骨髓间充质干细胞和成纤维细胞的蛋白质组学比较

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骨髓间充质干细胞和成纤维细胞的蛋白

质组学比较

作者,赵亮,魏旭峰,孙阳,陈瑜,易定华

【摘要】目的,采用蛋白质组学方法研究人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)和成纤维细胞中的蛋白表达差异.方法,对hBMSCs和成纤维细胞的蛋白样本进行双向凝胶电泳分离,通过比较两种细胞的蛋白组学图谱,确定差异表达的蛋白点,而后对差异点进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析和蛋白数据库信息检索,最后选取其中的5种蛋白进行WesternBlot实验验证蛋白质组学的研究结果.结果,在hBMSCs和成纤维细胞中鉴定出29种差异表达蛋白,其中有17种蛋白在两种细胞中有显著差别地表达,另外12种蛋白在两种细胞中有相同丰度地表达.WesternBlot 的实验结果进一步验证了蛋白质组学分析的结果.结论,hBMSCs与成纤维细胞中蛋白的差异表达体现了两种细胞在细胞形态、结构和功能上的异同性,这对于研究hBMSCs向成纤维细胞分化以及应用 hBMSCs构建组织工程瓣膜具有重要意义.

【关键词】骨髓间充质干细胞成纤维细胞蛋白质组学

【Abstract】

AIM:TofindoutthedifferencesandsimilaritiesontheprotEinexpressionsbetween h

umanbonemarrowmesenchymalstemcells(hBMSCs)andhumanfibroblasts,

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which

havedifferentcellcharacteristicsandsimilarcellmorphology.METHODS: The

protEInextractswereobtainedfromhBMSCsandfibroblasts,andseparatedbytw o-dimensionalgelelectrophoresis(2-

DE).Andthenthedifferentialproteinspotswereidentifiedbymatrix-assistedlaserdesorptionionization-timeofflight-massspectrometry(MALDI-TOF-

MS).TheresultsfromsimultaneousproteomicprofilingwerefurthervalidatedbyWe sternBlotofselectedproteins.RESULTS:Twenty-ninedifferentialproteinsweresuccessfullyidentifiedinhBMSCsandfibroblasts .Amongthem,17proteinswereexpressedsignificantlydifferentlyinhBMSCsfromth atinfibroblasts,andanother12proteinsequallyexpressedinthe2typesofcells.C ONCLUSION:ThedifferentialproteinexpressionsbetweenhBMSCsandfibroblastspr ovideanewinsightintothedifferentialcellstructuresandfunctionsbetweenthe2 typesofcells,whichmightbevaluableforfurtherstudyoffibroblastsdifferentia tionfromhBMSCsandtheapplicationofhBMSCsforcreatingtissueengineeredheartv alvesinthefuture.

【Keywords】bonemarrowmesenchymalstemcells,fibroblasts,

proteomics

0引言

骨髓间充质干细胞,BMSCs,是目前理想的组织工程瓣膜间质细胞

的种子细胞,相对于血管来源的种子细胞,MSCs具有获取方便、多向分化潜能, 以及独特的免疫特性,能够在同种异体微环境中组织中产生免疫耐受的优点,1-2,.该研究拟全面比较hBMSCs和成纤维细胞中蛋白表达的差异,进一步

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在蛋白水平理解两种在细胞结构和功能差异.这对今后研究hBMSCs在体外向成纤维细胞的分化诱导,以及应用hBMSCs构建组织工程瓣膜是非常必要的.

1材料和方法

1.1材料人骨髓来源于本院骨髓穿刺室,经过骨髓细胞学检查排除了血液系统的恶性疾病.人成纤维细胞,HDF,是购自CellApplications公

司,/index.htm,.细胞分离、培养的主要试剂,Percoll 淋巴细胞分离液(密度为1.073g/mL),DMEM/F12,低糖,,磷酸盐缓冲液(PBS),硫酸链霉素、青霉素,均自Gibco,USA,,胎牛血清,CD34,CD44,CD29和CD105抗

体,Sigma,USA,.双向凝胶电泳的主要试剂,尿素、硫脲和甘油,均自

Sigma,USA,,CHAPS(美国Merck),两性电解液、IPG预制胶条(pH3,10,130mm)和碘乙酰胺,均自Bio,Rad,USA,,Bradford蛋白质检测试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司).WesternBlot实验所用抗体,Sigma,USA,.

1.2方法(1)细胞培养和hBMSCs的鉴定:骨髓经肝素钠生理盐水(1200U/mL)肝素化后,PBS液洗涤、离心,弃掉骨髓中的脂滴等杂质,而后采用Percall淋巴细胞分离液进行密度梯度离心,获得的单核细胞静置培养于DMEM/F12培养液,含100mL/L 的胎牛血清,2mmol/L谷氨酰胺(Bio-Whittaker)

和50U/mL青霉素,50mg/mL庆大霉素.原代细胞在2,3d可见少量贴壁细胞,细胞形态多样、不均一,继续培养,细胞多呈梭形,漩涡样或放射状平行排列,形成较多的细胞集落.10,14d后细胞即达80%,90%融合,传代后细胞集落消失,细胞均匀分布,平行排列,较紧密,3,4d即可传1代.当hBMSCs扩增至第3代时,采用流式细胞术分析hBMSCs的表面分子.细胞不表达造血标志CD34,CD45,而强表达CD29,CD105,阳性率分别为99.4%和99.5%,3-4,.同时,在培养的第

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