脓毒症大鼠模型脑胰岛素生长因子1表达的变化及影响

脓毒症大鼠模型脑胰岛素生长因子1表达的变化及影响
杨阳;王强;满明昊;李玉骞;李立宏
【摘要】Objective To explore the change of insulin-like growth factor-
1( IGF-1) expression and its effects on cerebral cortex of rat sepsis
model .Methods The rat model of sepsis was established by cecal ligation and puncture ( CLP ) .The IGF-1 positive cells were observed by immunofluorescent staining .IGF-1 and caspase-3 expression was determined by Western blot . TUNEL staining was used to assess neuron apoptosis .Then septic rats were treated with IGF-1 or saline by lateral ventricle injection .The expression of caspase-3 was evaluated by western blot . Neuron apoptosis was assessed by TUNEL staining .Results Compared with the sham-operated group, IGF-1 positive cells in cerebral cortex in the sepsis group decreased obviously .Besides, IGF-1 expression decreased , caspase-3 expression and neuron apoptosis increased (all
P<0.05). When IGF-1 was given , caspase-3 expression and cell apoptosis was similar to the sham-operated group, while in the saline-treated group, the results were similar to the sepsis group .Conclusion During sepsis , IGF-1 expression in rat cerebral cortex obviously decreased and neuron apoptosis increased.After treated with exogenous IGF-1, cell apoptosis decreased .These findings suggested that IGF-1 may protect rat brain from sepsis by inhibiting the up-regulation of caspase-3.%目的：探讨脓毒症大鼠模型胰岛素生长因子1（IGF-1）表达的变化及影响。

方法采用盲肠结扎穿孔法（CLP）制作脓毒症大鼠模型，应用免疫荧光染色观察皮层IGF-1阳性细胞，
western blot法检测IGF-1和caspase-3蛋白表达，TUNEL染色观察脑神经元凋亡。

在脓毒症模型基础上，给予侧脑室定位注射IGF-1或生理盐水，相同方法检测caspase-3蛋白表达及脑神经元凋亡。

结果与假手术组相比，脓毒症组大鼠皮层IGF-1阳性细胞数明显减少，caspase-3表达增高，IGF-1表达减低，神经元凋亡增加（均P＜0．05）。

侧脑室注射IGF-1后，caspase-3表达和神经元凋亡较假手术组无明显变化；而侧脑室给予生理盐水大鼠caspase-3表达和神经元凋亡与脓毒症组相似。

结论脓毒症大鼠的脑皮层IGF-1表达明显减低，细胞凋亡增多。

给予外源性IGF-1后，细胞凋亡减少。

提示IGF-1可能通过抑制caspase-3的上调对脓毒症大鼠起到脑保护作用。

【期刊名称】《临床神经外科杂志》
【年(卷),期】2015(000)001
【总页数】5页(P43-47)
【关键词】脓毒症;凋亡;胰岛素生长因子1;大鼠模型
【作者】杨阳;王强;满明昊;李玉骞;李立宏
【作者单位】710038西安，第四军医大学唐都医院神经外科;710038西安，第四军医大学唐都医院神经外科;710038西安，第四军医大学唐都医院神经外
科;710038西安，第四军医大学唐都医院神经外科;710038西安，第四军医大学唐都医院神经外科
【正文语种】中文
【中图分类】R651.1
作者单位:710038西安，第四军医大学唐都医院神经外科
脓毒症是由感染或者由高度可疑感染灶引起的全身炎症反应综合征，病死率高达30%～70%。

脓毒症相关脑病(septic associated encephalopathy，SE)是脓毒
症病程发展中所引起的神经系统并发症，是ICU中最常见的脑部疾病。

近期，一
些研究表明脓毒症存活者表现出长期的神经系统功能障碍，包括记忆力下降、注意力不集中以及认知损害［1-5］。

此外，中枢神经系统广泛控制着机体的生理功能，对于维持机体稳态，协调行为、神经内分泌和自分泌等功能至关重要，所以脓毒症引起的脑损伤可能会加剧脓毒症的病程［6］。

SE的发病机制目前尚不清楚，因此对于SE的治疗主要针对脓毒症，对脑损伤无特效疗法。

胰岛素生长因子1(IGF-1)是与组织分化、增殖和成熟相关的重要细胞因子［7-8］，其能保护神经元，避免多种损伤因素导致的细胞死亡［9-10］。

有动物实验表明，腹腔注射IGF-1对大
鼠缺血缺氧引起的脑损伤具有治疗和保护作用［11］。

此外，脓毒症期间胃肠道、膈肌等外周组织器官的IGF-1表达呈下降趋势，且与细胞凋亡呈负相关［12-13］。

但是，IGF-1在脓毒症期间脑组织中的表达变化及其对脓毒症脑神经元凋亡影响的报道甚少。

因此，本研究旨在初步阐明脓毒症时脑皮层IGF-1的变化情况及其对
皮层神经元凋亡的影响，为脓毒症脑病的发病机制及治疗提供新的思路和靶点。

1.1 实验动物及分组雄性成年Sprague Dawley (SD)大鼠64只，购自第四军
医大学实验动物中心，重200～250 g;动物饲养保持12 h白天/黑夜的生理周期并给予充足的食物和水。

将大鼠分为4组:假手术组，脓毒症组，IGF-1组和生理盐
水组，每组16只。

各组大鼠随机取8只于手术后24 h处死并灌注取脑，做免疫
组织化学和TUNEL染色，另外8只于24 h处死后冰上取脑，作western blot和Realtime PCR分析。

本课题得到第四军医大学实验动物伦理委员会的许可。

1.2 脓毒症模型制作采用CLP法制作脓毒症大鼠模型［14］。

具体步骤如下: 2%戊巴比妥钠(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠，取仰卧位，下腹部剃毛消毒后作皮肤正
中切口，沿腹白线继续切开肌层和腹膜，圆头敷料镊定位盲肠并夹住盲端，将其从腹腔轻柔的拉至腹壁外，在距离盲端75%处用3-0尼龙线结扎盲肠，并用18号注射器针头在盲端穿孔2次，挤出少许粪便，然后将盲肠放回腹腔并逐层关腹。

皮下给予37℃的生理盐水5 ml/100 g进行液体复苏。

假手术组大鼠不进行盲肠的结扎和穿孔，其余步骤相同。

术毕大鼠放回笼内继续保持12 h白天/黑夜的生理周期并给予充足的食物和水。

1.3 侧脑室定位注射在脓毒症模型基础上，将麻醉的大鼠俯卧位置于立体定位仪上，水平方向的2根钢针固定耳蜗，牙槽固定牙齿，使头部水平固定。

头颅正中部位术野剪毛消毒后，以左右耳蜗的连线为基线，以头颅中轴为方向，用刀片切开1 cm左右小切口，眼科镊挑起并剪开皮下筋膜，分离并暴露颅骨，在前囱向后
0.8 mm，中骨缝靠右1.5 mm处用牙科钻钻开颅骨，微量注射器吸取20 μl IGF-
1 (0.25 μg/μl，PROSPEC，Israel)或20 μl生理盐水，沿钻孔向下缓慢进针4.5 mm，以1 μl/min速度向侧脑室注射药物，注射结束后注射器继续停留20 min，之后慢慢旋出微量注射器，消毒并缝合头皮。

1.4 神经行为学评分参考张丽娜、艾宇航等的方法［15］，对各组大鼠进行神经行为学评分来评价大鼠的神经功能，分数越低表明损伤越严重。

评价大鼠耳廓、角膜、翻正、甩尾和逃避反射并评分。

耳廓反射通过轻触外耳道引起头部迅速有力转动为正常;角膜反射通过用棉签轻触大鼠角膜引起迅速眨眼或头部摇动为正常;翻正反射通过将大鼠仰卧位放置，观察其能否迅速翻身成俯卧位，并前后脚放平。

甩尾反射和逃避反射通过短暂刺激大鼠尾部引起躲避或转头逃避伤害刺激。

0分为无反射，1分为反射减弱(10 s以内缺乏反射或反应缓慢)，2分为反射正常。

最高评分为10分。

在术后6 h、12 h和24 h进行评分，评分采用双盲法，由两名非实验人员观察、记录。

1.5 免疫荧光染色各组大鼠处死后多聚甲醛灌注，取脑，石蜡包埋，切取5
μm厚的脑片。

常规脱蜡脱苯至水，柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)高压抗原修复2 min。

3%过氧化氢封闭20 min，2.5%山羊血清封闭1 h。

组织切片滴加兔抗大鼠IGF-1一抗(1∶25，Protein Tech，USA)，4℃过夜，滴加驴抗兔荧光二抗(1∶200，Invitrogen，USA)室温避光孵育4 h，DAPI(1∶200，Invitrogen，USA)室温避
光孵育10 min，甘油封片，荧光显微镜观察并照相。

1.6 脑神经元原位凋亡检测TUNEL法观察神经元凋亡情况。

采用Roche公司
提供的TUNEL检测试剂盒，按其操作要求进行细胞凋亡检测，荧光显微镜观察TUNEL荧光阳性凋亡细胞(FITC激发波长为488 nm，发射波长为520 nm)。

1.7 western blot冰上取新鲜脑组织，分离并切取合适大小，重量相近的脑皮层，制备蛋白样品，经12%SDS-PAGE凝胶电泳后转PVDF，5%脱脂奶粉封闭1 h后，采用IGF-1兔多克隆抗体(1∶200，Protein Tech，USA)和caspase-3兔多克隆
抗体(1∶200，Protein Tech，USA) 4℃封闭过夜，PBST漂洗5 min×4次。

二抗均用HRP-山羊抗兔IgG (1∶2 000，Jackson，USA)，室温封闭1 h，PBST漂洗5 min×4次，之后加发光液发光(Millipore，USA)，显影拍照。

1.8 统计学方法用SPSS 10.0软件进行统计处理。

检测数据用均数±标准差(±s)表示，两组均数之间的比较采用Student＇s t检验，多组之间的比较采用One-way ANOVA和Bonferroni＇s检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 神经系统功能的改变神经行为学评分显示: 6 h时，各组的评分无明显差异(ANOVA，P＞0.1)。

12 h时，脓毒症组和生理盐水组的评分与假手术组和IGF-1组相比显著降低(ANOVA，P＜0.05)，而脓毒症组和生理盐水组相比较(Bonferroni’s test，P=0.12)，以及假手术组和IGF-1组相比较(Bonferroni’s test，P=0.23)，其评分无明显差异。

24 h时，脓毒症组和生理盐水组的评分与假手术组和IGF-1组相比降低更为显著(ANOVA，P＜0.001)，而脓毒症组和生理盐水组相比较(Bonferroni’s t est P=0.14)，以及假手术组和IGF-1组相比较
(Bonferroni’s test，P=0.09)，其评分无明显差异。

提示脓毒症期间，大鼠的神经系统有明显的功能障碍，且随着时间推移，功能障碍逐步加重，以12 h后更加明显，给予IGF-1后功能损害明显减轻(图1)。

2.2 大鼠CLP术后皮层IGF-1阳性细胞数量及其表达量的变化取大鼠脑组织切片做IGF-1的免疫荧光染色，每张片子随机取5个高倍镜视野，荧光显微镜观察
并照相，结果显示:脓毒症组的皮层IGF-1阳性细胞数量与假手术组相比明显减少(P＜0.01) (图2A)。

而western blot结果显示，脓毒症组脑皮层IGF-1蛋白表达
较假手术组减少(P＜0.05) (图2B)。

2.3 脓毒症大鼠及给予IGF-1后皮层神经元凋亡及caspase-3蛋白表达的变化
取各组大鼠的脑组织切片作TUNEL染色，每张片子随机取5个高倍镜视野，荧光显微镜观察并照相。

结果显示:脓毒症组和生理盐水组皮层神经元凋亡较假手术组
显著增多(P＜0.05)，而IGF-1组增多不明显(P=0.11) (图3A)。

Western blot检
测皮层caspase-3蛋白的表达，结果显示:脓毒症组和生理盐水组皮层caspase-3
的表达较假手术组明显增高(P＜0.05)，而IGF-1组增高不明显(P=0.25) (图3B)。

以往的研究表明，细菌及其内毒素诱导的宿主免疫系统的失控性激活对决定脓毒症的严重程度有重要作用。

此外，宿主产生的炎性因子，如白介素1 (IL-1)和肿瘤坏死因子(TNF) -α，对脓毒症病程的发展也很重要［16-17］。

而这些细胞因子对生长激素(GH) -IGF轴的影响被认为是此过程的核心环节［18］。

有学者发现，给予大鼠IL-1β或TNF-α后，能够使其血循环IGF-1的水平降低，其结果与大鼠组织损伤或内毒素血症模型的研究结果一致［19］。

而脓毒症患者和注射内毒素的健
康志愿者，也可发现血循环中IGF-1水平的减低［20］。

多种炎症介质，如IL-1β，能够减少机体GH的分泌并增强糖皮质激素的分泌，而后者分泌增强能诱导机体GH抵抗，进而导致循环IGF-1水平及其生物活性降低。

脓毒症时，在促炎细胞因子的作用下，循环中IGFBPs的水平增加会引起结合型的IGF-1增多，进而导致游
离的IGF-1水平下降。

本研究结果也显示，在脓毒症大鼠脑皮层的IGF-1表达明
显减低，这与相关研究的结果一致。

然而，前述研究认为，IGF-1水平的下降与免疫系统的失控性激活相关，而脑由于缺乏淋巴系统且脑实质细胞低表达组织相容性复合物抗原。

此外，血-脑屏障的存在，使其在解剖结构上与免疫系统相隔离，因
而脑被认为是免疫豁免器官［21］，所以脓毒症时脑IGF-1表达下降是否与免疫
系统有关以及其下降的具体机制仍不清楚。

本研究观察了脓毒症大鼠及脓毒症大鼠给予外源性IGF-1后，神经功能的变化和
皮层神经元凋亡的情况。

由于血-脑屏障的存在，建立脓毒症大鼠模型后，采用侧
脑室定位注射的方法给予IGF-1，可保证脑内药物达到有效浓度，增加实验结果的可信度。

神经行为学评分显示在CLP术后6 h，各组大鼠的功能评分并无明显差异，而从12 h起，脓毒症组和生理盐水组大鼠的评分明显减低，IGF-1组大鼠的
评分也有所降低，但明显慢于前两组，且随着时间的推移，这3组之间的差异越
加明显，而IGF-1组和假手术组之间的差异无统计学意义。

TUNEL染色显示，脓毒症大鼠脑皮层神经元凋亡增加，而给予外源性IGF-1能显著抑制神经元的凋亡。

在CLP术后24 h，免疫荧光染色显示大鼠脑皮层的IGF-1阳性细胞显著减少。

Western blo检测结果显示，IGF-1蛋白表达减低，caspase-3表达增高，而给予IGF-1后其增高明显受到抑制。

提示脓毒症时，IGF-1水平的降低可能是引起脑神经元凋亡及神经功能损害的一个重要因素，而给予IGF-1后神经元凋亡受到抑制
且神经功能明显改善，并且脓毒症大鼠脑caspase-3的表达在IGF-1干预后无明
显的增高; IGF-1是通过抑制caspase-3表达增多而抑制脓毒症脑神经元的凋亡，进而改善神经功能和SE的预后。

然而，也有研究资料表明，给予外源性IGF-1对脓毒症的器官功能障碍并无明显改善作用［22］。

故推测IGF-1的保护作用可能
具有器官和组织的特异性，但具体机制仍有待研究。

本实验研究也存在以下的局限性:首先，虽然采用了标准的CLP法建立脓毒症大鼠模型，但由于手术损伤大且动
物个体存在差异，如对手术的耐受性不同、盲肠的内容物不尽相同等，使脓毒症大鼠模型无法达到完全一致，甚至有些动物之间存在较大的差异，可能对实验结果有影响。

其次，由于该大鼠模型的死亡率较高，虽然每组选取16只大鼠，但24 h
后脓毒症组和生理盐水组大鼠均仅存活7只，所以由于样本量的不同，可能会对
结果有一定影响。

最后，虽然本研究证实了IGF-1能抑制caspase-3的过表达，但引起caspase-3
表达增高的通路有多条，如TNF-α—caspase-8，cytochrome-C—caspase-9通路等［23］。

其具体通过哪条通路而抑制了caspase-3的过表达仍不完全清楚，尚有待进一步的研究来证实。

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