病毒载量检测方法及其意义

COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR实验包 括以下步骤： ? 样本制备 ? 靶RNA的逆转录产生cDNA ? 用HIV-1特异互补引物进行靶cDNA PCR扩增 ? 通过比色进行与探针结合的扩增产物的测定
? COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR 试剂 对HIV-1病毒RNA的定量检测是采用HIV-1定 量标准品来完成的。HIV-1定量标准品是包括 作为HIV-1靶RNA引物结合部位和HIV-1扩增 子单一探针结合区的非感染性RNA转录物。 将已知拷贝数的HIV-1定量标准品加到每一个 样本中和HIV-1靶序列一起共同进行样本制备、 逆转录、PCR扩增、杂交和检测。COBAS
可扩增HIV-1 M组的A-G亚型。
NucliSens 核酸分析系统利用三项技术： ?专利的BOOM核酸提纯技术:手 工 manual
半自动miniMAG 自 动 easyMAG ? “扩增RNA”的NASBA技术 ?使用荧光分子信标（molecular beacon)对扩 增产物的实时检测技术
三种病毒载量检测技术比较
毫升。 ? 高于500,000HIV-1 RNA拷贝/毫升的样本位于检测的最高定
量限以上，必须适当稀释以获得确切的量值。在人血浆中稀 释高浓度样本，稀释用血浆需经VERSANT HIV-1 RNA3.0 Assay (bDNA) 检测鉴定不含HIV-1 RNA，按照实验流程重 新检测，得出的结果乘以稀释倍数以确定初始样本的病毒载 量。
? NucliSens EasyQ HIV-1实验 是使用NASBA技术的靶扩增试验。NASBA技术选 择性地直接扩增RNA而没有PCR步骤，用2个寡核苷酸引物、3个酶、三磷酸脱 氧核苷和合适的缓冲液进行一步夹心杂交。首先用异硫氰酸胍和氧化硅颗粒提取 高纯度RNA，RNA通过重复的合成和转录双链DNA中间体得到扩增。在AMVRT的作用下，HIV-1gag区的引物P1介导由标本RNA合成cDNA，RNA链被 RNAse降解。引物P2结合启动第二条DNA链合成，反义RNA通过T7多聚酶启动 双链DNA合成，这个循环不断重复，使得靶RNA在等温条件下大量扩增100万到 1000万倍，然后直接用化学发光法确定核酸量，通过HIV特异的gag和pol区的3 个内标同时扩增而达到定量目的。它具有高度敏感性和广阔的动态范围。 最近 NucliSens HIV-1定量实验有了较大改进，将NASBA核酸扩增技术与实时(realtime)检测技术结合起来,能够对检测进行实时监控。结果表达方式由每毫升标本 的拷贝数（cp/ml）改变为每毫升国际单位（IU/ml）。
bDNA方法(分枝DNA杂交试验) NASBA(核酸序列扩增试验) Cobas Amplicor HIV-1 Monitor(逆转录聚合酶链反应) 荧光定量PCR
? bDNA 是一种夹心式的核算杂交反应过程，用于直接定量检测血浆中HIV-1 RNA 的含量。首先，通过离心将血浆中的HIV-1 富集起来。HIV-1 病毒基因组RNA从 病毒颗粒中释放出来后，首先会被一组合成的寡核苷酸探针又称捕获探针所结合 并连接在微孔板上，然后通过另外一些靶定探针使病毒RNA与预放大探针结合。 捕获探针包括十七个可与基因组特异结合的捕获位，靶定探针包括81个可与基 因组特异结合的靶定区，分别靶定在病毒RNA pol 基因的不同区段。放大探针结 合到预防大探针上，从而形成支链DNA复合体。随后多拷贝的碱性磷酸酶（AP） 标记的探针与该复合体杂交结合。与化学发光底物共同孵育，所产生的光强度与 样品中HIV-1RNA的量成正比，以相对光强度单位（RLUs）表示的光度值被分 析系统记录下来，试剂盒中含有已知浓度的经β-丙内酯（BPL）处理的HIV18E5/LAV病毒液作为标准品，根据标准品的光吸收值绘制标准曲线，样品中 HIV-1 RNA的量可对照标准曲线求得。
硅胶固相吸附 ?异硫氰酸胍裂解，提纯效率高，核酸 纯度高，操作可见 ?可与全自动核酸提取仪配套使用，提 纯效率高，操作简便
COBAS Amplicor HIV-1 Monitor 1.5
扩增：RT-PCR 检测：底物显色 先扩增再检测
普通方法：400-750,000 Copies/ml 超敏方法：50-75,000 Copies/ml 线性范围有限，高浓度 样本需稀释检测，超敏 方法需要用低温超速离 心机离心1个小时
病毒载量检测方法及检测意义
新疆疾病预防控制中心 佐合拉.吐尔地 2012-05-16 伊宁市
? 病毒载量（viral load）代表的是病毒的负荷， 即体内复制的病毒的数量。实际上，体内复 制的病毒的数量是不能直接测量的，一般用 每毫升血浆中HIV RNA的拷贝数代表HIV的 病毒载量。
一、通常的病毒载量测定方法
扩增HIV-1 M组的A-H亚型。
? 本实验系统检测的定量范围为50至500,000HIV-1 RNA拷贝 /ml。
? 检测结果以如下形式报告： ? 低于最低定量限的值报告为“<50” HIV-1 RNA拷贝/毫升。 ? 在最低定量限和最高定量限之间的值报告为实际检测值。 ? 高于最高定量限的值报告为“>500,000” HIV-1 RNA拷贝/
厂家 商品名 扩增和检测原理 线性范围
核酸提取
bioMerieux
Roche
Simens(Bayer)
Nucwk.baidu.comisens Easy Q
扩增：NASBA 检测：Real Time. Molecular Beacon 实时扩增检测
50-3,000,000IU/ml(v1.1) 线性范围广，无需稀释标本重复检测， 报告国际单位，易于统一标准 25-10,000,000IU/ml(v2.0)
AMPLICOR 分析仪根据HIV-1定量标准品的 数据计算每一个样本的HIV-1RNA 的含量。 可扩增HIV-1 M组的A-H基因亚型。
? 标准试验：能够定量400-750000拷贝/毫升的 HIV RNA，需要0.2毫升血浆。
? 超敏试验：能够定量50-75000拷贝/毫升的 HIV RNA,需要0.5毫升血浆。