2-DE数据库
蛋白质分离后可建立2-DE数 据库，用于鉴定和比较
（三）根据系统发育谱进行互作蛋白的预测
功能相关的(functionally related)基因，在一 组完全测序的基因组中预期同时存在或不存 在，这种存在或不存在的模式(pattern)被称 作系统发育谱；如果两个基因，它们的序列 没有同源性，但它们的系统发育谱一致或相 似。可以推断它们在功能上是相关的。
输入细胞核：-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val输出细胞核：-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Gly-Leu-Asp-Ile输入线粒体：+H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-LeuCys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu输入质体：+H3N-Met-Val-Ala-Met-Ala-Met-Ala-Ser-Leu-Gln-Ser-Ser-Met-Ser-Ser-Leu-Ser-Leu-SerSer-Asn-Ser-Phe-Leu- Gly-Gln-Pro-Leu-Ser-Pro-Ile-Thr-Leu-Ser-Pro-Phe-Leu- Gln-Gly输入过氧化物酶体：-Ser-Lys-Leu-COO输入内质网：+H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-GluAla-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys- Glu-Val-Phe-Gln返回内质网：-Lys-Asp-Glu-Leu-COO-（KDEL） 由质膜到内体：Tyr-X-X-Φ
蛋白质组学概论
蛋白质数据库
表达蛋白质组学研究的基本流程
蛋白样品的制备及定量
总蛋白的双向凝胶电泳（染色） 凝胶分析软件分析 胶内酶解（胰肽酶） 质谱分析（肽质量指纹图谱） 数据库搜索鉴定蛋白性质
样品制备的原则
1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的 总蛋白，减少蛋白质的损失； 2）减少对蛋白质的人为修饰； 3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使 蛋白质处于完全变性状态。
还原剂（reducing agents），最常用的是二硫苏糖醇（DTT），主要作用 是破坏蛋白质分子间的二硫键，以利于肽链的分离； 蛋白酶抑制剂，如EDTA、PMSF or Protease inhibitor cocktails，主要作用 是防止蛋白的降解。
蛋白质样品中核酸等大离，导致明显的纵向拖尾。
2-D Western blotting差异反应图谱
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption /ionization time of flightmass spectrometry，MALDI-TOP-MS）
MALDI-TOP-MS工作原理
双向电泳与质谱技术的联合应用成为蛋白 质组学研究的基本技术平台。
目前应用于临床的肿瘤标志物可分为以下几类: (1)肿瘤胚胎性抗原,如CEA ( carcinoembryonic antigen)、甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)； (2)异位激素,如绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)、 前促胃液素释放肽(Pro-gastrin-releasing peptide, ProGRP)； (3)酶和同工酶,如神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)、 乳酸脱氢酶(lactate dehydyogenase,LDH)、前列腺酸性磷酸酶(prostate gland acidity phosphatase,PAP)； (4)血浆蛋白,如β2-巨球蛋白； (5)细胞代谢产物,如细胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment,CYFRA)、 脂质相关涎酸； (6)肿瘤抗原,如癌抗原1-29、癌抗原-125； (7)癌基因和抑癌基因蛋白产物,如C-myc 基因蛋白、Ras基因蛋白、P53抑 癌基因蛋白； (8)微量元素,如砷、铜、铁、硒、锌。
蛋 白 质 组 学
5. 蛋白质不能动态反映生物系统所处的状 态。
二.蛋白质组与蛋白质组学的概念 蛋白质组与蛋白质组学的概念 1. 蛋 白 质 组 (Proteome) ： 1994 年 由 澳 大 利 亚 Macquarie大学的学生 大学的学生Wilkins和他的老师提出， 和他的老师提出， 大学的学生 和他的老师提出 最早见文献是1995年 7月的 “ Electrophoresis” 月的“ 最早见文献是 年 月的 杂志上。指基因组表达的所有相应的蛋白质， 杂志上。 指基因组表达的所有相应的蛋白质， 也可说是指细胞或机体全部蛋白质的存在及其 活动方式。 活动方式。 2.蛋白质组学： 研究细胞内全部蛋白质的组成及 蛋白质组学： 蛋白质组学 其活动规律的科学。 其活动规律的科学。
人的各种体液被用于研究与某些疾病的关 系.最近澳大利亚科学家利用双向电泳技术研究 最近澳大利亚科学家利用双向电泳技术研究 眼泪中的蛋白质与生理状态的关系.他们发现了 眼泪中的蛋白质与生理状态的关系 他们发现了 一种新的蛋白质,这个蛋白质非常相似于在乳腺 一种新的蛋白质 这个蛋白质非常相似于在乳腺 癌细胞里高表达的另一种蛋白质.这个发现可能 癌细胞里高表达的另一种蛋白质 这个发现可能 会提供疾病诊治的新的手段.在一项利用蛋白质 会提供疾病诊治的新的手段 在一项利用蛋白质 组研究技术进行的酒精对人体毒性的研究中发 乙醇会改变血清蛋白糖基化作用,导致许多 现,乙醇会改变血清蛋白糖基化作用 导致许多 乙醇会改变血清蛋白糖基化作用 糖蛋白的糖基缺乏,如转铁蛋白 如转铁蛋白。 糖蛋白的糖基缺乏 如转铁蛋白。
蛋白质组学 的研 究内容
表达 蛋白质组学
结构 蛋白质组学
功能 蛋白质组学
表达蛋白质组学
研究细胞所表达的蛋白质种类
蛋白质组学
蛋白质组学的研究进展和发展趋势 海外主要进展： 海外主要进展： 美国国立卫生研究院，美国能源部、欧共体 等均启动了不同生物蛋白质组的研究并取得 明显进展，一批高质量的研究论文相继在国 际著名学术刊物上发表。 为了促进国家与地区性的蛋白质组的发展、 合作与交流，成立了国际人类蛋白质组组织 (HUPO)。
蛋白质组学的研究内容
主要为四个方面： 主要为四个方面：
1. 对蛋白质的大规模识别和翻译后加工修 饰的细微特征分析， 2. 在较大的疾病谱中分析蛋白质的水平， 3. 研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用， 4. 蛋白质结构的解析，特别是三维结构的 解析、种类分析、数量确定等。
蛋白质组学的研究技术
一、双向凝胶电泳(2-DE)： 双向凝胶电泳(2-DE)： (2 基本原理： 基本原理： 第一向电泳基于蛋白质的等电点不同用 等电聚焦分离蛋白质，第二向电泳则按 分子量的不同用变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，把复杂蛋 白质混合物中的蛋白质在二维平面上分 开。
发展趋势： 发展趋势：
1、在基础研究方面 近两年来蛋白质组研究技术已被应用到各 种生命科学领域，如细胞生物学、神经生 物学等。在研究对象上，覆盖了原核微生 物、真核微生物、植物和动物等范围，涉 及到各种重要的生物学现象，如信号转导、 细胞分化、蛋白质折叠等等。在未来的发 展中，蛋白质组学的研究领域将更加广泛。
3、在技术发展方面 蛋白质组学与其它学科的交叉日益显著， 特别是蛋白质组学与其它大规模科学如基 因组学，生物信息学等领域的交叉，构成 组学生物技术研究方法，所呈现出的系统 生物学研究模式，将成为未来生命科学最 令人激动的新前沿。
参考书目
《蛋白质研究技术》：第四军医大学出版社 《蛋白质化学与蛋白质组学》：科学出版社 《蛋白质组学理论与方法》：科学出版社 《蛋白质组学导论》：科学出版社
人类蛋白质组学
人类蛋白质组学人类蛋白质组学是一门研究蛋白质在人体内的表达、修饰、相互作用及其与疾病关系的科学。
本文将依次探讨蛋白质鉴定、蛋白质表达调控、蛋白质相互作用、蛋白质修饰、蛋白质与疾病关系、蛋白质药物发现及蛋白质组数据库等方面的内容。
1.蛋白质鉴定蛋白质鉴定是蛋白质组学研究的基础，主要包括分离纯化、定性定量和鉴定描述三个步骤。
常用的方法有质谱、色谱、光谱和免疫学等。
通过这些技术，可以确定蛋白质的相对分子质量、等电点、氨基酸序列等性质，从而对其进行鉴定。
常用的蛋白质鉴定软件有Sequest、Mascot等。
以乳腺癌研究为例，通过蛋白质鉴定技术，成功发现了与乳腺癌相关的差异表达蛋白质，为疾病诊断和治疗提供了新的靶点。
2.蛋白质表达调控蛋白质表达调控是细胞对外部刺激和内部信号响应的重要方式，包括转录水平、翻译水平和蛋白修饰水平等。
在转录水平上，基因的转录起始和转录因子结合，决定了蛋白质表达的种类和水平。
在翻译水平上，mRNA的翻译效率、tRNA的种类和水平等因素都会影响蛋白质的表达。
在蛋白修饰水平上，蛋白质的磷酸化、乙酰化、甲基化等修饰方式也会影响其表达和功能。
例如，胰岛素通过调节糖代谢相关酶的磷酸化状态，实现对糖代谢的调控。
3.蛋白质相互作用蛋白质相互作用是指两个或多个蛋白质之间发生的相互作用，包括配体结合、蛋白相互作用和信号转导等。
配体结合是指蛋白质与特定的配体分子结合，如血红蛋白与氧气结合。
蛋白相互作用是指蛋白质与其他蛋白质相互作用，如免疫应答过程中抗原与抗体的相互作用。
信号转导是指由细胞表面受体介导的信号传递过程，如EGFR信号通路中的蛋白质相互作用。
研究蛋白质相互作用对于揭示生命活动规律和疾病机制具有重要意义。
例如，糖尿病的研究中发现了一种新的蛋白质相互作用模式，为治疗该疾病提供了新的思路。
4.蛋白质修饰蛋白质修饰是指对蛋白质进行化学修饰，以改变其性质和功能。
常见的蛋白质修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化等。
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当某一物质不易定量分离时，可用此法进行测定。在有 可能分离出一定量纯物质时，可在分离前加入一定量放 射性同位素，然后测定分离出的纯物质的放射性强度。 由测得的放射性强度与纯物质质量的比，得知全部放射
性强度（加入的已知量）与全部物质质量的比。
荧光染色差异显示双向电泳
是一种在2-D电泳之前进行荧光染料标记蛋
1994年首先提出，源于蛋白质（protein）与基因
组（genome）两个词的杂合,意指proteins
expressed by a genome，即“一个细胞或一个组织
基因组所表达的全部蛋白质”。
蛋白质组是
对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是 局限于一个或几个蛋白质。
同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情 况各不相同 。
分开，电泳后根据蛋白质的上样量对胶进行考马
斯亮兰染色、银染或荧光染色，然后用相关软件
对电泳图象进行分析。
特
点
可分离10～100 kD分子量的蛋白质
高灵敏度和高分辨率
便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配
缺点
极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋 白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技 术难于有效分离。
些细胞直接在膜上进行裂解。
（二）蛋白质分离技术
双向凝胶电泳 （two-dimensional electrophoresis，2-DE)
双向高效柱层析
双向凝胶电泳原理 第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦 分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分
离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上
蛋白质加工和修饰分析
很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译
后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻
译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因
此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质
的功能具有重要作用。
蛋白质功能研究
对基因功能、基因表达调控机制、细胞
因子、配体、受体的研究，蛋白质表达后在
细胞内的定位，酶活性分析和酶底物的确定。
酵母双杂交技术
噬菌体展示技术
蛋白质亲和层析
将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附
剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液
通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白
质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲
和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而
与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱
液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。
的研究。
主要质谱类型
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱
mass spectrometry，MALDI-TOF MS）
（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight
电喷雾质谱
（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS）
对照，就可确定待测化合物
生物传感器耦联质谱技术
组 成
Biacore基于表面等离子共振（SPR）进行生物 大分子相互作用分析(BIA)
质谱（MALDI-TOF-MS或LC-ESI-MS/MS） 鉴定Biacore芯片上配体所捕获的生物分子
Biacore的基本工作原理
当生物大分子结合（如蛋白质相互作用） 时会引起作用表面(芯片)折射率的变化，这 种光信号可被光感受器接受并转换成电信号 传送到计算机，再由计算机还原为模拟的生 物信号。
胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用
实现自动化。
三种新的方法对2-D电泳的补充
带有同位素标记的亲和标签方法 二维液相色谱串联质谱测量法 毛细管区带电泳
双向高效柱层析 第一向用分子筛柱层析，按蛋白质不同分子 量进行分离，第二向用反向柱层析，利用蛋白质
表面疏水性质进行分离。第二向的分离原理与双
1989年Field 和Song等人在酵母细胞中设计的
分析蛋白质相互作用的方法。
以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为 基础的。
转录激活因子GAL4的特点
N端含NLS和与酵母GAL1基因启动子上游激活 序列(UASG)结合的结构域
C端含GAL1转录激活结构域
酵母双杂交系统
将待研究的两种蛋白质的基因分别 克隆到酵母表达质粒的转录激活因子 (如GAL4等)的DNA结合结构域基因和
不需分离靶蛋白
敏感性高
缺 点
1.假阳性结果 2.限于核内表达的蛋白质的相互作用
噬菌体表面显示技术 ( phage display )
三个基本因素： 在噬菌体pⅢ和pⅧ衣壳蛋白N端插入外源待筛基
因编码的蛋白；形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒
的表面；同时其保持的外源蛋白天然构象能被相应
的抗体或受体识别
噬菌体表面显示技术
比较蛋白质组学
组成蛋白质组学
是一种针对基因组或转录组数据库的生物体 或组织、细胞，建立其蛋白质或亚蛋白质组(或
蛋白质表达谱)及其蛋白质组连锁群的一种全景
式的蛋白组学Байду номын сангаас究，从而获得对有机体生命活动
的全景式认识。
比较蛋白质组学
比较蛋白质组学针对不同空间、不同时间上 动态变化着的蛋白质组的整体进行比较,分析不
白样品的方法，通过对不同的蛋白样品用不同
的荧光染料进行标记，在同一块双向凝胶中可
同时分离多至三种不同的蛋白样品，并且每块
胶上又引用了内标，从而能够对样品间蛋白质
丰度差异进行精确分析。
氨基酸化学标记技术
放射性核素亲和标记技术
赖氨酸标记技术
色氨酸标记技术
蛋白质相互作用的研究技术
蛋白质亲和层析 免疫印迹又称蛋白质印迹 免疫共沉淀
蛋白质组学
proteomics
高晚霞
背 景
基因数量有限性和基因结构的相对稳定性
vs 生命现象的复杂性和多变性
从genomic到proteome
对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生
物学功能进行全面深入的研究已成为生命科学
研究的迫切需要和重要任务。
蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于
可以分离得到天然状态的相互作用蛋白
复合物。
缺
点
可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－
蛋白质相互作用；
两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而
可能有第三者在中间起桥梁作用；
必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选
择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，
实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system）
疫酶探针等，对抗原固定化基质膜进行检测和分析。
免疫共沉淀
是以抗体和抗原之间的专一性作用为
基础，当用抗体将相应特定分子沉淀的同
时，与该分子特异性结合的其他分子也会
被带着一起沉淀出来的技术。
优 点
相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，
处于天然状态；
蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，
可以避免人为的影响；
同蛋白质组之间在表达数量、表达水平和修饰
状态上的差异,可以发现与病变相关的特异蛋白
质,对疾病的诊断和治疗具有重要意义。
主要研究内容
蛋白质鉴定
蛋白质加工和修饰分析 蛋白质功能研究 重要生命活动的分子机制研究 蛋白质组学的研究最终要服务于人类的 健康，主要指促进分子医学的发展
蛋白质鉴定
可以利用一维电泳和二维电泳并结合 Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片 及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。
组织水平上的蛋白质组样品制备
临床样本都是各种细胞或组织混杂，而 且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是 与血管、基质细胞等混杂。
激光捕获显微切割 (laser capture microdissection，LCM)
是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和
其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石
蜡包埋组织切片中获取目标细胞 ，成功地解决
了组织中的细胞异质性问题，从而可以进行纯细
胞的蛋白质组研究。
原理
在显微镜下选择感兴趣的细胞，用乙烯醋酸 盐聚合体膜覆盖在被选择的细胞上 ，激光源发
射一束激光被覆盖的透明乙烯乙酸酯膜吸收，瞬
间升温使膜局部熔化，并在激光脉冲结束后瞬间
冷却，当膜被提起时，仅目标细胞留在膜上，这
适用于大规模蛋白质相互作用研究
蛋白质芯片技术 （protein chips，protein array）
基本原理 将高度密集排列的蛋白分子作为探针 点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白 样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再 经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析。
鉴定和注释蛋白质的路线
通过肽质谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配
通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组 分进行蛋白质组分析。
也可以进行样品预分级，即将细胞或组 织中的全体蛋白质分成不同部分，分别 进行研究。
样品预分级的主要方法
蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等
蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等
蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶
绿体等
样品预分级主要作用在于提高低丰 度蛋白质的上样量和检测灵敏度。
通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基 酸序列标签和数据库搜寻匹配
（四）蛋白质的定量和差异表达及 相互作用的研究技术
定量蛋白质组学的研究技术
放射性同位素稀释技术 荧光染色差异显示双向电泳
性强度（加入的已知量）与全部物质质量的比。
荧光染色差异显示双向电泳
是一种在2-D电泳之前进行荧光染料标记蛋
1994年首先提出，源于蛋白质（protein）与基因
组（genome）两个词的杂合,意指proteins
expressed by a genome，即“一个细胞或一个组织
基因组所表达的全部蛋白质”。
蛋白质组是
对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是 局限于一个或几个蛋白质。
同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情 况各不相同 。
分开，电泳后根据蛋白质的上样量对胶进行考马
斯亮兰染色、银染或荧光染色，然后用相关软件
对电泳图象进行分析。
特
点
可分离10～100 kD分子量的蛋白质
高灵敏度和高分辨率
便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配
缺点
极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋 白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技 术难于有效分离。
些细胞直接在膜上进行裂解。
（二）蛋白质分离技术
双向凝胶电泳 （two-dimensional electrophoresis，2-DE)
双向高效柱层析
双向凝胶电泳原理 第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦 分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分
离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上
蛋白质加工和修饰分析
很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译
后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻
译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因
此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质
的功能具有重要作用。
蛋白质功能研究
对基因功能、基因表达调控机制、细胞
因子、配体、受体的研究，蛋白质表达后在
细胞内的定位，酶活性分析和酶底物的确定。
酵母双杂交技术
噬菌体展示技术
蛋白质亲和层析
将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附
剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液
通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白
质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲
和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而
与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱
液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。
的研究。
主要质谱类型
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱
mass spectrometry，MALDI-TOF MS）
（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight
电喷雾质谱
（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS）
对照，就可确定待测化合物
生物传感器耦联质谱技术
组 成
Biacore基于表面等离子共振（SPR）进行生物 大分子相互作用分析(BIA)
质谱（MALDI-TOF-MS或LC-ESI-MS/MS） 鉴定Biacore芯片上配体所捕获的生物分子
Biacore的基本工作原理
当生物大分子结合（如蛋白质相互作用） 时会引起作用表面(芯片)折射率的变化，这 种光信号可被光感受器接受并转换成电信号 传送到计算机，再由计算机还原为模拟的生 物信号。
胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用
实现自动化。
三种新的方法对2-D电泳的补充
带有同位素标记的亲和标签方法 二维液相色谱串联质谱测量法 毛细管区带电泳
双向高效柱层析 第一向用分子筛柱层析，按蛋白质不同分子 量进行分离，第二向用反向柱层析，利用蛋白质
表面疏水性质进行分离。第二向的分离原理与双
1989年Field 和Song等人在酵母细胞中设计的
分析蛋白质相互作用的方法。
以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为 基础的。
转录激活因子GAL4的特点
N端含NLS和与酵母GAL1基因启动子上游激活 序列(UASG)结合的结构域
C端含GAL1转录激活结构域
酵母双杂交系统
将待研究的两种蛋白质的基因分别 克隆到酵母表达质粒的转录激活因子 (如GAL4等)的DNA结合结构域基因和
不需分离靶蛋白
敏感性高
缺 点
1.假阳性结果 2.限于核内表达的蛋白质的相互作用
噬菌体表面显示技术 ( phage display )
三个基本因素： 在噬菌体pⅢ和pⅧ衣壳蛋白N端插入外源待筛基
因编码的蛋白；形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒
的表面；同时其保持的外源蛋白天然构象能被相应
的抗体或受体识别
噬菌体表面显示技术
比较蛋白质组学
组成蛋白质组学
是一种针对基因组或转录组数据库的生物体 或组织、细胞，建立其蛋白质或亚蛋白质组(或
蛋白质表达谱)及其蛋白质组连锁群的一种全景
式的蛋白组学Байду номын сангаас究，从而获得对有机体生命活动
的全景式认识。
比较蛋白质组学
比较蛋白质组学针对不同空间、不同时间上 动态变化着的蛋白质组的整体进行比较,分析不
白样品的方法，通过对不同的蛋白样品用不同
的荧光染料进行标记，在同一块双向凝胶中可
同时分离多至三种不同的蛋白样品，并且每块
胶上又引用了内标，从而能够对样品间蛋白质
丰度差异进行精确分析。
氨基酸化学标记技术
放射性核素亲和标记技术
赖氨酸标记技术
色氨酸标记技术
蛋白质相互作用的研究技术
蛋白质亲和层析 免疫印迹又称蛋白质印迹 免疫共沉淀
蛋白质组学
proteomics
高晚霞
背 景
基因数量有限性和基因结构的相对稳定性
vs 生命现象的复杂性和多变性
从genomic到proteome
对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生
物学功能进行全面深入的研究已成为生命科学
研究的迫切需要和重要任务。
蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于
可以分离得到天然状态的相互作用蛋白
复合物。
缺
点
可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－
蛋白质相互作用；
两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而
可能有第三者在中间起桥梁作用；
必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选
择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，
实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system）
疫酶探针等，对抗原固定化基质膜进行检测和分析。
免疫共沉淀
是以抗体和抗原之间的专一性作用为
基础，当用抗体将相应特定分子沉淀的同
时，与该分子特异性结合的其他分子也会
被带着一起沉淀出来的技术。
优 点
相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，
处于天然状态；
蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，
可以避免人为的影响；
同蛋白质组之间在表达数量、表达水平和修饰
状态上的差异,可以发现与病变相关的特异蛋白
质,对疾病的诊断和治疗具有重要意义。
主要研究内容
蛋白质鉴定
蛋白质加工和修饰分析 蛋白质功能研究 重要生命活动的分子机制研究 蛋白质组学的研究最终要服务于人类的 健康，主要指促进分子医学的发展
蛋白质鉴定
可以利用一维电泳和二维电泳并结合 Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片 及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。
组织水平上的蛋白质组样品制备
临床样本都是各种细胞或组织混杂，而 且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是 与血管、基质细胞等混杂。
激光捕获显微切割 (laser capture microdissection，LCM)
是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和
其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石
蜡包埋组织切片中获取目标细胞 ，成功地解决
了组织中的细胞异质性问题，从而可以进行纯细
胞的蛋白质组研究。
原理
在显微镜下选择感兴趣的细胞，用乙烯醋酸 盐聚合体膜覆盖在被选择的细胞上 ，激光源发
射一束激光被覆盖的透明乙烯乙酸酯膜吸收，瞬
间升温使膜局部熔化，并在激光脉冲结束后瞬间
冷却，当膜被提起时，仅目标细胞留在膜上，这
适用于大规模蛋白质相互作用研究
蛋白质芯片技术 （protein chips，protein array）
基本原理 将高度密集排列的蛋白分子作为探针 点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白 样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再 经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析。
鉴定和注释蛋白质的路线
通过肽质谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配
通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组 分进行蛋白质组分析。
也可以进行样品预分级，即将细胞或组 织中的全体蛋白质分成不同部分，分别 进行研究。
样品预分级的主要方法
蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等
蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等
蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶
绿体等
样品预分级主要作用在于提高低丰 度蛋白质的上样量和检测灵敏度。
通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基 酸序列标签和数据库搜寻匹配
（四）蛋白质的定量和差异表达及 相互作用的研究技术
定量蛋白质组学的研究技术
放射性同位素稀释技术 荧光染色差异显示双向电泳