石斑鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测方法的建立

鱼神经坏死病毒（Nervous necrosis virous，NNV） 是一种世界范围内流行、严重危害多种海水和淡水鱼类 的传染性病原，可以导致鱼类病毒性神经坏死病，又称 病毒性脑病和视网膜病。该病毒具有极高的传染性和 危害性，严重情况下，仔鱼和幼鱼的死亡率可以达到 100% 。目前，使用的检测方法有显微镜观察法、免疫 学方法、分子生物学方法和细胞培养法，这些检测方法 普遍存在技术要求高、操作复杂和耗时长等特点，无法 满足现场的大规模应用。 环介导等温核酸扩增（ Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型的核酸扩增技术。由 于 LAMP 技术具有高灵敏度、强特异性、快速简便、成 本低廉等特点，使其广泛应用于病原菌的检测、胚胎性 别鉴定、食品卫生检测等方面 。本研究利用 RT-LAMP 检测技术，建立了斜带石斑鱼神经坏死病毒的快速检测 方法。通过对比选取了特异性好的一组扩增引物，并优 化了反应时间、反应温度等条件，检验了该方法的灵敏 性和特异性，最终建立了一套不依赖复杂设备，操作简 单，只需肉眼观察就可以实施的检测方法。
收稿日期：2017-10-05 基金项目：厦门南方海洋研究中心项目（项目编号：14GZP75NF39）； 闽海洋高新[2014]21号；江苏省自然科学基金（项目编号： BK20160373）。 作者简介：翟伟锋（1985—），男，江苏苏州人，硕士，助理研究员， 研究方向为生物工程与生物医学。
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名称 4F3 4B3 4FIP 4BIP 4Loop F 4Loop B
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自北京康为世纪生物科技有限公司；LA-320c环介导等温 扩增实时浊度仪、Loopamp RNA扩增试剂盒和Loopamp 荧光检测试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司；RNA 提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；引物 由苏州泓迅生物科技有限公司合成。
表１ 鱼神经坏死病毒的ＲＴ－ＬＡＭＰ引物序列
序列（5´→3´） TCGAGAATCTCCCAGGCC GAAGGTGTGGTCGTTGTCA TAGCAGCGTGTCCCAGTCGTGGGACAGGAACTGACGGA ATTCAGCCAATGTGCCCCGCGATCAGGCAGGAAGCCAG GGTGTGGTCGTTGTCAGTTG TCAGTACACCCGCACGC
第１１卷第３２期 南方农业 ２０１７年１１月 Ｖｏｌ．１１ Ｎｏ．３２ Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｎｏｖ． ２０１７
石斑鱼神经坏死病毒的ＲＴ－ＬＡＭＰ检测方法的建立
翟伟锋 ，殷 波
１，２ １，２
［１．斯澳生物科技（苏州）有限公司，江苏苏州 ２１５１２３； ２．苏州工业园区新国大研究院生物工程与生物医学中心，江苏苏州 ２１料
感染了NNV的斜带石斑鱼和健康的斜带石斑鱼均由 福建水产研究所提供；动物组织/细胞RNA提取试剂盒购
1.2.2 总RNA的提取 取斜带石斑鱼的脑及眼组织 100mg ，参照 RNA 提取 试剂盒说明书提取总RNA。 1.2.3 RT-LAMP扩增体系的优化 在RNA扩增试剂盒说明书基础上优化建立本研究的 扩增体系，针对鱼神经坏死病毒衣壳蛋白保守区的不同 位置设计了5组引物，以提取的被感染石斑鱼总RNA为模 板63 ℃恒温反应60 min，选择特异性最好的一组引物； 进一步选择最佳的恒温条件和最优的反应时间。 67
摘 要 利用反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）建立一种方便、快捷的石斑鱼神经坏死病毒（NNV）检 测方法。根据石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列的保守区设计5组特异引物，提取斜带石斑鱼的总RNA，利 用RT-LAMP技术比较5组引物的敏感性和特异性，同时对反应温度和反应时间进行优化，并对现场20尾鱼苗进行 了检测。结果表明：筛选出一组高特异性的引物，在61 ℃条件下恒温反应20 min可以完成检测；在反应试管中 添加钙黄绿素，可利用荧光反应现象进行结果判定，且对9种常见鱼类病原微生物无交叉反应；对20尾鱼苗进行 了现场检测，检测结果与RT-PCR结果一致。本研究成功建立起石斑鱼神经坏死病毒RT-LAMP检测方法，方法特 异性强、反应时间短、操作简单，为进一步推广该技术在现场大规模的应用奠定了研究基础。 关键词 石斑鱼；神经坏死病毒；RT-LAMP；检测方法 中图分类号：S943 文献标志码：B DOI：10.19415/ki.1673-890x.2017.32.040
１．２ 方法
1.2.1 引物设计 参照斜带石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序 列（ GenBank: AF245004.1 ），依据 LAMP 引物设计原 则，使用在线引物设计软件 PrimerExplorer V5 （ http:// primerexplorer.jp/e/），共合成引物5组，每一组包括4条 引物（BIP、FIP、B3、F3），并针对第四组引物设计了 Loop引物（Loop F和Loop B），第四组引物序列见表1。
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翟伟锋 ，殷 波：石斑鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测方法的建立
1.2.4 荧光试验 在恒温反应前加入猝灭状态的钙黄绿素，反应结束 后，有发生LAMP反应的样品可以在紫外灯下看到荧光。 1.2.5 灵敏度实验 LAMP 法具有灵敏度高的特点，本研究将提取的总 RNA分别稀释至10 、10 、10 、10 和10 ，并以稀释后 的样品为模板进行反应。 1.2.6 特异性实验 选取9种常见鱼类病毒的核酸，并分别提取了核酸， 依照上述优化的条件在61 ℃恒温反应20 min，进行特异 性检测。 1.2.7 现场应用检测 从鱼苗养殖场中随机抽取 20 尾鱼苗，分别采用本 研究的 RT-LAMP 法对比 RT-PCR 法，检测 RT-LAMP 的 准确性。