猪链球菌2型二元信号转导系统ciaR基因敲除突变株的构建及生物学功能研究

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猪链球菌2型毒力相关因子研究进展

猪链球菌２型毒力相关因子研究进展
朱僧，孙长江，雷连成，文瑜韩
（吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春，３０２１０６）摘要：猪链球菌２型是在世界范围内影响养猪业和人类健康的一种重要的人兽共患传染病。猪链球菌２型毒力因子在致病过程中发挥了重要的作用。但是对猪链球菌２型的致病机制和关键毒力因子仍然不确定，使
以诱导细胞发生２种典型的形态学变化：诱导细胞融合成多核细胞，然后巨噬细胞发生凋亡；诱导单个细胞凋亡。投射电镜和流式细胞仪分析证明ＭＰ具有诱导上皮细胞凋亡的功能（Ｒ凋亡率达到
通讯作者，，男博士，授。主要研究方向．Ｙ教ｙ子细菌学与分子免疫学。Ｅｍｉｈｎｙｌ．ｄ．Ｉ — ａ：ａｗ＠ｊｅｕＣ。ｌｕ１
河北科技师范学院学报
第２４卷第４期，００年１２１２月
Ｊｕｎ１ｆＨｅｅｒｏｒａｏｂｉＮｏｍ￣ＵｎｖｒｉｆＳｉｎｅ＆Ｔｃｎｌｇ１２．ｅ００．ｉｅｓｔｏｃｅｃｙｅｈｏｏｙＶｏ．４Ｎｏ４Ｄｃ２１
猪链球菌２ＳｅｔｏｃｉｓｏｐＳ２被认为是猪链球菌３个血清型（ — ４型和１２型（ｔｐｏｃｓｕｅｔｅｒｃｕｓｓｒｙ２，Ｓ）５１３／型）中分布最广致病性最强的一个血清型，以引起断奶仔猪的脑膜炎、可支气管肺炎、败血症、关节炎等，而且Ｓ２是可以引起人类感染的病原体，别是那些与猪或者猪肉制品紧密接触的人群【。Ｓ２感Ｓ特ｌＳＪ

2型猪链球菌gene0969基因敲除突变体的构建及毒力分析

方法搭建３个片段，克隆到自杀载体ｐＥ４并ＳＴｓ上，建基因敲除载体，过同源重组构建ｇｎ０６构通ｅｅ９９突变体，用小再
鼠感染模型对突变株和野生株的毒力进行比较。结果：得了ｇｎ０６获ｅｅ９９基因敲除突变体，发现其毒力与野生型相并
生
ＬＥＴＦＳＩＢＯＴＨＮＯＬＹＶ１１ｏ３ＥＲＮＩＥＣＯＧｏ．Ｎ．２Ｍａ，２１ｙ００
物
技
术
通
讯
３７４
ｄｉ１３６／ｉｎ０９０２００３１ｏ０９９ｊｓ１－０．１．．２：．．．００２００ｓ
１ｏｌｇｆＦｏｃｅｃ＆Ｔｃｎｌｇ，ＨｕｚｏｇＡｇｉｕｔｒｌＵｉｅｓｔ，Ｗｕａ３００．ＣｌｅｏｏｄＳｉｎｅｅｅｈｏｏｙａｈｎｒｃｌａｎｖｒｉｕｙｈｎ４０７；２ｔｔＫｙＬｂｒ－．ＳａｅｅａｏａｔｒｆＰｔｏｅｎｏｅｕｉ，Ｉｓｉｔｏｃｏｉｌｇｎｐｄｍｉｌｇ，Ａｃｄｍｙｏｌａｄｃｅ — ｏｙｏａｈｇｎａｄＢｉｓｃｒｙｔｎｔｕｅｆＭｉｒｂｏｏｔｙａｄＥｉｅｏｏｙａｅｆＭｉｔｒＭｅｉａＳｉｉｙｌ
比有下降趋势。结论：２型猪链球菌假想毒力因子ｇｎ０６ｅｅ９９可能与毒力有关，作用和机制值得进一步分析。其

猪链球菌2型中国强毒株05ZYH33 ofs 基因敲除突变株构建及其生物学特性研究

（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｅｄｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＷｅｎｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｎｚｈｏｕ３２５０３５，Ｃｈｉｎａ；
中国人兽共患病学报
２０１４，３０（３）
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｏｏｎｏｓｅｓ２２３
ＤＯＩ：１０３９６９／ｃｊｚ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００２—２６９４．２０１４．０３．００１
生物学功能实验研究比较ｏｒｓ突变株和野生株０ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ５ＺＹＨ３３在革兰氏染色、菌落溶血活性、生长速率和毒力等方面的差异。结果
组合ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＤＮＡ测序结果均证实ｏｆｓ基因敲除突变株０５ＺＹＨ３３Ａｏｆｓ构建成功，体外实验结果显示ｏｆｓ基
猪链球菌２型中国强毒株０５ＺＹＨ３３ｏｆｓ基因敲除突变株构建及其生物学特性研究
李敏，王晶。，史沛举。，郭静静，杜骁杰，李先富，王长军。，潘秀珍～，高基民
摘要：目的探究猪链球菌血清浑浊因子ｏｆｓ基因在强致病性２型猪链球菌致病过程中的作用。方法利用同源重组

猪链球菌2型溶血素基因缺失株构建及其生物学特性分析

（江大学动物预防医学研究所，江省动物预防医学重点实验室，江杭州３０５）浙浙浙１０８

摘
要：链球菌溶血素（Ｌ是较早确定的猪链球菌毒力因子之一，有细胞毒性，猪链球菌致病猪ＳＹ）具在
粒ｐＥ４：ｃｔＳｙ根据ＮＢ上猪链球菌２型ＳＴＳ：ａ— ｌ：ＡＣＩ
Ｐ／１７标准株的基因（Ｃ０２２．）的Ｓｙ序列Ｎ一１９５１中ｌ（２８Ｏ —２２１）计引物（１。ＰＲ反应条１５９２１６８４设表）Ｃ件及体系：Ｏ１ ×ｂｆｅＬ１ｕｆｒ３“ ，０ｍｍｏ／ＮＴＰ１０ｌＬｄ．／上游引物１０ｕ下游引物１０／ｔｍｐａｅ，Ｌ，．Ｌ，．，ｅｌｔＬ，
猪链球菌２型（ｔｐｏｏｃｓｕｓ２Ｓ）猪Ｓｒｔｃｃｕｉ，Ｓ２是ｅｓ链球菌各个血清型中毒力最强、行最广泛的血清流
防医学重点实验室保存；心浸出液培养基（ｒｉ脑Ｂａｎ
ｈａｔｉｆｓｏｅｒｎｕｉｎ，ＢＨＩ，ｙｔｎ）Ｔｒｐｏｅ和Ｙｅｓｘｒｃｉｎａｔｅｔａｔｏ
动物医学进展。０２３（）２ — ６２１，３５：２２
ＰｒｇｒｓｎＶｅｅｉｒｅｉｉｏｅｓｉｔｒｎａｙＭｄｃｎｅ
猪链球菌２型溶血素基因缺失株构建及其生物学特性分析

猪链球菌2型毒力因子研究进展

猪链球菌2型毒力因子研究进展摘要：猪链球菌是重要的人兽共患病，尤以猪链球菌2型最为流行。

通过对猪链球菌2型毒力因子的研究，已确定几种主要毒力因子，研究中又发现几种新型的毒力因子，期望从这些毒力因子当中发现它们的功能及其相互关系，揭开猪链球菌感染的神秘面纱，进而控制猪链球菌病的发生。

关键词：猪链球菌2型；主要毒力因子；新型毒力因子猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是世界范围内引起猪链球菌病最主要的病原，也是重要的人畜共患病病原体，根据菌体荚膜多糖抗原性的不同，分为35个血清型（1—34型，1/2型）[1,2]。

可以引起猪的脑膜炎、关节炎、败血症、心内膜炎、肺炎、流产、多浆膜炎及人的急性脑膜炎、永久性耳聋、感染性中毒性休克综合症等疾病，严重的可导致死亡[1,3,4]。

主要致病血清型为SSl、SS2、SSl／2、SS7、SS9和SSl4，其中以SS2流行最广、致病性最强[5]。

我国发生的猪链球菌病主要由C群和D群引起。

由猪链球菌2型引起的猪链球菌病，过去在欧洲、南亚、北美一些国家流行比较多，但近些年在我国也时常发生。

国内1991年在广东省首次分离鉴定到SS2；1998年我国江苏发生的猪链球菌2型引起的链球菌病造成几十人感染，十余人死亡；2005年在四川发生的猪链球菌2型引起的链球菌病导致206人感染，38人死亡；2006年9月，广西某猪场发生由猪链球菌2型引起的链球菌病，导致多头猪只死亡，所幸无人感染。

由于猪链球菌2型引起的链球菌病属人兽共患病，死亡率较高，不仅可造成巨大的经济损失，而且给公共卫生带来严重威胁。

从2007年至2010年，每年暑假我都去猪场实习，发现我所到的几个猪场都将链球菌病列入免疫程序当中，可见人们对链球菌的恐惧并未消除。

SS2存在着强致病力、弱致病力和无致病力菌株。

强致病株引起猪严重的临床症状，并能从中枢神经系统分离出病菌。

弱致病力菌株仅引起温和的临床症状，偶尔能从中枢神经系统分离出该菌。

猪链球菌2型毒力相关因子及保护性抗原研究进展

何永聚～，令伟，祝。冯书章。
中图分类号：８２１文献标识码：Ｓ５６Ａ
猪链球菌是在世界范围内传播的一个重要的人兽共患病原体，引起猪的脑脊膜炎、炎、内膜可肺心
炎、血病、节炎等症状。在已分离的猪链球菌败关３５个血清型中，猪链球菌２型（Ｓ）Ｓ２流行范围最广。１９９８年和２００５年在中国江苏省与四川省暴发了人感染Ｓ２的疫情，别引起１Ｓ分４人和３８人死亡［。１］目前已有报道超过７０人感染Ｓ２的病例，主要０Ｓ且集中在东南亚ｌ。因此Ｓ２严重危害着公共卫生＿２］Ｓ安全，引起了科研人员及公众的广泛关注。已目前已经发现了许多Ｓ２典型的毒力因子，Ｓ其中荚膜多糖是最早被发现的主要的毒力因子，］之
调节因子是在细菌基因表达调控中，各种刺在激信号的影响下通过信号传导能直接或间接地识别
或结合在各顺式作用元件的序列上，与调控靶基参
因转录效率的因子，正调控和负调控。这些因子分
控制着锌和铁的运输。在ＡｒｎａＪ等＿的研究中，ａｄ６］利用鼠模型测定Ｓ２Ｓ △ＡｄＲ和ＡＦｒ缺失株的毒ｃｕ
中发挥着重要作用。
菌各种活动和种间传播方面发挥显著作用。在

猪链球菌2型毒力因子研究进展

（．１华中农业大学动物医学院，湖北武汉４０７；．３００２山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州２６０）５６０
摘要：链球菌２型（Ｓ）一种重要的人兽共患病病原茵，主要毒力因子包括荚膜多糖、茵酶猪Ｓ２是其溶
释放蛋白、血素、溶纤连蛋白结合蛋白、谷氨酸脱氢酶等，是这些经典的毒力因子不足以解释猪链球菌病发但病的临床症状，而且毒力表型往往与实际毒力及临床症状不符。近年来随着研究的深入，鉴定出一系列毒力
相关元件，主要有Ｓｏ蛋白、在于８Ｋ毒力岛的双信号转导系统（ａｋｓｌ、ｄｔ基因、ｇＡ基因、ｒＡａ存９ｓｌ—ａＲ）ｌＡｐｄｓｔ基因、Ｖ型二肽基肽酶（ｉｅｔｙｐｐｉａｅＩ，Ｐ）毒力调控子Ｒ（ｏｔｌｆｉｌｎｅＣｖ、醇ＩｄｐｐｉｌｅｔｓＤＰＩ、ｄｄＶＶｃｎｒｒｅｃｏＲ）烯ｏｏｖｕＲ，
中图分类号：８２４￥５．文献标识码：Ａ文章编号：０７５３（０２０ — １８０１０ — ０８２１）６０１ — ５
猪链球菌２型（ｔｅｔｃｃｕｕｓｓｒｔｐ，Ｓｒｐｏｏｃｓｉｅｏｙｅ２ｓ
抗免疫细胞吞噬过程发挥作用；且无荚膜突变株而接种ＳＦ乳猪不能引起任何症状，明ＣＳ是重要Ｐ说Ｐ的黏附因子。但是，同Ｓ２菌株的ＣＳ成分会有不ＳＰ差异，在制备过程中难获得稳定结构的ＣＳ而且多Ｐ，糖属于非胸腺依赖性抗原，其免疫原性差，为疫苗作

猪链球菌2型强毒株05ZYH33转录调控因子Rgg基因敲除突变体与野生株的基因表达差异分析

２５０ＺＹＨ３３ｇｎｅ，ｅｍｉｒａｒｙｃｏｒａｍｅｈｄｔｏｗａｕｓｄｏｎａｙｅｓｅｔａｌｚｄｉｅｅｔａｌｅｐｒｓｄｅｓｅｗｅｎｈｗｉｄｔａｎｆｒｎｉｌｙｘｅｓｅｇｎｅｂｔｅｔｅｆｌｓｒｉ
ｏｔｇａｓｌｄｓｎｏｌｓｓｉｅ；ｔｍｉｒａｒｙｈｅｃｒａｗａｔｅａｐｌｅｔｄｆｅｅｔａｅｐｅｓｏａａｙｉｂｔｅｒｇｏｋ— ｕｔｔａｎｏｓｈｎｐｉｄｏｉｒｎｉｌｘｒｓｉｎｎｌｓｓｅｗｅｎｇｋｎｃｏｓｒｉｆ
研究报告
猪链球菌２型强毒株０ＺＨ３转录调控因子Ｒｇ５Ｙ３ｇ基因敲除突变体与野生株的基因表达差异分析
王中胜，曾小涛一袁媛，，尉研，玉玲，郑姜永强
１事医学科学院微生物流行病研究所，原微生物生物安全国家重点实验室，京１０７．军病北００１
生８ｌ２
Ｌ１ｒＩＢＯＥＣＥＴＳＮＩＴＨＮＯＯＧＹｖｌ１Ｎｏ０一ｖ，２１ＴＥＲＴＬｏ・一ｏ２Ｉ２－Ｎ．００・．，・ＵＵ，
．
技
术
通
讯
…
ｄ：０９９．ｎ０９０２０．．５ｏ１３￣ｉ．０—０．１００ｉ．６ｓ１ｓ０２０６１
２．华中农业大学食品科技学院，北武汉４０７湖３００

猪链球菌2型溶血素基因缺失株构建及其生物学特性分析

猪链球菌2型溶血素基因缺失株构建及其生物学特性分析吴炜;张晓燕;唐宇龙;方丽华;方维焕【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2012(033)005【摘要】猪链球菌溶血素(SLY)是较早确定的猪链球菌毒力因子之一,具有细胞毒性,在猪链球菌致病过程中发挥重要作用.利用同源重组技术成功构建了猪链球菌2型(SS2)sly基因缺失的突变株SS2-△sly,缺失株的体外溶血活性消失,对小鼠脑血管内皮细胞的细胞毒性显著低于亲本菌株(P＜0.01),但不影响猪链球菌2型在巨噬细胞中的存活.该菌株可以用于研究SS2溶血素在感染细胞中的作用机制.【总页数】5页(P22-26)【作者】吴炜;张晓燕;唐宇龙;方丽华;方维焕【作者单位】浙江大学动物预防医学研究所,浙江省动物预防医学重点实验室,浙江杭州310058;浙江大学动物预防医学研究所,浙江省动物预防医学重点实验室,浙江杭州310058;浙江大学动物预防医学研究所,浙江省动物预防医学重点实验室,浙江杭州310058;浙江大学动物预防医学研究所,浙江省动物预防医学重点实验室,浙江杭州310058;浙江大学动物预防医学研究所,浙江省动物预防医学重点实验室,浙江杭州310058【正文语种】中文【中图分类】S852.611【相关文献】1.猪链球菌2型溶血素基因缺失菌株的构建及生物学特性的研究 [J], 王雅;张安定;李冉;胡攀;刘成;陈焕春;金梅林2.禽多杀性巴氏杆菌C48-3株hexABC基因缺失株的构建及其生物学特性分析[J], 吾鲁木汗·那孜尔别克;张宇凤;龚凤娟;恩特马克·布拉提白3.单增李斯特菌溶血素S llsB基因缺失株的构建及部分生物学特性研究 [J], 尹华;任静静;王欣雨;蒋建军4.鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因缺失株平衡致死系统的构建及生物学特性分析[J], 张明亮; 孙长江; 顾敬敏; 崔子寅; 韩文瑜5.禽致病性大肠杆菌clpV2基因缺失株的构建及生物学特性分析 [J], 钟昊然;王培莉;郭佳;王亨;朱国强;李建基;崔璐莹;董俊升;孟霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪链球菌2型divIVA基因敲除突变株及其应用[发明专利]

专利名称：猪链球菌2型divIVA基因敲除突变株及其应用专利类型：发明专利
发明人：潘秀珍,倪华,王长军,沈玉洁,胡丹,郑峰
申请号：CN201710776613.8
申请日：20170901
公开号：CN107805619A
公开日：
20180316
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于基因工程领域，涉及猪链球菌2型divIVA基因敲除突变株及其应用。

所述突变株ΔdivIV制备方法为：利用同源重组基因敲除技术将S.suis 2野生株05ZYH33染色体上编码DivIVA蛋白的divIVA基因进行基因敲除，经组合PCR产物电泳、RT‑PCR和DNA测序证实，确定所获得的菌株为基因敲除突变株，命名为05ZYH33ΔdivIVA。

用本发明所述突变株进行动物实验研究其致病性，其结果是对实验动物的毒力显著降低，可应用于研制猪链球菌2型减毒疫苗。

申请人：中国人民解放军南京军区军事医学研究所
地址：210002 江苏省南京市中山东路293号
国籍：CN
代理机构：南京天华专利代理有限责任公司
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2型猪链球菌RevS基因敲除突变株生物学特征及致病性研究

2型猪链球菌RevS基因敲除突变株生物学特征及致病性研究孙雯;郑峰【摘要】比较2型猪链球菌(S.suis 2)ΔRevS突变株和05ZY/H33野生株生物学特性及致病性的差异.首先,通过吸光值测定和革兰染色比较△RevS突变株和05ZY/H33野生株的生长速度和菌体形态.分别对Balb/c及ICR(CD1)小鼠腹腔注射109 CFU·mL-1的05ZY/H33菌液,评估两种品系小鼠对S.suis 2的易感性.分别对Balb/c小鼠腹腔注射2.5×109,5.0×108,1.0×108,2.0×107,4.0×106 CFU·mL-1的05ZY/H33菌液,采用Reed法计算半数致死量.对Balb/c小鼠腹腔注射5.0×108 CFU·mL-1的ΔRevS突变株和05ZY/H33野生株菌液,观察野生株和突变株对小鼠的影响.对仔猪耳缘静脉注射109 CFU·mL-1的05ZY/H33野生株和ΔRevS突变株菌液,观察野生株和突变株对仔猪的影响.体外生物学特征分析表明,与野生株相比,突变株的生长速率和形态染色并未发现显著变化;Balb/c小鼠对S.suis 205ZY/H33的敏感性高于ICR(CD1)小鼠,05ZY/H33对Balb/c小鼠的LD50为4.2×107 CFU·mL-1.Balb/c小鼠攻毒试验结果显示,ΔRevS对小鼠的致病性明显减弱.仔猪攻毒试验结果显示,野生株和突变株都引发仔猪全部死亡,但ΔRevS引发仔猪死亡时间较晚.△RevS突变株保持了菌株的基本生物学特征,但对小鼠和仔猪两种动物模型的致病作用差异较大.%Compare the biological characteristics and pathogenicity difference between △ RevS mutant and 05ZY /H332 wild strains of S.suis 2.First of all,compare the grow th rate and bacterial morphology between △ RevS mutant and 05ZY /H332 wild strains by absorbance measurement and gram stain.To evaluate the susceptibility of different strains,Balb/c and ICR (CD1) mice were injected intraperitoneally with 109 CFU · mL 05ZY/H33 solution. Balb/c mice were injectedintraperitoneally with 2.5 × 109,5.0 × 108,1.0 × 108,2.0 × 107,4.0 × 106 CFU · mL - 105ZY /H33 solution,then Reed method was used to calculate LD50.To study the effects of wild and mutant strains on mice,Balb/c mice were injected intraperitoneally with 5.0 × 108 CFU · mL- 1 Δ Rev S solution and 05ZY /H33 solution.To study the effects of wild and mutant strains on piglet,piglets were injected intraperitoneally with 109 CFU · mL - 105ZY/H33 solution and Δ Rev S pared with wild strains,the growth rate and morphology of the mutant were not significantly changed. The sensitivity of Balb/c mice to S.suis 205ZY/H33 was higher than ICR(CD1) mice,LD50 of 05ZY/H33 to Balb/c mice was 4.2 × 107 CFU · mL - 1.The poison test results on Balb /c mice showed the pathogenicity of Δ Rev S mutant was obviously decreased.The poison test results on piglets showed that both wild strains and mutant strains caused the death of piglets,but the time of death of Δ RevS mutant was later.The Δ RevS mutant strains maintained the basic biological characteristics of the strain,but the pathogenic effect of the two animal models of mice and piglets was significantly different.【期刊名称】《安徽大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(042)001【总页数】8页(P86-93)【关键词】猪链球菌2型(S.suis2);二元调控转导系统;生长曲线;动物模型;半数致死量【作者】孙雯;郑峰【作者单位】扬州科技学院医学院,江苏扬州 225000;中国人民解放军南京军区军事医学研究所,江苏南京 210002【正文语种】中文【中图分类】R182摘要:比较2型猪链球菌(S. suis 2) ΔRevS突变株和 05ZY/H33 野生株生物学特性及致病性的差异.首先，通过吸光值测定和革兰染色比较△RevS突变株和05ZY/H33 野生株的生长速度和菌体形态.分别对 Balb/c 及 ICR(CD1)小鼠腹腔注射109 CFU·mL-1 的05ZY/H33 菌液，评估两种品系小鼠对 S. suis 2 的易感性.分别对 Balb/c 小鼠腹腔注射2.5×109,5.0×108,1.0×108,2.0×107,4.0×106 CFU·mL-1的05ZY/H33 菌液，采用Reed法计算半数致死量.对 Balb/c 小鼠腹腔注射5.0×108 CFU·mL-1的ΔRevS突变株和 05ZY/H33 野生株菌液，观察野生株和突变株对小鼠的影响.对仔猪耳缘静脉注射109 CFU·mL-1的 05ZY/H33 野生株和ΔRevS突变株菌液，观察野生株和突变株对仔猪的影响.体外生物学特征分析表明，与野生株相比，突变株的生长速率和形态染色并未发现显著变化；Balb/c小鼠对 S. suis 2 05ZY/H33 的敏感性高于 ICR(CD1)小鼠，05ZY/H33 对Balb/c小鼠的 LD50为4.2×107 CFU·mL-1.Balb/c 小鼠攻毒试验结果显示，ΔRevS对小鼠的致病性明显减弱.仔猪攻毒试验结果显示，野生株和突变株都引发仔猪全部死亡，但ΔRevS引发仔猪死亡时间较晚.△RevS突变株保持了菌株的基本生物学特征，但对小鼠和仔猪两种动物模型的致病作用差异较大.关键词:猪链球菌2型(S. suis 2)；二元调控转导系统；生长曲线；动物模型；半数致死量猪链球菌(Streptococcus suis)属于链球菌属中的二级人兽共患病原菌，按其荚膜多糖抗原性不同分为1～34型和1/2型共35种血清型，其中2型猪链球菌(S. suis 2)不仅可致猪患严重疾病，如关节炎、败血症、脑膜炎及心内膜炎等，还能感染人致死[1].1998 年和2005年我国江苏海安和四川资阳都分别暴发了极其恶劣的S. suis 2感染人的疫情，200多例患者出现链球菌中毒休克综合征(streptococcal toxic shock syndrome，简称STSS)，病死率高达 60%～80%，引发紧急公共卫生事件[2].北京基因组所 Chen 等对2005年四川疫区从STSS患者组织中分离到 S. suis 2 05ZY/H33 和从健康猪组织中分离到的无毒株05HAS68 进行了全基因组测序和功能注释[3]，结果显示，05ZY/H33 中有15个二元信号转导系统(TCSTSs)在病原菌感染宿主的过程中，TCSTSs 操纵细菌对宿主的识别及多种毒力因子的表达[4].笔者课题组试图通过基因敲除、动物模型构建及基因芯片等方法系统研究 TCSTSs 在 S. suis 2 05ZY/H33中的致病作用.吴涛等[5]已对 S. suis 2 05ZY/H33 中其中一对 TCSTSs 编码基因 RevS(2090rr)进行了敲除，成功构建了 RevS 基因敲除突变株(即△RevS)，为深入研究RevS在 S. suis 2 致病中的功能，笔者比较了△RevS突变株和 05ZY/H33 野生株的生物学特性，并建立小鼠和仔猪两种动物致病模型来比较△RevS突变株和 05ZY/H33 野生株的毒力.1 材料和方法1.1 材料S. suis 2 05ZY/H33 野生株分离于2005年四川资阳疫区，RevS 敲除突变株(ΔRevS)由中国人民解放军南京军区军事医学研究所流行病所前期制备；THB(Todd-Hewitt Broth)培养基、壮观霉素抗生素购买于青岛海博生物公司；Balb/c 小鼠(4周龄，(20±1) g，雌性，SPF 级别，合格证号：2016YNB224)、ICR(CD1)小鼠(4周龄，(20±1) g，雌性，SPF 级别，合格证号：2016YNI220)和仔猪(3周龄，(20±1) kg，SPF 级别，合格证号：2016YNP122)购买于扬州大学农学院实验动物中心；10% 犊牛血清购买于 Difco 公司.1.2 方法1.2.1 生长速率比较平板划线法分别在THB 琼脂培养上接种培养05ZY/H33 野生株和△RevS突变株，分别挑取 05ZY/H33 野生株和△RevS突变株若干单菌落接种于 THB 培养液(不含壮观霉素和含壮观霉素)中，37 ℃ 培养过夜，测定 600 nm处的OD600值作为活菌计数.用 THB 培养液将 05ZY/H33 野生株和△RevS突变株菌液稀释成相同浓度后，分别接种于 THB 培养液中，每隔1 h分别取两种菌液测定 OD600，然后以细菌培养时间为横坐标，以 OD600为纵坐标，比较两种菌株生长曲线的差别(每个菌株设3管重复，计算平均值).1.2.2 革兰染色比较根据上述绘制的细菌生长曲线，分别将05ZY/H33野生株和△RevS突变株接种于THB 培养液(含10% 犊牛血清)中培养至对数期，对这两种菌液分别进行挑菌、干燥固定和革兰染色，用光学显微镜观察两种细菌的染色形态.1.2.3 不同品系小鼠敏感性试验将 S. suis 2 05ZY/H33 野生株以划线法接种于脱纤维羊血 THB 琼脂平板上，37 ℃ 培养 18 h，挑取若干单菌落接种于THB 培养液(含10% 犊牛血清)中37 ℃ 培养24 h，稀释(1∶50)后转接于THB 培养液(含10% 犊牛血清) 37 ℃ 再培养 8 h.血细胞计数器进行活菌记数，确定具体菌量.计数后的菌液分别对 Balb/c 小鼠及ICR(CD1)小鼠各20只进行腹腔注射 0.5 mL 菌液，另取 Balb/c 及 ICR(CD1)小鼠各20只腹腔注射无菌THB 作为空白对照.每日4次观察小鼠精神状况和临床表现，并做记录.选取症状严重的小鼠，尾静脉采血，进行细菌血培养.1.2.4 Balb/c 小鼠半数致死量(LD50)测定按上述方法处理 S. suis 2 05ZY/H33 野生株菌液，血细胞计数器进行活菌记数后，用THB 培养液(含10% 犊牛血清)进行5倍比稀释，共稀释4次，形成2.5×109，5.0×108，1.0×108，2.0×107，4.0×106 CFU·mL-1 5个浓度梯度.选取60只Balb/c 小鼠，随机等分成6组，1～5组分别腹腔注射2.5×109，5.0×108，1.0×108，2.0×107，4.0×106 CFU·mL-1 5个稀释度的菌液，每只 0.5 mL；第6组注射无菌 THB 液体培养基，每只 0.5 mL，作为空白对照组.每天观察4次，连续观察两周，做记录.采用 Reed-Muench 计算法[15]计算细菌对 Balb/c 小鼠的半数致死量LD50.1.2.5 05ZY/H33和ΔRevS对 Balb/c 小鼠攻毒试验按上述方法分别处理 05ZY/H33 野生株和ΔRevS突变株菌液，分别用血细胞计数器进行活菌计数，使用无菌 THB 培养液(含血清)分别对野生株和突变株菌液进行稀释，使菌液浓度大于1.0×108 CFU·mL-1.选取30只 Balb/c 小鼠，随机等分成3组，第1组小鼠腹腔注射稀释后的 05ZY/H33 野生株菌液，每只 0.5 mL，第2组小鼠腹腔注射稀释后的ΔRevS突变株菌液，每只 0.5 mL；第3组小鼠腹腔注射相同体积的 THB 作为空白对照组.每天观察4次，连续观察两周，做记录.选取症状严重的小鼠，尾静脉采血，进行细菌血培养.1.2.6 05ZY/H33和ΔRevS对仔猪攻毒试验按上述方法处理处理 S. suis 2 05ZY/H33 野生株菌液，血细胞计数器进行活菌计数，将菌液离心浓缩后用灭菌 THB 培养液(含血清)重悬，分别稀释成1×1010，1×109，1×108，1×107 CFU·mL-1 几个不同浓度，然后分别对仔猪耳缘静脉注射进行预实验，发现当 05ZY/H33 野生株菌液浓度为1×109 CFU·mL-1 时，仔猪的临床症状最接近临床发病仔猪症状，故采用1×109 CFU·mL-1作为仔猪攻毒浓度.分别将 05ZY/H33 野生株和ΔRevS突变株的菌液浓度调整至大于1.0×109CFU·mL-1.购买的18只仔猪，随机分成3组.第1组仔猪耳缘静脉注射 109 CFU·mL-1 的 05ZY/H33 野生株菌液，每只1 mL；第2组仔猪耳缘静脉注射109 CFU·mL-1 的ΔRevS突变株菌液，每只1 mL；第3组为空白对照，每只耳缘静脉注射灭菌 THB 1 mL.每日4次观察仔猪的临床表现及死亡情况.对死亡仔猪立即进行解剖，无菌采集肝脏、心血组织进行细菌分离培养及鉴定.2 结果2.1 生长速率比较05ZY/H33 野生株和△RevS突变株生长曲线如图1所示.图1 05ZY/H33 野生株和△RevS突变株与的生长曲线图1显示，两者生长速率相近，分别经历3 h迟缓期后进入对数生长期，培养10 h后进入稳定期.2.2 革兰氏染色分别挑取对数生长期的 05ZY/H33 野生株和△RevS突变株菌液进行涂片、干燥、固定和革兰染色、油镜观察，结果见图2.图2 05ZY/H33 野生株(A)和△RevS突变株(B)革兰染色镜检图2显示，两者均为革兰染色阳性链状排列球菌，差别不大.2.3 不同品系小鼠对 S. suis 2 05ZY/H33 的敏感性血细胞计数器活菌记数显示，此次攻毒的细菌浓度约为2.5×109 CFU·mL-1.Balb/c 实验组和空白组、ICR(CD1)实验组和空白组小鼠的临床表现见表1.图3中可看出 Balb/c 小鼠对 S. suis 2 05ZY/H33 的敏感性明显高于 ICR(CD1)小鼠(p<0.05)，故将选择 Balb/c 小鼠作为动物模型.发病小鼠尾静脉血细菌培养和鉴定结果确定组织标本中的细菌是 S. suis 2 05ZY/H33，提示腹腔中的 S. suis 2 能够进入小鼠血循环.表1 攻毒后 Balb/c 和 ICR(CD1)小鼠临床表现组别攻毒时间及临床表现12h24h48h72h及以后Balb/c实验组16只死亡,4只失去行动能力小鼠全部死亡——————Balb/c空白组健康健康健康健康ICR实验组2只死亡,18只精神不佳、皮毛倒逆、眼部化脓2只死亡,16只精神开始好转,眼部化脓症状开始减轻16只眼部化脓症状全部消失,基本恢复健康16只全部恢复健康ICR空白组健康健康健康健康图3 Balb/c 和 ICR(CD1)小鼠攻毒后死亡情况2.4 Balb/c小鼠半数致死量(LD50)计算参考 Reed-Muench 法计算得出 S. suis 2 05ZY/H33 对 Balb/c 小鼠的半数致死量(LD50)为4.2×107 CFU(见表2).表2 Balb/c小鼠死亡情况组别动物数/只攻毒剂量/CFU攻毒后确认小鼠死亡数量/只1d2d3d4d5d6d7d死亡数合计/只死亡率/%1101.25×1098200000101002102.50×1088011000101003100.50×108600 11008804101.00×1070000000005102.0×106000000000610THS000000000 2.5 05ZY/H33 和ΔRevS对 Balb/c 小鼠攻毒试验比较通过5倍比稀释，活菌记数显示，05ZY/H33 与ΔRevS菌液浓度为5.0×108 CFU·mL-1达到半数致死量(见图4).图4 Balb/c小鼠死亡情况由图4可以看出， 05ZY/H33 实验组小鼠全部死亡，ΔRevS实验组小鼠1只死亡(p<0.05)，空白对照组小鼠没有死亡.两组发病小鼠尾静脉血细菌培养和鉴定结果确定组织标本中的细菌分别是 05ZY/H33 野生株和ΔRevS突变株，提示两组细菌均可通过腹腔进入小鼠血循环.2.6 05ZY/H33 和ΔRevS对仔猪攻毒试验比较通过预实验发现，当 05ZY/H33 菌液浓度为1×109 CFU·mL-1 时，仔猪的临床症状最接近临床发病仔猪症状，故将 05ZY/H33 与ΔRevS菌液浓度调整为1.0×109 CFU·mL-1.05ZY/H33 实验组仔猪、ΔRevS实验组仔猪和空白组仔猪的临床表现见表3所列.05ZY/H33野生株和ΔRevS突变株对仔猪攻毒的成活结果如图5所示.表3 攻毒后仔猪临床表现组别攻毒时间及临床表现12h24h48h72h96h120h05ZY/H33实验组6只体温迅速升高,4只倒地不起6只完全瘫痪,4只死亡全部死亡—————————ΔRevS实验组食欲减退,精神萎靡喜跪,喜卧,体温升高体温迅速升高,食欲进一步减退,后腿出现红肿,站立不稳体温升高、倒地不起,关节出现红肿,呼吸困难,出现腹式呼吸出现划水状的神经症状,气息微弱,后肢关节明显肿胀,4只死亡出现抽搐的神经症状,全部死亡空白组健康健康健康健康健康健康图5 05ZY/H33 野生株和ΔRevS突变株对仔猪攻毒试验比较由图5可以看出，05ZY/H33 实验组和ΔRevS实验组仔猪全部死亡，空白对照组仔猪没有死亡，但 05ZY/H33 实验组仔猪 48 h 全部死亡，ΔRevS实验组仔猪 96 h 出现死亡，120 h 全部死亡.解剖、组织器官细菌培养及鉴定显示，死亡仔猪的腹股沟和肠系膜淋巴结严重肿大并出血，肠壁点状出血，肺、肝、肾淤血，脾脏边缘坏死.野生株和突变株均在死亡仔猪的淋巴结、心、肺、肾、肝、脾及脑脊液等部位存在.3 讨论笔者通过比较△RevS突变株和 05ZY/H33 野生株的生长速度和革兰染色特性，发现两种菌株没有明显差异，因此 RevS 基因的缺失可能不会影响 S. suis 2 的基本生物学特性.国外报道提到，不同品系的小鼠对致病性 S. suis 的敏感性不同，即使同一品系的小鼠其敏感性也不一定相同[6-7].Kataoka 等[8-9]指出 ICR(CD1)小鼠对 S. suis的敏感性较差，Gottschalk M 的观点则完全相反[10]，这可能是由于小鼠饲养环境和菌株来源的差异所致.鉴于国内外均有 Balb/c 小鼠和 ICR(CD1)小鼠对 S. suis 较敏感的报道[11-12]，且两者均属于国内常用实验小鼠，故在该研究中选取Balb/c 小鼠和 ICR(CD1)小鼠这两种品系测试对 S. suis 2 05ZY/H33 的敏感程度.结果显示，该攻毒实验中，Balb/c 小鼠比 ICR(CD1)小鼠表现出对 05ZY/H33更敏感的特点.这可能是因为 ICR(CD1)小鼠的生长速度快，随着日龄的增加，敏感性变化较大，而 Balb/c 小鼠生长速度缓慢，在一段时间内敏感性则较为稳定.笔者接着选取 Balb/c 小鼠作为模型动物，并参考了 Beaudoin[13]建立的标准化猪链球菌小鼠致病模型，攻毒前对 Balb/c 小鼠的日龄、05ZY/H33 菌株培养时间、培养基中是否添加血清等细节进行参数评估，最终得出最佳攻毒方案.评估显示，培养时间对细菌毒力影响较大，这与Beaudoin等[13]的报道一致.相比于 PBS，用 THB 培养液对细菌稀释效果更好.此外，培养基中添加 10% 的犊牛血清，细菌毒力会更强.之前多数小鼠模型的建立者认为小鼠能够模拟猪或人的感染，从而有效区分 S. suis 强、弱毒株，Vecht 研究小组[14]却发现，猪链球菌对小鼠和猪的致病性有时完全不同，小鼠和猪的器官损伤差异也较大，并推测 S. suis 对动物的致病性存在宿主差异性，小鼠模型的可信度并不高.鉴于小鼠模型比较经济方便，可以将小鼠和猪这两种动物模型相结合，更加可行也可信[15].笔者研究的 Balb/c 小鼠攻毒试验结果显示，攻毒剂量为5.0×108 CFU·mL-1时，05ZY/H33 实验组小鼠在 24 h 内全部死亡(而在 Balb/c 小鼠半数致死量测定时，小鼠在 96 h 内全部死亡，这可能是小鼠个体差异性所致)，ΔRevS突变株只导致了1只小鼠的死亡，提示在 Balb/c 小鼠模型中 RevS可能与 S. suis 2 的致病相关.此外，攻毒剂量随着实验动物的种类、大小、年龄等特性的不同而随之变化，鉴于国内外学者所建立的 S. suis 2 仔猪感染模型的攻毒剂量大多在1.0×107～1.0×1010 CFU·mL-1 范围内，笔者首先在仔猪模型预实验中比较了 107，108，109，1010 CFU·mL-1 4个不同浓度，最终发现1.0×109 CFU·mL-1 较为合适.仔猪攻毒试验结果显示，05ZY/H33 野生株和ΔRevS突变株在仔猪致病性上存在相似性，最终都导致仔猪全部死亡.但 05ZY/H33 野生株毒力较强，能引发仔猪在未表现出显著临床症状前急速死亡，而ΔRevS突变株毒力相对较弱，引发仔猪 96 h 才出现死亡，120 h 全部死亡，临床症状明显.综上所述，ΔRevS突变株对小鼠和仔猪两种动物模型的致病作用差异较大.这可能是由于宿主的差异导致 S. suis 2 感染过程中涉及的毒力成分及应对的宿主应答方式不同[16]，在相关文献中也有报道.其次，攻毒方式的不同也可能导致ΔRevS突变株对小鼠和仔猪两种动物致病性的差异，由于 S.suis是一种条件致病菌，只有当猪免疫力下降或应激状态下才会感染此菌[17]，研究者尝试了多种攻毒方式模拟S. suis 的天然感染状态，但结果却不理想[18].S. suis 2 中的 RevS与产气荚膜梭菌(C.perfringens)中VirR/S氨基酸序列同源性很高，VirR/S 在 C.perfringens 中可全面调控溶血素、蛋白酶、磷脂酶C、胶原酶、唾液酸酶、血凝素等多种毒力因子的表达[19].由于 S. suis 2 中也含有上述类似成分，推测RevS在 S. suis 2 中也参与这些毒素组分的调控[20].动物模型可直观评价病原菌中致病因子的作用，但鉴于 S. suis 动物模型存在有效性的争议，该试验结果中两种动物模型的致病表现有必要进行深入探讨.笔者课题组下一步将利用基因芯片技术研究 RevS编码基因敲除后对 S. suis 2中其他毒力蛋白转录的影响，寻找 RevS的调控基因，为揭示 S. suis 2 感染过程中涉及的分子致病机制提供思路.参考文献：[1] ZHANG Y Y, DING D D, LIU M L, et al. 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2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33sao基因敲除突变株的构建及其生物学功能

微生物学通报DEC 20, 2010, 37(12): 1747−1752 Microbiology China© 2010 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@研究报告2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33 sao基因敲除突变株的构建及其生物学功能刘文静1,2潘秀珍1,2*李先富2王长军2唐家琪2(1. 南京师范大学生命科学学院江苏南京 210046)(2. 南京军区军事医学研究所江苏南京 210002)摘要: 构建2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2, S. suis 2)中国强毒株05ZYH33的sao基因敲除突变株。

构建中间为壮观霉素抗性基因, 两侧为sao编码基因上下游同源序列的基因敲除载体, 同源重组筛选sao基因敲除突变株。

PCR、RT-PCR、Western Blot对疑似突变株进行验证, 实验结果均证实sao基因完全被spc抗性基因替代, 成功构建了突变株05ZYH33∆sao。

对野生型菌株和突变株进行菌落溶血活性、生长特性、小鼠致病性比较, 结果表明sao基因的敲除并未使野生型菌株在以上三方面产生明显的变化。

筛选获得的05ZYH33 sao基因突变株为进一步研究sao 基因在05ZYH33致病过程中的作用奠定了基础。

关键词:2型猪链球菌, sao基因, 敲除突变体, 生物特性Construction and Characterization of sao Gene Knock-out Mutant of Streptococcus suis Serotype 2 Chinese HighlyVirulent Strain 05ZYH33LIU Wen-Jing1,2 PAN Xiu-Zhen1,2* LI Xian-Fu2 WANG Chang-Jun2 TANG Jia-Qi2(1. Nanjing Normal University, Nanjing, Jiangsu 210046, China)(2. Institute of Military Medical Sciences, Nanjing Command, Nanjing, Jiangsu 210002, China)Abstract: To construct the mutant strain ∆sao, the recombinant gene knock-out vector was constructed consisting of Spc r cassette with the flanking homology regions of gene sao. The sao gene was replaced by Spc r cassette according to the principle of homologous recombination. PCR analysis, RT-PCR analysis and western blot were used to confirm that sao gene was replaced completely by the Spc r cassette. The results suggested that the mutant of 05ZYH33 sao gene was successfully constructed. Analysis of biological characteristics showed that there were no obvious distinctions in hemolytic activity, growth character-istics and virulence between the mutant and the wild type strain 05ZYH33. The construction of the mu-tant strain 05ZYH33∆sao laid the foundation for father research on the role of sao during infection.基金项目：国家自然科学基金项目(No. 30730081, 81071317, 30972638); 江苏省自然科学基金项目(No. BK2010113, BK2010114, BK2010025, BK2009042); 南京军区医学科技创新课题(No. 07Z045, 09Z040); 南京军区卫生专业人才培养“122”工程资助项目*通讯作者：Tel: 86-25-84507094; : panxiuzhen_2004@收稿日期：2010-06-29; 接受日期：2010-09-301748微生物学通报2010, Vol.37, No.12/wswxtbcnKeywords: Streptococcus suis serotype 2, sao gene, Knock-out mutant, Biological characteristics 作为一种重要的人兽共患病病原体, S. suis 2不仅可以引起猪患败血症、脑膜炎、心内膜炎、关节炎、肺炎和猝死症, 而且也会导致从业人员感染患中毒性休克综合症、脑膜炎及败血症等严重疾病[1−2], 但其具体的致病机制尚不明确。

猪链球菌2型部分毒力基因序列测定及血清学调查分析的开题报告

猪链球菌2型部分毒力基因序列测定及血清学调查分析的开题报告一、研究背景及意义猪链球菌（Streptococcus suis）是一种G+球菌，广泛存在于猪的上呼吸道、口咽部和消化道等。

猪链球菌感染是目前威胁全球猪养殖业健康发展的重要疾病之一，主要症状为败血症、中毒性休克、脑膜炎等。

其中猪链球菌2型（S. suis serotype 2）是所有菌型中最为致病的一种，已被列为人畜共患病菌之一。

S. suis 2型的主要毒力因子包括胞外多糖（CPS）、猪链球菌芽胞杆菌素（SspA）及其编码基因（sspA）等，但其致病机理尚不明确。

因此，对S. suis 2型的毒力基因序列进行测定及血清学调查分析，对研究其毒力因子、致病机制有着非常重要的意义。

二、研究内容1.对S. suis 2型菌株进行分离，筛选并鉴定毒力菌株；2.采用PCR扩增技术对S. suis 2型中CPS和sspA等毒力基因序列进行测定，并进行基础生物信息学分析；3.将SSP和CPS亲合层析纯化，制备多克隆抗体；4.收集猪血清标本，进行血清学调查分析，包括ELISA测定、Western blot，以及间接荧光抗体法等。

三、研究方案1. 菌株分离及鉴定采集猪体内组织样本，通过细胞分离、纯化、鉴定，得到S. suis 2型毒力菌株。

2. PCR扩增及基础生物信息学分析采用PCR扩增技术对S. suis 2型中CPS和sspA等毒力基因序列进行测定，并进行基础生物信息学分析，包括序列比对、多序列比对及功能预测等。

3.SSP和CPS亲合层析纯化，制备多克隆抗体分离纯化S. suis 2型中的CPS和sspA基因所编码产物，通过亲和层析法纯化SSP和CPS蛋白，并制备多克隆抗体。

4.血清学调查分析收集猪血清标本，进行血清学调查分析，包括ELISA测定、Western blot，以及间接荧光抗体法等。

并对结果进行统计学分析。

四、预期结果及意义通过对S. suis 2型的CPS和sspA等毒力基因序列的测定及血清学调查分析，将揭示其毒力因子、致病机制等。

猪链球菌2型IgG结合蛋白的功能研究的开题报告

猪链球菌2型IgG结合蛋白的功能研究的开题报告
研究背景：
猪链球菌是一种常见的革兰氏阳性球菌，可以导致多种疾病，如咽炎、皮肤感染、中耳炎等。

其中，猪链球菌2型常导致严重的侵袭性疾病，包括败血症、肺炎等，是
人畜共患病。

目前，猪链球菌疫苗的研发是防治该病的主要措施。

然而，研究表明，
猪链球菌2型的IgG结合蛋白（GbcC）在菌体的致病性、免疫学逃逸等方面发挥着重要作用，具有很高的疫苗候选物潜力。

因此，对猪链球菌2型的GbcC的功能及其与
宿主免疫系统的互作机制进行深入研究，对开发有效的疫苗具有重要意义。

研究内容：
本研究旨在通过实验室实验和生物信息学分析等手段，揭示猪链球菌2型的GbcC的多种生物学功能和其与宿主免疫系统相互作用的机制。

具体的研究内容包括：
1. 纯化并鉴定GbcC的结构和生物活性。

2. 利用体内和体外实验确认GbcC与宿主细胞的相互作用方式，探究其免疫学逃逸与侵袭性发挥机制。

3. 使用大规模筛选技术，鉴定GbcC的多个抗原表位，为疫苗开发提供支持。

4. 进行生物信息学分析，解析GbcC的模拟数据模型，了解其与其他重要蛋白的相互作用情况，为开发高效疫苗提供理论基础。

研究意义：
本研究可以系统性地探究猪链球菌2型的GbcC的生物学功能和免疫学逃逸等机制，为疫苗的开发和防治流行病提供科学依据，对提高人畜共患病的预防和控制水平
具有重要意义。

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突变株（ｃａ，研究ＡｉＲ的生物学功能。方法和结果基于同源重组原理筛选ｃａ基因缺失株，ＣＡｉＲ）并ｃａｉＲＰＲ分析及Ｓｕｈｒｏｔｅｎ杂交结果均显示突变株构建成功。通过检测Ｏｏ值绘制生长曲线，现突变株在３ ℃ 和４ ℃ 其ＯＤ。值均明显低于野生Ｄｅｏ发７ｏ。株；４ｍｍｏ／与０ｌＬ过氧化氢共作用１ｍｉ涂板计数，变株存活率明显低于野生株；同ｐ值的培养基中培养，现在５ｎ后突不Ｈ发ｐ．Ｈ５０的酸性环境中突变株ＯＤ。值明显低于野生株；生株与突变株对ＢＢｃ鼠攻毒（１１。Ｆ只）各１。野ＡＬ／小约 × ０ｃｕ／，Ｏ只，两组１ｈ后均死亡９只。结论成功获得０Ｚ６５ＹＨ３ｃＲ基因敲除突变株；现删除ｃＲ基因会导致细菌的生长繁殖能力减３ｉａ发ｉａ弱，氧化应激能力下降，酸性环境生长存活能力下降；对小鼠毒力无差别。抗在但
ｎｌｔａｓｕｔｎｓｓｅ１９ＨＫ／０５ａｒｎｄｃｉｙｔｍ０４ｏ１９ＲＲｒｐｔｃｃｕｕｓｓｒｔｐｉｕｅｔｔａｎ０ＺＹＨ３，ｎｏｉｖｓｉａｅｂｏｏｉａｉＳｔｅｏｏｃｓｉｅｏｙｅ２ｖｒｌｎｒｉ５ｎｓｓ３ａｄｔｎｅｔｇｔｉｌｇｃｌ
冯晓丹，程功，王晶。王长军潘秀珍唐家琪。，，，
摘要：的构建猪链球菌２型强毒株０Ｚ目５ＹＨ３３二元信号转导系统１９ＨＫ１９Ｒ的反应调节因子ｃａ基因敲除０４／０５ＲｉＲ
２４１
ＣｈｎｅｅＪｒｌｏｏｎｅｉｓｏｕｎａｆＺｏｏｓｓ
中国人兽共患病学报
２０９，２５（）０３
文章编号：０２６４２０）３２４６１０ —２９（０导系统ｃＲ基因敲除ｉａ突变株的构建及生物学功能研究＊
ＡＢＴＳＲＡＣＴ：ｏｓｒｃｉＲｅｅｄｌｔｎｓｒｉ（ｉＲ）ｉｈｅｃｄｓｔｅｒｓｏｓｅｕａｏｆｔｅｔ — ｏｏｅｔｉ — ＴｏｃｎｔｕｔｃａｇｎｅｅｉｔａｎＡｃａｗｈｃｎｏｅｈｅｐｎｅｒｇｌｔｒｏｈｗｏｃｍｐｎｎｇｏｓ
关键词：链球菌２型；元信号转导系统；因敲除；物特性猪二基生中图分类号：３８１文献标识码：Ｒ７．Ａ
Ｃｏｔｕｔｏｎｄｃｒｃｅｉａｉｎｏｗｏｃｍｐｎｎｔｓｇｌｔａｓｕｔｏｎｓｒｃｉｎａｈａａｔｒｚｔｏｆａｔ — ｏｏｅｉｎａｒｎｄｃｉｎｓｓｅｉＲｅｅｋｎｃ ‘ ｕｕｔｎｔｏｔｅｔｃｃｕｓｓｓｓｒｔｐｅ２ｙｔｍｃａｇｎｏｋｏｔｍａｆＳｒｏｏｃｕｉｅｏｙｐ