实验5 培养细胞的有被小泡的免疫细胞化学染色与观察

中国海洋大学实验报告姓名：常天易系年级：海洋生命学院2012级专业：生物科学
科目：分子细胞生物学实验学号：12050011006
培养细胞的有被小泡免疫细胞化学染色与
观察
一、实验目的
（1）掌握免疫细胞化学染色的基本原理和步骤；
（2）对成笼蛋白有被小泡在细胞内的形态和分布有直观认识。

二、实验原理
用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。

免疫组织化学技术是根据抗原抗体反应和化学显色原理,组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。

常用的标记物有荧光素、酶和放射性同位素：
①、标记荧光素的称为免疫荧光法，常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(rhodamine)等。

②、标记酶的称为免疫酶法，常用的酶有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)等。

③、标记同位素的称为放射免疫法，常用的同位素有3H、14C、32S和31P等。

本实验免疫酶法。

用辣根过氧化物酶标记的二抗，然后用DAB(3,3-二氨基联苯胺)作为辣根过氧化物酶的作用底物来显色抗原存在部位，可见棕黄色产物。

标记抗原与抗体主要有两种方法：直接法与间接法。

本实验使用间接法，原因：①、对抗原的特异性标记较好，可以减少未标记上的一抗的干扰②、可以放大结合紧密的一抗的信号。

三、实验材料：
海拉系细胞，PBS缓冲液，0.5% Triton X-100 PBS，0.1%吐温20 PBS，一抗，二抗，含DAB的染液
四、实验方法：
将盖玻片长有细胞的一面朝上，在PBS中浸泡
v
弃去PBS 缓冲液，加入3.7%的甲醛PBS 缓冲液3ml ，固定10min 弃去甲醛PBS ，加入PBS 缓冲液浸泡10min 弃去PBS ，加入0.5% TritonX-100 PBS 缓冲液处理10min 弃去0.5% TritonX-100 PBS 缓冲液，用PBS 浸泡10min 弃去PBS ，加入含1％BSA 的PBS 溶液3ml ，室温温育10分钟 弃去
BSA PBS 向盖玻片上滴加稀释好的第一抗体液，平稳地放入37℃温箱中温育30分钟
使用0.1%吐温20的PBS缓冲液室温洗2次，每次5分钟
弃去吐温PBS，向盖玻片上滴加稀释好的第二抗体液，平稳地放入37℃温
箱中温育30分钟
使用0.1%吐温20的PBS缓冲液室温洗2次，每次10分钟
弃去吐温PBS，加入染色液3ml，暗处染色10min
向载玻片上滴加甘油，将盖玻片长有细胞的一面朝下，轻轻放上盖玻片，
在显微镜下观察
五、实验结果：
观察到海拉系细胞中有被小泡
六、总结：
１、为了放大第二抗体的信号以及增加其结合的特异性，本实验采取以下措施：
①、在甲醛固定后，加入含1％BSA 的PBS 溶液3ml ，室温温育10分钟是为了结合盖玻片上所有未结合蛋白的位点。

②、在样品经一抗处理后，使用0.1%吐温20的PBS 缓冲液室温洗2次，每次5分钟，是为了洗掉非特异性结合的一抗
有被小泡
③、在样品经二抗处理后，使用0.1%吐温20的PBS缓冲液室温洗2次，每次10分钟，洗掉非特异性结合的二抗，同时洗脱掉前一次吐温洗脱未洗脱掉的一抗，以及结合其上的二抗。

2、实验中各个试剂的作用为：
PBS：磷酸缓冲液，防止参与反应的蛋白质变性，保证一抗，二抗的活力
3.7%甲醛PBS缓冲液：固定细胞样品
0.5% Triton X-100 PBS缓冲液，TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 是一种非离子表面活性剂，它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性，使得成笼蛋白能够接触到BSA、一抗，以及后续二抗的结合与染液的结合
BSA(牛血清蛋白)：用于封闭盖玻片上所有未结合有蛋白的空白位点
吐温20（聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯）是一种非离子表面活性剂，用于洗掉结合不牢固的一抗或二抗
DAB染液：DAB(3,3-二氨基联苯胺)作为辣根过氧化物酶的作用底物来显色抗原存在部位，可见棕黄色产物
甘油：用于封片观察，短期封片可以使用甘油，长期封片需要树脂
2、观察结果中没有观察到细胞核，我认为是染色时染液的颜色覆盖住了细胞核的颜色。

七、思考题：
１、实验过程中所使用的一抗和二抗的浓度如果过高或者过低会出现什么样的实验结果？
①、如果一抗浓度过高，会导致非成笼蛋白与一抗结合，造成观察背景噪音太大；如果二抗的浓度过高，会导致非一抗与二抗结合，造成观察背景噪音太大。

过多的抗体也会影响洗脱效果，影响后续的染色效果。

②、如果一抗浓度过低，会导致与成笼蛋白结合的一抗过少，造成染色不明显；如果二抗的浓度过低，会导致与一抗结合的二抗太少，造成染色不足，影响观察。

２、请总结免疫细胞化学实验过程中的注意事项。

１、染液具有致癌性，甲醛溶液对人体有害，使用时要小心！
２、第一步染色时有细胞的一面要朝上，盖玻片之间不能重叠，防止细胞被刮掉。

３、加入一抗或二抗时，液体只要覆盖盖玻片即可
４、染色时，要在暗处进行，防止染液见光分解
５、在封片时，应将有细胞的一面朝下
６、整个实验应该仔细轻巧操作，防止细胞被刮蹭
７、在实验翻转盖玻片时，应用尖头镊子，同时注意不要让镊子头部触及到细胞
８、抗体处理时间，染色时间要把握合适，过长或过短都会导致实验结果不准确
９、抗体的浓度要把握合适，过长会导致实验背景噪音过大，过短会导致染色不足
１０、本实验步骤较多，时间较长，应特别注意各个步骤的顺序，防止遗漏。