高效液相色谱法测定化妆品中胶原蛋白含量

高效液相色谱法测定化妆品中胶原蛋白含量
王旭楠;郭立群;周洁;邱晓锋;王敏
【摘要】采用高温酸解法对水剂、乳霜类化妆品进行前处理,经柱前衍生化法-高效液相色谱法测定样品中L-羟脯氨酸(L-Hyp)和胶原蛋白含量.化妆品样品经105℃下盐酸酸解后,以α-氨基丁酸为内标物,利用高效液相色谱法定量测定L-Hyp含量(色谱柱:Waters Xbridge C18,流速:2.0mL/min,检测波长:260 nm,柱温55℃),经换算得到样品中胶原蛋白的实际含量.色谱条件下,L-Hyp与内标物峰面积比和质量浓度比成良好的线性关系,相关系数为0.999 8.含量测定的相对标准偏差为
0.06％～2.78％,加标回收率为93％～101％,精密度和稳定性良好.该方法准确可靠,适用于测定化妆品中的L-Hyp和胶原蛋白含量.
【期刊名称】《日用化学品科学》
【年(卷),期】2018(041)008
【总页数】4页(P10-13)
【关键词】化妆品;胶原蛋白;高效液相色谱;L-羟脯氨酸
【作者】王旭楠;郭立群;周洁;邱晓锋;王敏
【作者单位】北京工商大学理学院,北京100048;北京工商大学理学院,北京100048;北京工商大学理学院,北京100048;诺斯贝尔化妆品股份有限公司,广东中山528400;北京工商大学理学院,北京100048
【正文语种】中文
【中图分类】TQ658
胶原蛋白是胶原的水解产物，其作为一种具有较强生物功能活性及低免疫原性的天然蛋白质，在医药、食品、化妆品及生物组织工程等领域有着广泛的应用[1]。

人
皮肤中的胶原蛋白含有甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸等（天然保湿因子）[2]，可作为
保湿剂加入化妆品中，同时还具有抗衰老、促进皮肤创面修复及抗辐射等功效。

由于胶原蛋白在化妆品中添加量较低，样品基质复杂，前处理繁琐，其定量检测分析一直是化妆品功效评价及质量监控的难点。

目前食品和药品中胶原蛋白检测主要以L-羟脯氨酸（L-Hyp）作为有效指标，胶
原蛋白含量主要根据L-Hyp含量乘以相应系数得到[3]，测定方法主要包括分光光度法、氨基酸分析仪法、气相色谱/质谱联用法、高效液相色谱法和毛细管电泳法
等[4-6]。

化妆品成分复杂，除基质外还含有多种功效成分，容易对后续检测产生
干扰，因此综合考虑，优化前处理酸解方法，以α-氨基丁酸作为内标物[7]，采用柱前衍生化-高效液相色谱法测定11种不同剂型化妆品成品和半成品中胶原蛋白
含量，为完善含胶原蛋白类化妆品的质量控制提供参考。

1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
Waters 1525型高效液相色谱仪（配备Waters 2489UV/V检测器）、Waters Xbridge C18色谱柱（75 mm × 4.6 mm，2.5 µm），美国Waters公司；Millipore去离子水发生器、0.45 0m微孔滤膜，美国Merck Millipore公司；超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司。

L-羟脯氨酸（纯度＞99%）、乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯）；浓盐酸（12 mol/L，德国Merck公司）；浓硫酸（98%，国药公司）；氢氧化钠（97%， VWR公司）；α-氨基丁酸，Sigma公司；AccQ标记™超衍生化试剂盒、AccQ标记™超
洗脱液A和洗脱液B，美国Waters公司；样品（诺斯贝尔有限公司）。

1.2 实验方法
1.2.1 测试样品储备液制备
称取样品1.3 g至安瓿瓶中，加入30.0 mL 3 mol/L 盐酸，氮气吹扫3次后使用
酒精喷灯迅速封口；将安瓿瓶置于105 ℃ 烘箱中水解20 h，取水解产物转移至
50 mL容量瓶，加15 mol/L 氢氧化钠溶液约12.0 mL中和过量盐酸并调节pH
至6～8后定容至50 mL；取适量溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤至离心管，滤液
待测。

1.2.2 标准品及内标储备液制备
精密称取80 mg L-Hyp于50 mL容量瓶中，0.1 mol/L盐酸定容至50 mL得标
准品储备液。

α-氨基丁酸内标储备液配制同上。

1.2.3 柱前衍生化
本实验使用AccQ标记™超衍生化试剂盒对样品进行衍生化前处理，即利用N-羟
基琥珀酰亚胺活化环氨基甲酸酯与氨基酸反应产生强稳定性尿素并发出较强荧光的原理，其衍生产物稳定性较好。

具体操作为准确加入70 µL的AccQ标记™超硼酸缓冲液、10 µL样品滤液、标准品溶液至进样瓶中，充分旋涡振荡后，加入20 µL 衍生试剂，置于55 ℃烘箱中温育10 min后，再次旋涡振荡后上机检测。

1.2.4 标准曲线溶液的制备
参考高效液相色谱内标分析法[7]，以α-氨基丁酸作为内标物。

准确吸取100，250，500，750，1 000 μL标准品储备液于5个25 mL容量瓶中，分别加入
250 μL内标储备液，用0.1 mol/mL 盐酸定容至25 mL制得标准曲线溶液。

1.2.5 色谱条件
色谱柱：WATERS XbridgeC18（75 mm×4.6 mm，2.5 μm）；梯度洗脱见表1，流速：2.0 mL/min；检测波长：260 nm；柱温：55 ℃；进样量：10 μL；运行
时间：15 min。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution processt/min φ（A）/% φ（B）/%0.0 100 0 0.5 100 0 7.0 90 10 9.6 80 20 10.0 40 60 10.8 100 0 12.0 100 0 2 结果与讨论
2.1 方法考察
2.1.1 标准品测定
化妆品样品成分较为复杂，可能含有多种干扰成分，因此本实验采取内标法测定目标物含量。

精密称取1.2.4制备的标准品储备液，制成质量浓度分别为0.006 4，0.016 ，0.032，0.048，0.064 mg/mL标准品溶液。

经柱前衍生化后，按表1色谱条件进样测定，记录峰面积如图1。

由图1可知，在该色谱条件下，目标成分均能达到基线分离，且分离度大于1.5，保留时间约为3.4 min。

图1 标准品高效液相色谱图Fig.1 HP LC chromatogram of standard substances of L-hydroxyproline and α-aminobutyric acid
以标准品质量浓度与内标质量浓度比为横坐标，标准品峰面积与内标峰面积比为纵坐标，计算回归方程为：y =0.812 9x + 0.025，Rμ = 0.999 8。

结果表明，标准品质量浓度与内标质量浓度比和标准品峰面积与内标峰面积比成良好的线性关系（图2）。

图2 标准品曲线Fig.2 Curve of standard substance
2.1.2 精密度
精密称取同一L-羟脯氨酸标准品溶液，重复进样6次，测定峰面积，计算RSD为
1.12%（n=6），结果表明该仪器精密度良好。

2.1.3 重复性
准确称取同一L-羟脯氨酸标准品溶液6份，按照含量测定方法重复测定，计算经柱前衍生化处理后溶液中L-羟脯氨酸平均含量为0.478%，RSD为1.809%，表明
该方法重现性良好。

2.2 样品含量测定
称取9种实验室配制的添加胶原蛋白的膏霜10 g加30 mL 3 mol/mL盐酸，2种原料公司提供的含胶原蛋白原料130 mg加10 mL 3 mol/mL 盐酸，按“1.2.1”方法制备待测样品溶液，进行柱前衍生化后高效液相色谱法测定，记录峰面积，根据标准曲线公式计算L-羟脯氨酸含量后换算胶原蛋白含量。

羟脯氨酸作为胶原和胶原蛋白中的特殊蛋白质，其含量一般约为胶原氨基酸总量的10%，其含量是目前食品、保健品及动物组织中胶原和胶原蛋白定量的常用换算
方法[8-12]，测定羟脯氨酸含量乘以相应系数可计算得到待测样本中胶原蛋白含量。

该方法与食品中测定蛋白质的凯氏定氮法类似[13]，羟脯氨酸含量因样本来源物种、组织部位不同而存在一定的差异，如陆生动物常以7.1为折算系数，水生动物多以11.1为折算系数，同种物种皮肤和骨中的含量也不相同[14,15]。

如无文献参考值，一般可按照10%进行含量换算，但据化妆品常用胶原蛋白类原料调研发现，海洋类、牛、猪来源胶原蛋白原料折算系数约为7.4～11.5。

本方法根据相应原料来源，以约9.4为折算系数，胶原蛋白含量计算公式为：胶原蛋白含量=样品中羟脯氨酸含量× 9.4，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n=3）Tab.2 Content determination of samples (n=3)样品 L-羟脯氨酸含量/% 胶原蛋白含量/% RSD/%水剂样品1 0.047 6 0.447 1
2.34胶质样品2 0.064 4 0.605 0 2.78膏霜样品3 0.000 5 0.004 8 2.25膏霜样
品4 0.000 8 0.007 8 0.53膏霜样品5 0.001 2 0.011 1 1.49膏霜样品6 0.001 2 0.011 0 1.93膏霜样品7 0.000 6 0.006 0 2.27膏霜样品8 0.001 0 0.009 5 1.33 续表样品 L-羟脯氨酸含量/% 胶原蛋白含量/% RSD/%膏霜样品9 0.016 1 0.150
6 0.68膏霜样品10 0.029 3 0.274
7 0.06膏霜样品11 0.055 6 0.520
8 1.05
2.3 回收率实验
精密称取已知含量水剂样品1酸解液适量(6份)，分别加入L-羟脯氨酸标准品，经柱前衍生化处理后进样测定，记录峰面积并计算加样（标）回收率，结果见表3。

表3 加标回收率实验结果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests (n=6)样品量
/mg RSD/%130 0.048 4 0.02 0.067 1 93.5原含量/mg加标量/mg测得量/mg
加标回收率/%平均回收率/%130 0.048 0.02 0.067 7 98.5 130 0.046 3 0.04
0.086 1 99.5 130 0.047 2 0.04 0.086 8 99 130 0.048 6 0.06 0.109 1 101 130 0.048 1 0.06 0.107 7 99.3 98.47 2.6
3 结论
本研究中，所有待测样品均为去标盲样多点采集，包括部分化妆品半成品2种和
不同剂型成品样品9种。

半成品中，L-羟脯氨酸平均含量为0.047 6%、0.064 4%，胶原蛋白平均含量相应为0.447 1%、0.605 0%。

成品样品因后期添加其他基质及功效成分，胶原蛋白含量相应减少至0.004 8%～0.520 8%，但仍处于可检出范围内。

不同剂型功效作用不同，其胶原蛋白添加量也不近相同。

因此可根据产品剂型不同，通过适当调整前处理体系容量，使其更适用本方法的测定。

此外，在不同类型的胶原蛋白添加化妆品中，宣称添加的胶原蛋白原料其可能的种属来源会直接影响其换算系数和最终含量计算。

不同来源胶原蛋白原料的羟脯氨酸换算系数不同，不同剂型和品类的化妆品其胶原蛋白添加量也存在一定差异，因此实际检测中需要根据样品特征对本方法适当调整。

众妆供应链平台落地山西
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【相关文献】
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