常用的分子生物学基本技术简介

核酸序列测定
DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。

无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR 法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因的突变及对功能的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病机制等。

测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。

目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger的双脱氧法等，近年来已有DNA序列自动测定仪问世。

化学降解法是在DNA的片段的5`端标记核素，然后用专一性化学试剂将DNA特异地降解，在电泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。

一般能读出200-250个核苷酸序列。

双脱氧法是采用核苷酸链终止剂，如：2`，3`-双脱氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一种)掺入到DNA链中以终止链的延长，与掺入4种正常的dNTP的混合物分成四组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA片段，经凝胶电泳分离和放射自显影，可读出合成的DNA核苷酸序列，根据碱基互补原则，可推算出模板DNA分子的序列。

化学降解法只需一化学试剂，重复性好，容易掌握；而双脱氧法需单链模板、特异的寡核苷酸引物及高质量的DNA聚合酶，便随着M13噬菌体载体的发明和运用，合成的引物容易获得，测序技术不断改进，故此法已被广泛应用。

基脱氧法的自动激光荧光测序仪，使测工作更快速和简便，而且保证高度重复性。

至于RNA测序现大多采用将mRNA逆转录成cDNA后同测序，然后反推RNA序列
基因转染技术
将特定的遗传信息传递到真核细胞中，这种能力不但革新了生物学和医学中许多基本问题的研究，也推动了诊断和治疗方面的分子技术发展，并使基因治疗成为可能。

目前基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等研究。

本部分将介绍目前基因转移的主要方法；重点介绍基因转移的病毒方法的基因转染（transfection）技术。

基因突变的检测方法
基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。

人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。

对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。

多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。

其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。

下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。

突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。

用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。

变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。

基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。

由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。

在DGGE的基础上，又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE法（温度梯度凝胶电泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。

DGGE和TGGE均有商品化的电泳装置，该法一经建立，操作也较简便，适合于大样本的检测筛选。

化学切割错配法（chemical cleavage of mismatch,CCM）CCM为在Maxam-Gilbert测序法的基础上发展的一项检测突变的技术，其检测突变的
准确性可与DNA测序相仿。

其基本原理为将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混俣变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺或哌啶切割，错配的T能被四氧化饿切割，经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变。

该法检出率很高，也是检片段最长的方法，已有报功检测了1.7kb片段，如果同时对正、反义链进行分析，检出率可达100％。

应用荧光检测系统可增强敏感度，可检测到10个细胞中的1个突变细胞。

该法中的化学试剂有毒，又发展了碳二亚胺检测法（catodiimide,CDI）,CDI为无毒物质，也可检测大片段DNA 的点突变。

等位基因特异性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide,ASO） ASO为一种以杂交为基础对已知突变的检测技术。

以PCR和ASO 相结合，设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR拉增的样品DNA杂交。

可以用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现阳性杂交带，则表运河样品中存在与该ASO探针相应的点突变，ASO需严格控制杂交条件和设置标准对照避免假阳性和假阴性。

目前已有商品化的检测盒检测部分癌基因ASO突变。

DNA芯片技术（DNA chip） DNA芯片技术是90年代后发展的一项DNA分析新技术，它集合了集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA合成等先进技术。

可用于基因定位、DNA测序、物理图谱和遗传图谱的构建等。

在基因突变检测方面DNA芯片也有广阔的前景，其基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成电路板上，彼此之间重叠1个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常DNA 和突变DNA发别与2块DNA芯片杂交，由于至少存在1个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、片动化程度高，具有很大的发展潜力，将在基因突变检测中心发挥非常重要的作用。

1、DNA类似物用于治疗。

2、糖类可以用于研发药物
2、检测DNA的方法。

3、小分子-DNA相互作用的物理化学方法
六、碳水化合物、脂肪&膜蛋白
1、寡糖的测序方法
3、磷脂层，为什么是双分子的，而不是单分子的？
4、如何证明磷脂双分子层的这种运动？？
5、如何判断跨膜蛋白的区域？？（电泳）可以动力学模拟。

1、ATPase的机制如何证明？？
核酸序列分析的基本原理：
•化学裂解法(Maxam-Gillbert法)
•DNA链的末端合成终止法(Sanger法)
PCR，电泳，ELISA，DNA提取，质粒酶切，NB，SB，转化，薄层层析，接种，培养，PAGE，细胞培养，磷酸钙转染，脂质体转染，表达蛋白，RNA提取，CHIP，配溶液，感受态制备，重组子过程的试剂盒，微生物的筛选及鉴定，质粒提取，HPLC，定量PCR
分子杂交，DNA重组质粒的连接，转化和筛选，DNA分子探针，分子克隆，引物设计，RT-PCR，色谱，质谱，WB，PCR，Blast，检索，ELISA，NB，蛋白质分析，探针标记，分子量测定，WB，RNA提取，定点突变，蛋白质纯化
DNA重组，ELISA，WB，探针标记，凝胶图谱分析，分子杂交，RNA提取，NB，SB，噬菌体展示，GTP？构建载体，PCR，DNA克隆及应用，Blast，引物设计，分子克隆，RT-PCR，原代细胞培养，电泳，荧光免疫，酵母双杂交，分子标记检测方法，各种仪器的原理和使用，同一领域新旧技术对比，高效液相色谱。