iNOS抑制剂对兔关节软骨修复组织胶原表达的影响

iNOS抑制剂对兔关节软骨修复组织胶原表达的影响
[ 10-10-25 15:34:00 ] 编辑：studa20
作者：孙炜王吉兴金大地刘晓霞刘安
庆
【摘要】目的观察诱导型一氧化氮合酶抑制剂对关节软骨修复组织胶原表
达的影响。

方法 24只新西兰大白兔双侧股骨髁间关节面造成全层软骨缺损。

随机抽签均分为对照组、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)组和一氧化氮合酶抑制剂S²甲基异硫脲组(S²meth ylisothiourea，SMT)组。

术
后1年处死动物。

应用苦味酸²天狼猩红染色检测胶原的分布情况，图像分析技术定量胶原的表达及进行修复组织软骨厚度的测量。

应用免疫组织化学技术检
测Ⅱ型胶原的表达和分布。

结果图像分析显示，1年后SMT组Ⅰ型胶原表达量
为65.9％，明显少于BMP组88.5％和对照组94.6％的表达量，Ⅱ型胶原
30.7％的表达量明显多于BMP组10.8％和对照组4.5％的表达量。

1年后SMT
组软骨厚度(1.85±0.56) mm明显高于BMP组(0.67±0.31) mm和对照组
(0.24±0.10) mm。

SMT组缺损区Ⅱ型胶原含量明显高于BMP组和对照组。

结论iNOS抑制剂SMT的应用能明显增加Ⅱ型胶原表达和软骨厚度，对于维持软骨表
型有积极意义。

【关键词】一氧化氮酶抑制剂软骨S²甲基异硫脲胶原
Abstract：Objective To discuss effect of collagen expression in articular cartilage repaire tissue by inducible nitric oxide synthase inhibitor SMT.Methods Full²thickness defects of cartilage were created in the trochlear groove of twenty²four adult New Zealand White rabbits.eight defects were empty，eight were filled with a collagen fibrin glue impregnated with rhBMP，eight were filled with a collagen fibrin glue impregnated with rhBMP and hypodermic injection with 5 mg/kg²1/12 h²1 SMT.The animals were killed at one²year postperatively.The tissue sections were stained with Sirius²Red against collagen type²Ⅰand type²Ⅱwhich analyzed by Quantim ent
500.Cartilage thickness was measured by Quantiment 500
too.Results One²year after collagen fibrin glue with rhBMP and with hypodermic injection SMT，collagen type²Ⅰ expression of repair
tissue in SMT group(65.9％) was less than in BMP group(88.5％) and
the control(94.6％)，and collagen type²Ⅱ (30.7％) was more than in BMP group(10.8％) and the control(4.5％).Cartilage thickness of SMT group(1.85±0.56) mm was significant higher than BMP group(0.67±0.31) mm and the control(0.24±0.10) mm.Conclusion NOS inhibitor SMT
could increase collagen type²Ⅰexpression and decrease collagen
type²Ⅱexpression，as well as make phenotype good.
Key words：nitric oxide synthase；inhibitor；cartilage；
s²methylisothiourea；collagen
一氧化氮(nitric oxide，NO)是活泼的自由基分子，参与多种组织的代谢调节。

关节软骨自身修复能力十分有限，关节软骨损伤通常会导致更严重的关节软骨退变，既往研究已采用多种方法来修复和重建关节软骨，许多技术已被广泛应用于临床。

而一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS) 抑制剂有助于软骨组织修复。

因此本文应用苦味酸²天狼猩红染色，研究软骨修复组织中胶原纤维的表达变化，了解NOS抑制剂对软骨修复组织胶原表达的影响。

1 材料与方法
1.1 研究对象与实验分组实验于1999年6月至2001年2月在南方医科大学完成。

取8个月龄新西兰兔24只，雄性，体重(
2.5±0.2) kg。

随机抽签法分为对照组、骨形态发生蛋白组(bone morphogentic protein，BMP)和诱导型一氧化氮合酶抑制剂S²甲基异硫脲(S²methylisothiourea，SMT)组，动物由南方医科大学提供。

动物模型和标本处理：8月龄新西兰兔24只，随机分为对照组、BMP组和SMT各8只。

在右侧股骨髁间关节面上作直径4.5 mm、深达髓腔的全层缺损。

a)对照组：软骨缺损不充填任何物质；b)BMP组：缺损用BMP纤维蛋白凝胶复合物充填；c)SMT组：缺损应用胶原复合BMP充填，术后按5 mg·kg－1·12 h－1皮下注射SMT。

术后1年各组处死动物，制作石蜡切片用于检测。

1.2 苦味酸²天狼猩红染色显示胶原分布：石蜡切片，0.1％的天狼猩红饱和苦味酸溶液(0.1 g天狼猩红溶于100 mL苦味酸溶液)染60 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。

偏振光显微镜下观察。

1.3 软骨Ⅰ、Ⅱ型胶原图像分析在40倍视野下，每张切片上选择10个纵向视野，以正常软骨Ⅰ、Ⅱ型胶原色度为参照。

利用Leica－Q500MC图像分析仪，在交互式操作方式下进行测试，获得关于胶原的体视学定量指标。

将获得的体视学参数值按体视学原理和计算公式求得每例标本的形态学定量参数值，得到各型胶原含量。

软骨厚度图像分析：利用Leica－Q500MC图像分析仪，100倍视野下测量修复组织表面Ⅱ型胶原显示的厚度来间接测量软骨厚度。

1.4 统计学分析 SPSS 8.0软件包完成统计处理，数值均以±s表示，Paired²samples T test作均数的显著性检验。

2 结果
2.1 偏振光显微镜下观察在偏振光显微镜下，Ⅰ型胶原表现为较强的双折光，紧密排列，为黄色或红色的纤维。

Ⅱ型胶原显示弱的双折光，呈现绿色混合颜色的疏松纤维。

术后1年，对照组修复组织内基本未见绿色纤维，以致密粗大黄色纤维为主，与软骨下骨结构也有明显差别；术后1年，BMP
组基本以黄色和红色纤维为主，中间夹杂很少量绿色弱折光纤维；术后1年，SMT组仍可见大量绿色弱折光纤维，但局部有异位骨化。

2.2 软骨修复组织Ⅰ/Ⅱ胶原分布图像分析结果经图像分析，SMT 组术后1年Ⅰ型胶原占65.9％，Ⅱ型胶原30.7％。

分别与对照组Ⅰ型胶原(94.6％)、BMP组Ⅰ型胶原(88.5％)，对照组Ⅱ型胶原(4.5％)、BMP组的Ⅱ型胶原(10.8％)相比，差异有显著性意义(P＜0.05)(见表1)。

表1术后1年软骨修复组织Ⅰ、Ⅱ胶原分布和厚度比较注：与对照组和BMP组相比，*P＜0.05。

2.3 软骨厚度的测量经图像分析，1年后SMT组软骨厚度
(1.85±0.56) mm明显高于BMP组(0.67±0.31) mm及对照组(0.24±0.10) mm，其差异有显著性意义(P＜0.05)(见表1)。