溶瘤腺病毒靶向杀灭葡萄膜黑色素瘤的实验研究

中国科学: 生命科学2014年 第44卷 第2期: 151 ~ 157 SCIENTIA SINICA Vitae 引用格式: 刘博, 陈泓宇, 王静宜, 等. 溶瘤腺病毒靶向杀灭葡萄膜黑色素瘤. 中国科学: 生命科学, 2014, 44: 151–157 Liu B, Chen H Y, Wang J Y, et al. Viral therapy using the oncolytic adenovirus H101 to treat uveal melanoma. SCIENTIA SINICA Vitae, 2014, 44:151–157, doi: 10.1360/052013-354《中国科学》杂志社SCIENCE CHINA PRESS中国知名大学及研究院所专栏 上海交通大学医学院专题论 文溶瘤腺病毒靶向杀灭葡萄膜黑色素瘤的实验研究刘博, 陈泓宇, 王静宜, 黄蓉双, 陈颖, 姚玉亭, 宋欣, 徐晓芳, 贾仁兵, 张赫, 葛盛芳*, 范先群*上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科, 上海 200011 * 联系人, E-mail: geshengfang@; fanxq@收稿日期: 2013-10-30; 接受日期: 2013-12-02国家自然科学基金(批准号: 81172323, 31200632, 81372469)、上海市科委基础研究重点项目(批准号: 13JC1406202, 12ZR1417300)、上海市浦江人才计划项目(批准号: 13PJ1405700)和国家大学生创新性实验计划项目资助 doi: 10.1360/052013-354摘要 葡萄膜黑色素瘤是成人最严重的原发性恶性肿瘤之一. 传统的治疗方法, 包括手术、放射治疗和化学治疗效果都不是很理想. 溶瘤腺病毒H101, 能够特异性地在p53突变的肿瘤细胞中复制并杀伤肿瘤细胞, 同时对正常细胞影响较少, 且已由中国国家食品药品监督管理总局批准上市. 为了研究H101对葡萄膜黑色素瘤的治疗效果, 通过体外感染葡萄膜黑色素瘤细胞, 发现H101能够显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖并促进细胞凋亡, 抑制细胞周期, 而对正常的ARPE-19细胞没有影响. 在体内实验中, 建立了SP6.5细胞的荷瘤小鼠模型, 在H101治疗后抑制了肿瘤的生长, 延长了动物寿命. 上述结果表明, 溶瘤腺病毒H101治疗葡萄膜黑色素瘤是一种可行的方法.关键词葡萄膜黑色素瘤 溶瘤腺病毒 H101葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma, UM)是成人最常见的原发性恶性肿瘤之一, 每10万人中就有0.7人发病[1]. UM 起源于眼色素层的色素细胞与神经细胞. 虽然治疗葡萄膜黑色素瘤的手段有所进步, 但全身治疗的高抗性与高转移性导致死亡率仍然居高不下[2,3]. 严重的是, 近50%的葡萄膜黑色素瘤患者为转移性肿瘤[4,5]. 为改善预后, 目前亟需一种新的治疗葡萄膜黑色素瘤的手段.近年来开展了许多基于基因治疗的肿瘤治疗临床试验. 肿瘤抑制性基因治疗、抗血管生成的基因治疗、自杀性基因治疗、修饰性基因治疗和溶瘤腺病毒基因治疗都是常用的治疗肿瘤的手段. 一些靶向基因治疗已经用来治疗皮肤黑色素瘤[6]. 然而, 溶瘤腺病毒治疗UM 的研究报道较少[7~10].随着对病毒认识的加深与分子生物学、基因工程手段的进步, 生产一种相对安全的抗肿瘤的病毒成为了可能. 溶瘤腺病毒正是近年来研究出的用于肿瘤基因治疗的病毒之一[11]. 溶瘤腺病毒H101是人工改造的人5型腺病毒, 该病毒剔除了E3区和E1B 区内55 kD 的片段. 2005年11月由中国国家食品药品监督管理总局批准上市, 目前已有治疗恶性肿瘤的临床报道[12]. E1B 区内55 kD 蛋白的剔除使得H101仅在肿瘤细胞中复制, 而在正常细胞中无法复制. 在缺少的E3区78.3~85.8 μm 基因片段中, 包含了腺病毒致死蛋白和病毒复制增强子, 这种改造降低了腺病毒的毒性, 保证了体内外的安全性. 本课题组前期刘博等: 溶瘤腺病毒靶向杀灭葡萄膜黑色素瘤152工作已研究溶瘤腺病毒H101与达卡巴嗪、长春新碱等化疗药物的联合治疗效果[13,14].本研究尝试探索溶瘤腺病毒H101治疗葡萄膜黑色素瘤的效果, 检测细胞的增殖, 凋亡情况. 在体内实验中观察H101对荷瘤小鼠(Mus musculus )肿瘤的治疗效果.1 材料与方法1.1 细胞系与细胞培养人葡萄膜黑色素瘤细胞株SP6.5, VUP, OCM1和OM431由John F. Marshall 教授(Tumor Biology Laboratory, Cancer Research UK Clinical Center, John Vane Science Centre, 伦敦, 英国)惠赠[15]. 人视网膜色素上皮细胞株ARPE-19由上海交通大学附属瑞金医院眼科惠赠. 人葡萄膜黑色素瘤细胞株SP6.5, VUP, OCM1和OM431采用含10%FBS(fetal bovine serum)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培养基培养, 人视网膜色素上皮细胞株ARPE-19采用含有10%FBS 的DMEM/F12(Dulbecco’s modified Eagle’s medium: nutrient mixture F-12)培养基培养, 置于5%CO 2细胞培养箱中37℃培养.1.2 病毒感染重组人5型腺病毒注射液(H101)购于上海三维生物技术有限公司, 并依据公司推荐条件保藏. H101删除了E1B 区编码55 kD 蛋白的序列和E3区78.3~85.8 μm 的基因片段.细胞接种于6孔或12孔板, 37℃培养过夜. 第2天, 换成无血清培养液, 实验组加入H101(MOI (multiplicity of infection)=10, 50, 100, 200), 对照组加入磷酸缓冲液(phosphate buffer solution, PBS). 2 h 后, 加入等量的20%血清培养液使得血清终浓度恢复到10%.1.3 细胞增殖在处理后的1~4天用CCK-8法(Dojindo, 日本)检测细胞相对存活率, 方法同本课题组前期研究[16].1.4 细胞周期与凋亡检测在感染H101的48 h 后收集细胞, 用70%的冰乙醇固定, 4℃过夜. 第2天, 用预冷的PBS 清洗细胞2次, 室温碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色15 min. 流式细胞仪检测细胞周期.参照操作说明用Annexin V FITC 凋亡检测试剂盒(BD Bioscience, 美国)和流式细胞仪(Becton Dick- inson, 美国)检测细胞凋亡.1.5 蛋白印迹收集细胞并用预冷的PBS 清洗2次. 加入RIPA(radio immunoprecipitation assay)蛋白裂解液, 离心去除沉淀后用BCA 试剂盒(Pierce Biotechnology, 美国)测定蛋白浓度. 蛋白样品由12% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electro- phoresis)胶分离, 使用Bio-Rad 蛋白转印系统(Bio- Rad Laboratories, 美国)转印到PVDF(polyvinylidene fluoride)膜上. PVDF 膜用含有5%脱脂奶粉的TBS (Tris-buffered saline)封闭1 h, 之后一抗孵育过夜. 蛋白条带由Odyssey 红外成像系统(LI-COR, 美国)分析.1.6 PCR参照操作手册使用Applied Biosystems 7500 RT-PCR machine (Applied Biosystems, 美国)与SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa, 日本)检测hexon 基因在细胞中的表达情况. hexon [17]上游引物: 5′-TAACCAGTC- ACAGTCGCAAG-3′; 下游引物: 5′-GTCAAAGTAC- GTGGAAGCCAT-3′. GAPDH [10]上游引物: 5′-GGAT- TTGGTGGTATTGGG-3′; 下游引物: 5′-GGAAGAT- GGTGATGGGATT-3′.反应结束后用分析软件以∆∆C t relative quantit- ation 法分析结果, 以GADPH 作为内参. 设定SP6.5+ H101组为100%, 计算其他组较SP6.5+H101组的hexon 基因相对表达率.使用Ex Taq Mix(TaKaRa, 日本)在GeneAmp PCR System 7900(Applied Biosystems, 美国)进行RT-PCR 反应, 引物和检测对象同上, 反应条件为94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 62℃ 30 s, 72℃ 30 s, 30个循环; 72℃ 10 min. 反应产物琼脂糖凝胶(浓度为1%)电泳检测, 凝胶成像系统分析.1.7 H101体内抗肿瘤实验皮下注射1×107个SP6.5细胞到裸鼠右侧腹下, 制作荷瘤小鼠模型. 为研究溶瘤腺病毒H101的抗瘤效果, 荷瘤小鼠被随机分配到两组, 每组8只. 对小中国科学: 生命科学 2014年 第44卷 第2期153鼠身上的肿瘤分别注射H101和PBS. 首次注射后每2天注射1次, 共注射10次. 从注射当天开始, 每2天用游标卡尺测量肿瘤的长径(A)和短径(B), 皮下肿瘤体积(tumour volume, TV)的计算公式为TV=0.5 ×A×B 2, 根据测量结果计算出肿瘤体积, 并持续观察裸鼠生存状态.1.8 数据统计分析所有细胞有关实验都至少重复3次, 数值以x ±SD 表示, 利用SPSS 19.0软件进行数据统计分析.两组之间差异采用Student’s t -test 双尾检验, 当P <0.05时认为两组间差异显著.2 结果2.1 葡萄膜黑色素瘤对H101的不同敏感度 为了研究UM 细胞对溶瘤腺病毒H101的敏感度, 分别加入MOI 为10, 50, 100和200的病毒感染细胞. 在感染的72 h 后检测细胞存活率(图1), 发现OCM-1和OM431细胞对溶瘤腺病毒相对不敏感, 而SP6.5和VUP 相对敏感. H101的毒性在SP6.5和VUP 细胞中要高于OCM-1和OM431细胞. 在MOI=100或200时, 病毒对UM 细胞的杀伤几乎没有差异. 为了更好地研究H101治疗肿瘤的分子机制, 选择对病毒相对图1 葡萄膜黑色素瘤细胞对溶瘤腺病毒H101的敏感度以MOI 分别为10, 50, 100和200处理细胞, 72 h 后CCK-8法检测细胞存活率. 数据代表3次独立实验的结果. SP6.5和VUP 细胞与OCM-1和OM431细胞相比, *: P ＜0.05敏感的SP6.5和VUP 细胞在MOI=50条件下进行后续研究.2.2 H101仅在葡萄膜黑色素瘤细胞中复制而对正常细胞无影响以人正常视网膜色素上皮细胞APRE-19研究H101是否能在正常细胞中复制. 用RT-PCR 和Western blot 检测病毒基因hexon 在细胞中表达情况(图2). 病毒基因hexon 在UM 细胞中高表达而在ARPE-19细胞中几乎没有表达. 上述结果表明, H101特异性感染肿瘤细胞而对正常细胞没有影响.2.3 细胞周期阻滞为了研究UM 细胞凋亡的机制, 用PI 染色的方法检测了SP6.5和VUP 细胞的周期变化. 48 h 时, H101感染过的细胞有明显的S 期阻滞的现象. S 期占据了将近1/2的周期分布, 同时G1期细胞数量减少. 上述结果表明, S 期可能是病毒复制期, 因为这也是细胞的DNA 复制期.2.4 H101促进葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡用Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测UM 细胞凋亡情况(图3). 72 h 时, H101感染的细胞凋亡细胞数约为对照组的3倍. 在SP6.5细胞中, 凋亡率由5.48%提高到17.02%, 在VUP 细胞中, 凋亡率由4.07%提高到13.79%. 这表明H101显著引起UM 细胞的凋亡.2.5 H101在体内的抗肿瘤效果为了将本研究的发现应用于体内, 制备了SP6.5细胞的荷瘤小鼠. 实验组注射H101, 对照组注射PBS(图4). 与对照组相比, H101治疗组的小鼠肿瘤体积明显较小. H101能够显著地抑制肿瘤的生长. 治疗3周后, H101组肿瘤体积约为PBS 组的1/2. 这说明H101可以在体内抑制肿瘤的生长.3 讨论传统的治疗UM 的方法主要有手术、放射治疗、化学治疗等, 但这些疗法都有一定的局限性, 并且不是特别的有效[3,14,18]. 溶瘤病毒治疗癌症已有百余年的历史, 1912年, DePace [19]首次报道了他的开创性工作, 他们发现在接种减毒狂犬病疫苗后, 宫颈癌瘤体刘博等: 溶瘤腺病毒靶向杀灭葡萄膜黑色素瘤154出现消退. 一个世纪以来, 对溶瘤病毒的研究不断深入, 且有了长足进步, 带有治疗性基因的溶瘤病毒已经能够治疗包括人黑色素瘤、脑瘤等多种肿瘤, 且获得了很好的疗效[20~25].溶瘤腺病毒能够特异性感染并杀伤肿瘤细胞而不感染正常细胞. 过去, 由于技术原因难以获得足够的病毒滴度用于临床治疗. 随着分子生物学与基因工程手段的进步, 病毒的基因组已经能被改造, 能够剔除病毒致病区同时插入增强溶瘤能力的基因[19]. 2005年, 溶瘤腺病毒注射液(H101)由中国国家食品药品监督管理总局批准在中国上市, 成为世界上首个正式进入临床应用的溶瘤病毒制剂[20]. 在临床试验中, 对头颈部鳞状细胞癌、神经胶质瘤和卵巢癌等肿瘤均有较好的疗效和较高的安全性[26]. H101是人重组5型腺病毒, 其删除了E1B 区55 kD 片段使其只能在p53突变的肿瘤细胞中复制[25]. 前期研究证实本课题组使用的UM 细胞均为p53突变型[9]. 本研究发现, 在MOI=50时, H101对UM 具有治疗效果. 对于p53突变的SP6.5和VUP 细胞有显著的杀伤作用, 而对正常细胞ARPE-19几乎没有影响(图2). RT- PCR 和Western blot 的结果也表明, 同ARPER-19细胞相比, H101对SP6.5和VUP 细胞具有明显抑制生长的作用. 由此可见, H101治疗肿瘤在体外是相对安全的.溶瘤腺病毒的复制依赖细胞周期, 并且更倾向于在S 期. 因此, 宿主细胞的S 阻滞更有利于病毒的图2 H101感染后细胞的相对生存率与病毒复制情况A: 在MOI=50时细胞的相对存活率; B: 病毒感染72 h 后RT-PCR 病毒晚期基因hexon 表达情况; C: 72 h 后RT-PCR 检测hexon 基因表达情况; D: 72 h 后Western blot 检测和hexon 蛋白表达情况. SP6.5 vs. SP6.5-H101, VUP vs. SP6.5-H101, ARPE-19 vs. SP6.5-H101, ARPE-19-H101 vs.SP6.5-H101, *: P <0.05; **: P <0.01中国科学: 生命科学 2014年 第44卷 第2期155图3 H101感染SP6.5和VUP 细胞后导致细胞周期阻滞与凋亡A: 流式细胞仪检测SP6.5和VUP 细胞发生细胞周期阻滞, PI 染色. 两株细胞都有明显的S 期阻滞现象; B: 用Annexin V FITC 凋亡检测试剂盒检测SP6.5和VUP 细胞的凋亡情况. 在H101感染后凋亡明显增加. *: P <0.05; **: P <0.01; ***: P <0.001图4 H101在荷瘤小鼠体内抗肿瘤的效果皮下肿瘤由注射SP6.5细胞至裸鼠体内产生肿瘤(8只). 数据以x±SD 表示. ***: P <0.001复制. 在p53突变的细胞中, 一些依赖p53途径的细胞周期调节因子, 如视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblas- toma protein)和有丝分裂阻滞缺失样蛋白2(mitotic arrest deficient-like 2)的变化导致了细胞周期阻滞[27]. 这可能解释了H101感染后细胞S 期阻滞的现象. 而凋亡的增加可能是由于病毒在UM 细胞中复制增加而导致的.基于体外实验的结果, 为了探索H101在体内的效果, 制备了SP6.5细胞荷瘤小鼠, 并按期注射H101. 体内实验表明, 在持续大剂量注射H101病毒注射液情况下, H101治疗组的异体瘤的生长速度明显低于对照组.综上所述, 溶瘤腺病毒H101在体外能够特异性杀伤肿瘤细胞, 引起细胞凋亡, 阻滞细胞周期, 在体内治疗中能够抑制肿瘤生长. 溶瘤腺病毒H101是一种治疗葡萄膜黑色素瘤的潜在有效的方法, 但在如何降低使用剂量, 提高病毒感染效率方面仍需进一步研究.刘博等: 溶瘤腺病毒靶向杀灭葡萄膜黑色素瘤参考文献1Hentrich H, Kaiser R, Gottsberger G. 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To investigate the effect of treating uveal melanoma with H101, we infected specific uveal melanoma cell lines in vitro and observed significant cell growth inhibition, apoptosis and cell cycle arrest; the treatment was innocuous in the ARPE-19 normal cell line. In vivo, an intratumoural injection of H101 inhibited tumour growth and prolonged animal survival in the SP6.5 tumour xenograft mouse model. These results indicated that viral therapy using the oncolytic adenovirus H101 is feasible and promising for the treatment of uveal melanoma.uveal melanoma, oncolytic adenovirus, H101doi: 10.1360/052013-354157。