贴壁生长细胞传代方法
培养细胞的生长增殖过程 第四节
原代培养
包括：取材、分散细胞、接种、培养 等． 在所有操作中，多都要注意保持培养物 及生长环境的无菌条件。
组织块培养
组织块的原代培养方法，首先从机体某 部位取下组织，方法： 处死动物 将组织块剪碎 Hanks液 冲下剪刀上的碎块，补加 3~5mLHanks液 吹打、低速离心、 弃上清液、留下组织块 吸管取 出组织块放入培养瓶内，使其贴在瓶壁 上，（有组织块的瓶壁朝上）加入培养 液 培养 传代
倍体细胞系（Diploid Cell Line）。为保持二倍体细胞性质，细
胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均 在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适 宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性 质或发生转化。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐
6. 分别取1毫升0.25%胰酶消化液放 入培养皿中
7.将加有胰酶消化液的培养皿 放入37℃温箱中消化1分钟
8.从温箱中取出培养皿后 用手轻轻拍打培养皿的边缘；
9.用倒置式显微镜观察细胞 是否完全脱落
细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞 从细胞瓶壁上洗下，将细胞悬液用吸管吹散后传代： 有经验后，可肉眼对光观察帖壁半透明的细胞层，判断消化程度。
贴壁生长的细胞生长特性
原本为圆形的细胞一经贴壁就迅速 铺展，然后开始有丝分裂，并很快 进入对数生长期。一般数天后就可 铺满生长表面，形成致密的细胞单 层。这种方法易于观察细胞生长状 况，适宜于实验室研究。但是如需 继续培养，需将单层细胞再分散， 稀释后再重新接种，进行传代培养。
贴壁生长的细胞一般生长过程是：
B
培养板培养法
培养板培养法曾被称为微量培养法，是 现代体外培养技术最为常用的方法之一。 具体做法是将培养细胞接种在培养板的 孔内，然后在C02培养箱内培养。最常用 的培养板有6孔、24孔和96孔培养板，后 者最为常用。一般都是一次性使用。
细胞冻存、复苏、传代、转染(超详细版)
细胞培养系列方法【实验前准备】（1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul枪头、PBS溶液。
（2）清洁超净工作台面，照紫外30分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶PBS液、双抗置于室温下复温。
细胞的冻存与复苏【实验用品】（1）材料：培养的贴壁细胞（70%-80%融合）、于液氮中冻存的细胞（2）试剂： PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培养基、胎牛血清、二甲亚砜（DMSO）、双抗（3）设备：培养瓶、巴氏吸管、15ml离心管、1.5ml冻存管、盛酒精的喷壶、培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作酒精灯、水浴锅、CO2台。
试剂配制：（1）完全培养基含90%DMEM培养液加10%的胎牛血清加1%的双抗。
（2）冻存液含80%的DMEM培养基加10%的胎牛血清加10%的DMSO，用吸管混匀，置于4℃冰箱中备用。
细胞的冻存(1)依照传代的方法用0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消化。
(2)收集消化细胞于离心管中，800-1000r/min离心5min。
(3)弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为5*106-1*107个/ml。
(4)每个冻存管分装细胞悬液1.5ml，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。
(5)在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。
(6)将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4℃,0.5h→-20℃，1h→-80℃，过夜→转入液氮灌中。
细胞的复苏（1）准备水浴锅，调温度至37℃。
打开离心机。
（2）用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管1只，迅速将其置入38℃水浴锅中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。
（3）用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。
（4）将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加10倍体积的DMEM培养基，吹打混匀。
（5） 1000r/min离心5min，弃上清液。
（6）加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。
贴壁细胞培养完整版
贴壁细胞培养HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】贴壁细胞培养一、克隆形成抑制试验原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在-1.0 mm之间。
通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。
这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。
常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。
本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。
材料与方法（一）用品：含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP管。
5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。
（二）操作：①. 制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密度为3×102个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。
PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。
Mix。
）吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。
重复。
直到需要的细胞数。
12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。
种板：12孔板，加培液，加1ml细胞，不用摇。
②. 待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，，，，，，饱和湿度条件培养箱内孵育μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO27天。
细胞培养—传代—冻存—western blot等实验相关步骤
围绕siRNAs的相关实验详细步骤及总结实验一：细胞传代培养材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、培养瓶、含10%FBS 的RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、PBS、trypsin等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（SKOV-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；含10%FBS的RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
2、取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好），弃旧培养基，PBS 2ml 清洗2次（切勿用力吹打）。
3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2min左右（时间不能太长，以免损伤细胞）。
4、往培养瓶中加入1640 1~2ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000 r/min，5min。
5、弃上清液，加入少量10%FBS的1640培养基使成细胞悬液。
6、分装，按1:2~3传代，每瓶4~5ml。
倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆形，细胞间隙等距），标记。
7、放入CO2培养箱中培养，第二天观察生长状况。
总结：1、在用离心机时，看清楚是RCF还是RPM；调节Temp.以及Time。
2、在用移液枪吸出trypsin充分消化后的细胞后，须知用少量培养液清洗一下培养瓶，并将清洗液移入离心管中。
3、每取用一个容器，拧开或者拧上盖子时，注意在酒精灯上旋转一圈。
另外，记住用酒精棉球经常擦拭台面。
4、在用移液枪或者吸管混匀细胞悬液过程中，动作轻柔，避免产生气泡等。
实验二：细胞冻存材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、冻存管、RPMI —1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、FBS、PBS、trypsin、DMSO等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（OVCAR-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；FBS、RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
BHK-21传代细胞培养
BHK-21传代细胞培养BHK是仓鼠肾细胞[原理]细胞在培养瓶壁上长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
[材料和试剂]1、细胞：贴壁BHK-21细胞株2、试剂：0.25％胰蛋白酶、配制好的DMEM培养液、小牛血清、双抗溶液、7.5%碳酸氢钠3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、胶塞、量筒、注射器、针头、酒精灯、污物缸等[操作步骤]1、应需要计算好培养液的总用量，按10%的比例加入血清，按1%的比例加入双抗。
用7.5%的碳酸氢钠调PH至7.0~7.2左右。
2、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
3、加入0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中为宜。
4、瓶口塞好胶塞，平放在实验台上。
约2~3分钟会看到贴壁细胞层出现细针孔空隙，赶紧将胰酶弃去，加入少量培养液终止消化。
5、用注射器将贴壁的细胞反复吹打，使其均匀分散成悬液，再加入足量的培养液，分成两到三瓶。
塞好胶塞，置37℃温箱中继续培养。
细胞培养常用溶液的配制一、青、链霉素溶液青霉素钠盐(80万IU／瓶) 5瓶链霉素(100万IU／瓶) 4瓶将两者溶于400ml0.9％的无菌生理盐水，分装小瓶，-20℃保存。
双抗在培养基中的终浓度为100IU/ml为宜。
二、7.5%碳酸氢钠溶液的配制称取碳酸氢钠7.5g，加入超纯水使总体积为100ml。
高压灭菌，分装于小瓶中，4℃贮存。
三、1%酚红溶液的配制首先配制1mol/L的NaOH溶液。
称取NaOH4.0g，加入100ml超纯水，使NaOH 完全溶解，在室温或4℃贮存（最好现用现配）。
配制好NaOH溶液后，再称取1.0 g 酚红置研钵中，加1mol/L的NaOH（不多于7.0ml），研磨使酚红完全溶解，加超纯水至100ml，高压消毒，在室温或4℃贮存。
四、0.25%胰蛋白酶溶液的配制氯化钠8.0g氯化钾0.2g柠檬酸钠(Na3C6H5O7•5H2O) 1.12g磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O) 0.056g碳酸氢钠 1.0g葡萄糖 1.0g胰蛋白酶（1：250） 2.5g超纯水加至1000ml放4℃冰箱过夜，待胰蛋白酶充分溶解后，用0.2um微孔滤膜过滤除菌，分装于小瓶中，-20℃保存。
细胞实验(传代、换液、消化组织贴壁细胞、冻存、复苏)
细胞实验乳腺组织块贴壁迁出细胞后胰酶消化：先把培养液、pbs、胰酶消化液放37℃水浴锅，倒掉培养液，加入0.25%（0.125%也可以）胰酶3 min，镜下观察细胞消化情况。
若消化不完全则继续消化，消化完全则加入等量培养液终止消化，反复吹打，将液体加入1.5 ml离心管。
对于一次难以消化下来的组织块，可以多加几次胰酶，每次消化后都要加入pbs洗一洗，然后再加入胰酶继续消化。
将离心管1000 rpm离心5分钟，去上清，加入培养液，重悬，置于合适的培养皿。
细胞换液：将pbs、培养液放37度水浴锅预热。
取出细胞镜下观察生长情况和杂质多少，倒掉原有培养液，用pbs洗一遍（杂质较多时可洗两遍），从壁上加入培养液。
细胞传代：先把培养液、pbs、胰酶消化液放于37℃水浴锅，取出细胞镜下观察生长情况和杂质多少，倒掉原有培养液。
加入0.25%胰酶，消化3 min，镜下观察消化情况。
消化完全则加入等量培养液终止消化，加入离心管内，1000 rpm离心5 min，去上清，加入培养液，重悬，置于合适的培养皿。
标记传了第几代。
注意：（1）293T细胞只需用胰酶消化大概1 min，不用放入培养箱；（2）293T 细胞不需要用PBS重悬，直接加培养液重悬。
对于加入裂解液或者原代培养的细胞需要PBS重悬来洗杂质；（3）加入6孔板时，用1 ml培养液重悬后，每孔加入100 μl。
可根据细胞数量调整加入的量。
细胞复苏：1.调节水温至37℃，取出细胞（4#5号第四格），放入手套中再浸入水中解冻；2.1000 rpm离心5 min，弃上清，用PBS清洗1遍（做磁珠的话用Buffer洗），加入培养液培养。
细胞冻存：需冻存的细胞先用PBS洗一遍，再加入胰酶消化3 min，1050 rpm离心5 min。
沉淀用细胞冻存液重悬，加入冻存管，-80℃保存过夜，第二天转移到液氮罐（4#5号第四格）。
注意：1.配置10% DMSO细胞冻存液：900 μl过滤的血清+100 μl DMSO。
贴壁细胞培养、传代及活性测定等
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冻存细胞的复苏
细胞培养方法介绍
1.把冻存管在37°C水浴进行解冻，其 间不停地温和摇动，直到冻存管内看 不到结冰。
7.加入3毫升预热的培养基再静置5分 钟。 8.加入6毫升预热的培养基静置5分
2.冻存管在水浴中继续孵育30秒，同 时温和地摇动。
钟。 9. 200×g离心细胞悬液10分钟。
3.立即用70%的乙醇消毒。 10.弃上清，再用25毫升的培养基温和 4.在超净台内打开冻存管，把内容物转 移到无菌的15毫升离心管中。 注意 ：如果是玻璃冻存管解冻，用无 菌的纱布裹住消过毒的冻存管，然后 用力掰断已有刻痕的瓶颈。 12.在培养箱中孵育过夜后，再次观察 5.加入1.5毫升在37°C预热的含血清培 养基。 6.静置5分钟。 细胞并估计细胞存活率。如果需要更 准确的检测，则采用台盼蓝排除染色 的方法。 重悬细胞沉淀，之后转移至75cm 2 的 培养瓶中。 11.用显微镜观察细胞，估计细胞的存 活率，然后把它们放入培养箱。
加入适当体积的细胞悬液。 8.将培养瓶放入培养箱，拧松瓶盖1/4 圈，以便气体交换。
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细胞活力分析
改编自Freshney, R.I.,1994。动物细胞培养：基本技术手册，第3版，Wiley-Liss，纽约，美国。 细胞活力分析可以测定细胞悬液 中存活细胞的百分比。一般通过染料 排除的染色方法实现，即具有完整细 胞膜的细胞能够将染料排除在外从而 不被染色，而不具备完整细胞膜的细 胞则能够吸收染料而被染色。 3.将稀释液加入血球计数板的计数池中 用于排除染色法的染料通常选择 台盼蓝，但是赤藓红和萘黑也常被使 用。吸收染料的染色方法也可以用于 测定细胞活力。这种情况下，染料被 活细胞正常吸收，而死细胞则不会。 例如双乙酰荧光素就是这类染色方法 中所使用的染料。 台盼蓝染色的方法应用较为广 泛，操作方法如下所述： 5.用血球计数板计算被染色的细胞数和 总细胞数。 6.未被染色的细胞百分比则代表了活细 胞的百分比。 4.静置1-2分钟（时间不要太长，否则 活细胞也会死亡并开始吸收染料）。 （见血球计数板）。 2.制备用0.4%台盼蓝溶液(SV30084.01) 1：1稀释的细胞悬液。 1.制备用于分析的细胞悬液（大约10 6 个细胞/毫升）。
细胞传代
贴壁细胞：弃去培养液，加胰酶消化，加培养液终止胰酶作用，吹打成悬液，分装传代。
由于贴壁细胞贴壁生长，接触抑制，长满一瓶后贴壁较紧，不易取出。
这时必须用胰蛋白酶或者胶原蛋白酶处理，使其分散开后取出，然后在放入新的培养瓶中培养。
悬浮细胞：离心，弃上清液，加新鲜培养基，分装传代。
悬浮细胞其实也有贴壁现象，只是贴壁不牢。
可以直接用吹打发是细胞掉落下来，进行传代。
传代培养中的细胞传代培养（subculture），当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。
此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。
这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。
对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。
传代方法1．悬浮生长细胞传代传代培养中的细胞离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。
2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
3．贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。
常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。
培养材料1、无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS,GibcoBRL21600-010)传代培养中的细胞2、trypsin-EDTAsolution(0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062)：以10ml分装于15ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。
3、新鲜培养基4、无菌吸管/离心管/培养瓶编辑本段培养步骤1、附着型胞(adherentcell)（1）吸掉旧培养液。
RAW264.7细胞株的传代
•RAW264.7细胞株的传代我养的是RAW264.7细胞株，前面有战友都提到过这种细胞的消化传代，但是因为这种细胞最大的特点是贴壁特别强，每次传代都很难消化下来，刚开始使用胰酶消化，发现37度，消化15min细胞也还是吹不起来，后来又用单纯的用细胞刮刀刮的办法，但是这样养了一段时间，发现细胞损伤非常大，贴壁性变差，生长缓慢，后来使用了现在这个方法，到现在细胞的生长状况一直很好!简述如下：1) 将培养瓶内旧的培养液弃掉，然后用D-Hanks液洗两次，(一定要洗干净，以免影响胰酶的消化作用)2) 加入0.25%胰酶-EDTA消化，25cm培养瓶加0.4ml，37度消化5min，镜下看到细胞变圆，间隙增大。
3)立即加含10%FCS的培养液终止消化，用细胞刮刀轻刮，注意，这时候用吸管吹不下来，但是刮刀却很容易刮下来，而且对细胞的损伤极小4)离心，弃上清，加新的培养液(10%FCS)，小心吹匀，分装入新的培养瓶此法屡试不爽，细胞生长饱满圆润，再也没出现过以前那种情况。
小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的消化及传代RAW264.7因是单核巨噬细胞其生物学特性就是贴壁特别牢。
我的操作如下：实验前将DPBS及DMEM加温到37度使用Flask75培养瓶：1、细胞贴壁生长，长满瓶底70％时，弃去培养液，加DPBS10ml 漂洗一至两次；弃去2、加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM培养液10ml复吹打混悬细胞3、分入新的培养瓶；4、入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁。
细胞生长很好。
刚从上海细胞库买回来的RAW264.7细胞传了大概5到6代就开始不行了,实验进行不下去.刚开始细胞状态都很好,但是后面就开始很多细胞贴着,消化不下来,后面就都裂解掉.后来又复苏了一瓶细胞,也是传了4代左右就开始不行了 .急啊!!搞不懂为什么会这样.有没有人出现这种情况啊?能不能提供一点经验呢?小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.7本身就比较难消化,在ATCC对该细胞传代的描述中是采用细胞刮棒进行的。
细胞传代实验报告
细胞传代培养一.实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的应用打下基础。
二、原理从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。
细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。
细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。
所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规X和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。
三、材料和试剂1、细胞：293细胞株2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基〔含10％小牛血清〕3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精灯等四、操作步骤1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。
2、加入1~2ml 0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。
3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入培养箱中消化几分钟4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代5.根据确定的比例来取需要的量〔剩余的细胞拿来做细胞计数〕，加入4ml左右的培养液6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱7.收拾整理超净台附：消化液配制方法：称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。
细胞的传代培养
实验二细胞的传代培养【实验目的】1. 掌握贴壁细胞换液和细胞传代的方法。
2. 了解细胞传代培养的意义。
【实验原理】细胞在培养瓶里的生长，分为贴壁生长和悬浮生长。
贴壁生长细胞在培养瓶中生长数天后，就会在培养瓶底部长满，如果不进行处理，就会继续生长而产生堆积，最后因缺乏营养供给而死亡。
因此当细胞生长贴满瓶底时，就需要将细胞消化下来，并接种成多瓶细胞，使细胞继续生长。
这一处理接种的过程就叫传代，每接种一次就叫做传一代。
细胞传代培养使得细胞增殖，可获得大量细胞供实验所需。
传代培养是组织培养常规保种方法之一，是几乎所有细胞生物学实验的基础。
接种后的细胞放在培养箱里静置培养，培养的温度视动物种类而定。
一般，温水性鱼类细胞的最适培养温度为25℃，热带鱼类细胞为30℃，冷水鱼类细胞为20℃，哺乳动物细胞为37℃。
细胞培养过程中常出现培养基营养缺乏、代谢产物增多、变酸等不适宜细胞生长因素，而此时细胞还未生长达到饱和密度（没有贴满底部），仍需继续培养，因而需要更新营养液来更新营养成分，以满足细胞继续生长繁殖的需要，这一过程叫换液。
单纯换液不需要接种细胞。
【试剂、材料与仪器】试剂：生长培养基（PRMI-1640 或MEM，添加10% 小牛血清或胎牛血清），0.25% 胰蛋白酶，0.2% EDTA材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL、10 mL），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，消毒纱布，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。
【实验步骤】工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30 分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。
在超净工作台中摆放好移液管、离心管和培养瓶等。
1．观察细胞：倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代，当细胞长满瓶底时可以传代；2．超净工作台准备：将试剂瓶、培养瓶等培养用具用酒精喷洒，用消毒纱布擦净，置于超净工作台酒精灯左侧；3．开盖：旋开细胞培养瓶瓶盖，将瓶盖侧立于（严禁倒扣放置）酒精灯旁，培养瓶瓶口、瓶盖均需过酒精灯火焰后再盖好；4．清洗细胞表面：打开移液管盒，用普镊捏住移液管（5mL）后部从盒子中拖出（注意移液管的管壁和管口不能碰到其他物品），安装好加液枪，移液管管口和管壁均过酒精灯火焰。
细胞传代培养
细胞传代培养1.细胞传代概念传代即去除原培养基并将细胞从原培养体系转移到新鲜的生长培养基中，该过程可使细胞系或细胞株进一步增殖。
接种后培养细胞的生长将从延滞期进入对数期，即：细胞呈指数增殖。
当贴壁培养的细胞已占据所有可用基质、没有扩增空间，或者悬浮培养的细胞已超过培养基所能支撑的能力，无法进一步生长时，细胞增殖速度将大大降低甚至完全停止(参见下图)。
为了将细胞密度维持在最佳水平，以便细胞继续生长，并且刺激其进一步增殖，必须将培养物分成若干部分，并添加新鲜培养基。
2.细胞传代标准（1）细胞密度哺乳动物细胞：贴壁培养细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时即应进行传代。
正常细胞达到汇合状态时会停止生长(接触抑制),重新接种后需要较长时间才能恢复。
转化细胞即使达到汇合状态也能继续增殖，但是在经过大约两个倍增时间后通常会变质。
类似地，悬浮培养的细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时也应进行传代。
到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。
昆虫动物细胞：昆虫细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时应进行传代。
牢固贴壁的昆虫细胞达到汇合状态时也可传代，虽然此时细胞更容易从培养容器上解离下来，但是如果反复将昆虫细胞在密度超过汇合的状态下传代，细胞的倍增次数会减少，活力会降低，贴壁能力也会下降。
另一方面，将贴壁培养的昆虫细胞在达到汇合状态前传代要较大的机械力，才能使细胞从单细胞层中脱离。
反复在达到汇合状态前传代，会导致细胞倍增次数减少，活力降低，健康度较差。
（2）培养基耗竭哺乳动物细胞：生长培养基pH 值降低通常表示乳酸蓄积，乳酸是细胞代谢的副产物。
乳酸有细胞毒性，而且pH值降低也是细胞生长的不利因素。
pH值改变的速度通常取决于培养体系中的细胞浓度，细胞浓度越高，培养基耗竭的速度越快。
如果发现 pH 值迅速降低(>0.1-0.2 pH 单位),同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。
昆虫细胞：用于昆虫细胞培养的生长培养基通常比哺乳动物细胞培养基酸度大。
细胞传代实验报告
细胞传代培养一.实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的应用打下基础。
二、原理从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。
细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。
细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。
所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。
三、材料和试剂1、细胞：293细胞株2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精灯等四、操作步骤1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。
2、加入1~2ml0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。
3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入培养箱中消化几分钟4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代5.根据确定的比例来取需要的量（剩余的细胞拿来做细胞计数），加入4ml左右的培养液6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱7.收拾整理超净台附：消化液配制方法：称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。
贴壁生长细胞传代方法
5吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。
6加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。
7将后者放入培养箱中培养。
贴壁生长细胞传代方法1吸光培养瓶中的培养液2加入12ml025的胰蛋白酶液以消化液能覆盖整个瓶底为准静置210min显微镜下动态监测
贴壁生长细பைடு நூலகம்传代方法：
1吸光培养瓶中的培养液
2加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）
静置2-10 min（显微镜下动态监测）。
3吸去胰蛋白酶液，加入培养液。
细胞传代标准
细胞传代标准
细胞传代的标准主要包括细胞密度、培养基营养成分的耗尽以及距离上次传代的时间。
1.细胞密度：当正常细胞生长至彼此汇合时，即细胞与细胞的边缘开始接触时，就需要进行传代。
这是因为细胞在接触抑制后会停止生长。
对于转化细胞，尽管它们可以在达到汇合状态后继续增殖，但在经过大约两个倍增时间后，它们通常会开始衰退，并且再接种的效率会降低。
2.培养基营养成分的耗尽：当培养基颜色变黄、pH下降，并且伴随细胞密度的增加时，这也是传代
的信号。
然而，如果仅仅是培养基营养耗尽但细胞密度没有增加，那么只需要更换培养液就可以了。
3.距离上次传代的时间：如果每次传代都按照指定的时间节点和一致的细胞浓度进行，那么传代的
时机就可以按照固定的时间点来执行。
此外，对于贴壁培养的细胞，当它们进入对数生长期但尚未达到汇合状态时，也应进行传代。
总的来说，细胞传代的时机需要综合考虑细胞密度、培养基状态以及时间因素，以确保细胞的健康生长和
实验的准确性。
传代培养法
传代培养法是一种细胞培养技术，用于将原代细胞转化为可反复传代的细胞系。
这种方法的步骤如下：
1. 原代细胞适应阶段：原代细胞从组织中分离出来后，需要经过适应阶段以适应该培养环境。
在此期间，细胞逐渐适应贴壁生长，并逐渐分裂增殖。
2. 传代阶段：当原代细胞生长到一定阶段后，需要进行传代。
传代是将原代细胞接种到新的培养液中，以继续增殖生长。
传代过程中需要注意细胞的生长状态和密度，以避免过度生长或污染。
3. 维持培养：传代后的细胞系需要继续培养，以维持其生长和增殖。
在此过程中，需要定期更换培养液，以避免代谢产物的积累和细菌污染。
4. 细胞冻存：为了保持细胞的活力和稳定性，需要进行细胞冻存。
细胞冻存是将细胞保存在低温下，以延长细胞的寿命并保持其遗传稳定性。
传代培养法是一种常用的细胞培养技术，可以用于原代细胞的扩大培养和细胞的遗传稳定性研究。
同时，传代培养法还可以用于制备疫苗、基因治疗和组织工程等领域。
BHK-21传代细胞培养
BHK-21传代细胞培养BHK是仓鼠肾细胞[原理]细胞在培养瓶壁上长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
[材料和试剂]1、细胞：贴壁BHK-21细胞株2、试剂：0.25％胰蛋白酶、配制好的DMEM培养液、小牛血清、双抗溶液、7.5%碳酸氢钠3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、胶塞、量筒、注射器、针头、酒精灯、污物缸等[操作步骤]1、应需要计算好培养液的总用量，按10%的比例加入血清，按1%的比例加入双抗。
用7.5%的碳酸氢钠调PH至7.0~7.2左右。
2、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
3、加入0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中为宜。
4、瓶口塞好胶塞，平放在实验台上。
约2~3分钟会看到贴壁细胞层出现细针孔空隙，赶紧将胰酶弃去，加入少量培养液终止消化。
5、用注射器将贴壁的细胞反复吹打，使其均匀分散成悬液，再加入足量的培养液，分成两到三瓶。
塞好胶塞，置37℃温箱中继续培养。
细胞培养常用溶液的配制一、青、链霉素溶液青霉素钠盐(80万IU／瓶) 5瓶链霉素(100万IU／瓶) 4瓶将两者溶于400ml0.9％的无菌生理盐水，分装小瓶，-20℃保存。
双抗在培养基中的终浓度为100IU/ml为宜。
二、7.5%碳酸氢钠溶液的配制称取碳酸氢钠7.5g，加入超纯水使总体积为100ml。
高压灭菌，分装于小瓶中，4℃贮存。
三、1%酚红溶液的配制首先配制1mol/L的NaOH溶液。
称取NaOH4.0g，加入100ml超纯水，使NaOH 完全溶解，在室温或4℃贮存（最好现用现配）。
配制好NaOH溶液后，再称取1.0 g 酚红置研钵中，加1mol/L的NaOH（不多于7.0ml），研磨使酚红完全溶解，加超纯水至100ml，高压消毒，在室温或4℃贮存。
四、0.25%胰蛋白酶溶液的配制氯化钠8.0g氯化钾0.2g柠檬酸钠(Na3C6H5O7•5H2O) 1.12g磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O) 0.056g碳酸氢钠 1.0g葡萄糖 1.0g胰蛋白酶（1：250） 2.5g超纯水加至1000ml放4℃冰箱过夜，待胰蛋白酶充分溶解后，用0.2um微孔滤膜过滤除菌，分装于小瓶中，-20℃保存。
哺乳动物离体贴壁细胞的传代培养.pdf
三、实验操作——传代培养
1、细胞房及超净台的紫外线消毒，时间约30min-1h。 2、准备材料：完全培养基，0.25%胰酶，PBS，75%乙醇，培养瓶，并且预热培养用液：把装有培养 液、PBS和胰酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 3、用酒精棉球擦拭实验台和双手，正确摆放使用的器械（保证足够的操作空间，不仅便于操作而 且可减少污染）；点燃酒精灯（注意火焰不能太小）。 4、从培养箱内取出细胞（若是培养瓶，注意取出细胞时要旋紧瓶盖），用酒精棉球擦拭显微镜的 台面，再在镜下观察细胞。 5、小心用移液枪吸去原培养皿中的培养液；加入2ml的PBS（无Ca2+和Mg2+）清洗贴壁细胞1-2次， 吸去PBS（此步骤中，PBS应小心添加，以免将贴壁细胞吹打损失） 6、加入原培养液1/10体积（量以盖住细胞最好）的胰蛋白酶-EDTA消化，此处为800ul，使细胞间连 接断裂，液体均匀覆盖培养皿，大约2min或培养箱中20s（目测贴壁细胞块状脱落为标准；倒置显 微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度；最佳消化温 度为37℃）。 7、细胞消化完毕后，加入适量的培养基（带血清）拮抗以终止消化，并吹打细胞，制成均匀的细 胞悬液（尽量吹打均匀，使细胞分散开。） 8、将细胞悬液转移至1.5mlEP管，离心2-3min，转速控制在2000rpm下，后弃去上清（此步骤旨在 去除可能过度消化产生的细胞碎片）。 9、沉淀用1mlDMEM吹打均匀后，按照下面介绍的方法计数细胞，后按比例分装到已装有新鲜培养 液的培养皿中。（传代细胞的密度应该不低于5×105/ml 。） 10、做好标记，晃动以使细胞铺展均匀（经验为横纵轴方向各晃动20-30下，此处应小心勿让培养 液溅出）。 11、显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量， 以及细胞是否铺展均匀。