滇一型杂交粳稻恢复基因的分子鉴定研究_谭亚玲

研究报告RESEARCH REPORT滇一型杂交粳稻恢复基因的分子鉴定研究谭亚玲*谭学林云南农业大学稻作研究所,昆明,650201*通讯作者,cmsong@1631com摘要用位于水稻第10染色体的微卫星标记OSR33、RM228对285份滇型材料进行恢复基因的分子鉴定研究,结果表明:¹OSR33、RM228标记的基因型依材料的不同而出现分子量不同的带型,且带型与材料有关;ºOSR33和RM228鉴定材料的准确率分别为96%和90%;OSR33、RM228标记的基因型值与黑染花粉率极显著正相关,可用于鉴别恢复系;»用M apm aker/QTL软件分析供试材料的表现型,在OSR33、RM228之间,探测到1个与育性恢复有关的主效QT L,可解释8312%的表型变异,与OSR33和RM228的遗传距离分别为313cM和710cM。

关键词滇一型杂交粳稻,恢复系,分子鉴定Molecular Identific ation of the Fertility-restorer-gene of Dian-type1Hybrid Rice Tan Yaling*T an XuelinRice Research Institute of Yunnan Agricultural University,Kunmi ng,650201*Corresponding author,cmsong@1631comABST RACTThe identification of fertility-restoring-gene of Dian-type1hybrid rice w ith two simple sequence repeat (SSR)markers,OSR33and RM228locating in the middle of the long arm of chromosome10,were studied. The correct frequency of the identification w as95%w ith OSR33,and90%with RM228.Statistics analysis show ed very significant correlation betw een pollen fertility and marker genotypes.T he results indicated that the tw o m arkers could be used for identifying restorer lines of Dian type rice.A major-fertility-restoring-gene w as detection between OSR33and RM228by QT L mapping approach.T he locus w as closed to markers OSR33and RM228w ithin313cM and710cM respectively,w hich ex plained8312%phenotypic variance.KEY WORDSDian-type1hybrid rice,Fertility-restoring-g ene,M olecular identification水稻是我国重要的粮食作物之一,杂交水稻的育成为我国粮食生产和温饱问题的解决做出了巨大贡献。

有效利用水稻杂种优势的基础是雄性不育性。

研究利用最多的水稻雄性不育有两种类型:一类是遗传因素所致,包括细胞核基因控制的雄性不育、细胞质基因控制的雄性不育、细胞分子植物育种,2004年,第2卷,第2期,第209)214页M olecular P lant Br eeding,2004,V ol12,No12,209)214核基因与细胞质基因互作控制的雄性不育;另一类是由遗传和环境互作控制的雄性不育,包括光敏感及温敏感雄性不育(谭学林和师常俊,1999)。

目前,水稻生产上大面积使用的是由质核基因互作控制的雄性不育系。

在籼稻上,主要是利用野败型雄性不育,累计推广的2亿hm2杂交稻中,野败型雄性不育系占50%(曾千春等,2000)。

粳稻上则是包台型和滇一型雄性不育,虽然杂交粳稻与杂交籼稻同在1973年实现三系配套,但其未能象杂交籼稻那样得到广泛应用,主要的一个原因是粳型杂交稻的恢复系选育难,其根本原因是粳型不育系不像籼型那样,有现成的品系可作恢复系,粳型(包括包台型和滇一型)的恢复基因只存在于籼稻中,不存在于粳稻品种中,而且不是所有的籼稻都具有恢复基因,大约只有30%左右的籼稻品种有恢复基因。

所以,选育滇型恢复系和其它粳稻恢复系一样必须通过籼粳交,从籼稻中引入恢复基因(李铮友和纳信真,1980)。

此外,在选育恢复系时,由于很少有形态特征可用于鉴别恢复系,其鉴别必须通过测交,这一方法需经历两个生长季节,而且结果的准确性常受环境条件的影响。

因此,恢复基因的鉴别及恢复系的选育一直是粳型杂交水稻研究的瓶颈。

近20年来,分子标记技术的迅猛发展,加快了水稻育性恢复基因的定位和作图的研究步伐。

不同学者采用不同的分子标记技术对不同质源的育性恢复基因进行了定位研究,其中以野败型、BT型、滇一型研究较多。

尽管不同学者将野败型的恢复基因定位于第1、7、10染色体上(Bharaj et al1, 1995;Akagi et al1,1996;Zhang et al1,1997;Yao et al1,1997;Tan et al1,1998a;Jing et al1,2001;景润春等,2000),但许多结果均表明第10染色体长臂中部有一个与育性恢复有关的主效基因,距OSR33 3158cM;包台型的育性恢复基因也位于第10染色体,与OSR33紧密连锁(约317cM)(Fukuta et al1,1992;Ichikaw a et al1,1997;Liang,2000)。

滇型细胞质雄性不育系育性恢复基因的定位研究相对较少,陶大云(2002,私人通讯)发现滇一型细胞质雄性不育系育性恢复基因位于第10染色体长臂中部,OSR33、RM228之间,其连锁距分别为316cM 和815cM。

Tan等用分离群体混合法,采用微卫星分子标记技术,研究滇一型细胞质雄性不育系育性恢复基因,在第10染色体探测到一个与育性恢复有关的主效基因,其与OSR33、RM228紧密连锁,距OSR33314cM,距RM228510c M。

育性恢复基因分子定位的日趋精确,为恢复基因的分子鉴别提供了可能。

但分子标记辅助选择时,首先应考虑前景选择的可靠性。

而前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间的连锁程度,只有连锁非常紧密,才能够达到较高的准确率。

选择的准确率随重组率的增加迅速下降,在分子辅助选择育种中,若要求选择的准确率达到90%以上,则标记与目标基因的重组率必须小于5%,当重组率达到10%时,选择的准确率已降到80%(方宣钧等,2001)。

根据图距小于10cM时,图距近似等于重组率,微卫星标记OSR33、RM228与滇一型恢复基因的重组率分别近似为4%、5%。

从理论上讲,如用这2个微卫星标记对滇一型杂交粳稻恢复基因选择的准确率均达到90%以上,可用于滇一型杂交粳稻恢复基因的分子标记辅助选择研究,能对现有材料早期进行选择,大大缩短育种周期。

因此,本试验采用微卫星标记OSR33和RM228筛选了滇型水稻的一些稳定品系,进行恢复基因的分子鉴别及恢复系的分子标记辅助选择研究。

1材料与方法111供试材料供试材料共285份,其中滇一型杂交水稻不育系及相应的保持系106对(编号为/不0字号);测交组合179对(不育系与稻作所籼粳交自育品系的测交一代,及相应测交父本179份;编号为/测0字号);于2001年种植于云南农业大学稻作所试验田,栽培管理同一般大田栽培。

112方法11211供试材料的育性检测开花期取不育系及测交一代的成熟颖花,用1% I2-KI溶液染色镜检。

圆形、黑染者为可育花粉;形状不规则、不染色者(典败),圆形但浅染(染败)或圆形不染者(圆败)均为不育花粉。

统计花粉可育率,成熟时考查不育系及测交一代结实情况。

11212供试材料的分子鉴定分蘖末期取保持系、测交组合父本的叶片,采用脲-酚变性法提取水稻总DNA(Tan et al1,210分子植物育种M olecular Plant Breeding1998a),溴化乙锭荧光比色测定DNA 浓度,聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染检测多态性的方法。

PCR 扩增反应液组成、扩增程序及引物序列如下:反应液组成:ddH 2O 8L l 、10@buffer 2L l 、MgCl 2(25mol/L )2L l,dNTP (215umol/L )2L l 、引物(2umol/L)各2L l,模板DNA 2L l 、DNA 聚合酶1u 扩增程序:94e 4min;94e 1min 、55e 1min 、72e 1min,35个循环;72e 4minOSR33:5c -AACGCGAGGACACGTACTTAC -3c ;5c -ACGAGA TACGT ACGCCCTTG -3cRM228:5c -CTGGCC ATTAGTCCTTGG -3c ;5c -GC TTGCGGCTCTGCTTAC-3c 11213分子鉴定材料的可靠性分析及育性恢复基因位点的确定对106对不育系及179对测交组合进行花粉育性与标记基因型的相关分析;以花粉育性为对照,统计106对不育系及179对测交组合分子鉴定的出错率,其中测交组合黑染花粉率大于30%(计为育性恢复),及黑染花粉率小于10%(计为育性不恢复)。

并用Mapmaker/QTL 软件分析供试材料的表现型,确定恢复基因的位点。

分析时黑染花粉率大于30%的材料为育性恢复/20,小于10%的材料为育性不恢复/10,将标记基因型值为/1,20、/1,30、及黑染花粉率为10%~30%作为缺失,参数(LOD)为013,最大距离5010cM 。

2结果与分析211恢复基因的分子标记带型OSR33有分子量不同的3种带型,分别记为/10、/20、/30,其中以/30型分子量最大,/20型的分子量最小(图1)。

与OSR33不同的是,微卫星标记RM228的带型以/组0的形式出现,依据主要带型位置的不同,将其分为两类,分别记为/10、/20,以/10型分子量最大(图2)。

带型出现类型与材料类型有关,/10型主要出现于保持系及测交一代不育的测交父本;/20、/30带型主要出现在测交一代的花粉育性为半不育,结实表现/恢0的测交父本及30份自育品系。