膀胱癌中TERT启动子突变分析及其复发的意义

膀胱癌中TERT启动子突变分析及其复发的意义
刘扬;邢雪莎;王贺意;罗阳;王侠
【摘要】Objective To screen gene mutation in bladder cancer tissues and to explore the relation between TERT promoter mutations and recurrence of bladder cancer and tumor characteristics.Methods Fresh cancer tissues without formalin and 2cm non-tumor adjacent tissues (NATs) were taken within two hours after surgery and preserved at-80℃C.Genomic DNA was extracted.The TERT promoter region was amplified with polymerse chain reaction (PCR).The TERT promoter mutation sites were validated with Sanger sequencing.The association between the TERT promoter mutation and staging,grading and recurrence rate of bladder cancer was analyzed with Chi-square test.Results Amplification and mutation analysis were conducted in a total of 71 cases,and 45 patients were successfully followed up.Chi-square test proved that TERT promoter region mutation had obvious relevance with bladder cancer (P＜0.05),but not with tumor grade and staging (P＞0.05).The higher mutation rate in TERT promoter regions had significant statistical significance with the recurrence rate of electroscission in 0.5 ～1 year.Conclusion TERT promoter mutations occur frequently in the bladder urothelial carcinoma and the post-operative recurrence rate of mutant-type bladder tumor patients is significantly higher than that of non-mutant-type tumor patients.%目的对膀胱癌组织进行基因突变筛查,探讨TERT启动子区突变与膀胱癌复发及肿瘤特征之间的关系.方法取外科手术后2h内未添加甲醛的癌组织标本及癌旁2 cm以上的组织,在-80°
冰箱保存,提取组织全基因组DNA,应用PCR技术对DNA的TERT启动子区域进行扩增,应用Sanger测序分析TERT启动子突变位点.结果数据卡方检验证明与膀胱癌肿瘤分期、分级及复发率是否相关.结果对成功扩增的71例标本进行突变分析,45例患者成功随访,通过X2检验证明TERT启动子区域突变与膀胱癌的发生率有差异(P＜0.05),但与肿瘤分期、分级无差异性(P＞0.05),TERT启动子区域突变率越高与电切术后0.5～1年内复发率有显著统计学意义.结论 TERT启动子突变频繁发生在膀胱尿路上皮癌中,突变型膀胱肿瘤患者术后复发率明显高于非突变型肿瘤患者.
【期刊名称】《现代泌尿外科杂志》
【年(卷),期】2017(022)003
【总页数】5页(P176-180)
【关键词】膀胱癌;TERT启动子;突变;复发
【作者】刘扬;邢雪莎;王贺意;罗阳;王侠
【作者单位】中国医科大学附属盛京医院第三泌尿外科,辽宁沈阳 110021;中国医科大学细胞生物学系基因组,辽宁沈阳 110021;中国医科大学细胞生物学系基因组,辽宁沈阳 110021;中国医科大学细胞生物学系基因组,辽宁沈阳 110021;中国医科大学附属盛京医院第三泌尿外科,辽宁沈阳 110021
【正文语种】中文
【中图分类】R737.14
在我国膀胱肿瘤(tumor of bladder,BT)是泌尿系统最常见的肿瘤，端粒酶活性是近年发现与恶性肿瘤相关性最强的分子生物学指标。

在膀胱肿瘤中端粒酶逆转录酶
(telomerase reverse transcriptase，TERT)的表达与较低的预后和较高的复发率
相关[1]。

端粒对维持基因组的稳定性和完整性起着至关重要的作用。

在正常体细
胞内，端粒经过几轮细胞分裂后逐渐缩短，最终导致细胞衰老[2]。

正常情况下人
类体细胞端粒酶的检测结果是阴性的，但在85%的肿瘤中能检测到端粒酶活性[3]。

近年来，黑色素瘤中报道了TERT启动子区域存在两个体细胞突变[4-5]。

最常见
的两个体细胞突变发生在TERT起始子ATG上游-124位和-146位(此后分别称为
C228T和C250T)。

在TERT启动子产生的Ets/TCF检测到的突变特异性间接暗示了强力的选择参与性，因为端粒酶的表达在肿瘤细胞永生化起到一个至关重要的作用[2]。

这些突变对端粒酶稳定性具有重要的功能意义并且促使肿瘤化，也成为了
潜在的治疗靶点。

1.1 患者和组织样本总计有92例非选择性的存档患者的膀胱癌肿瘤组织(-80 ℃冰箱保存，癌组织92例，癌旁组织24例)。

所有患者均为2015年3月到2016年
1月就诊于中国医科大学附属盛京医院第一、第二、第三泌尿外科手术治疗的东北汉族人，手术方式包括经尿道膀胱肿物电切术及膀胱全切术，标本取自术后离体2 h以内，未经福尔马林浸泡的组织标本，癌组织为离体最典型的部分，癌旁组织为距离肉眼癌边缘2 cm以上的膀胱组织。

所有的组织标本均经过手术患者及家属同意后取得。

标本组织依据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)和
国际泌尿病理协会(The International Society of Urological Pathology,ISUP)的最新分类标准，膀胱癌的病理类型主要可分为：乳头状瘤、潜在低度恶性乳头状移行细胞瘤、高分化乳头状尿路上皮癌和低分化尿路上皮癌。

1.2 样品DNA的提取用苯酚抽提法提取膀胱癌及癌旁组织全基因组DNA。

组织
块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约0.5 g组织，放入1.5 mL离心管中，剪碎(<1 mm)。

加入490 μL SNET(SDS+生理盐水NaCl+EDTA+Tris-平衡酚)，10
μL蛋白酶K(10 mg/mL)，充分混匀后，封口，于56°C水浴震荡>3 h或过夜。

放置到室温，加入100 μL饱和氯化钠，混合均匀(先浑浊后澄清)，加入600
μLTris-平衡酚，混合均匀(乳糜状)后冰浴20 min。

用离心机在13 000 r/min×20 min下离心，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，移到一个新的1.5 mL离心管，加入等体积酚∶氯仿(1︰1)600 μL，颠倒混匀。

在13 000 r/min×10 min离心后，吸取上层转移到新的1.5 mL离心管中，加入600 μL异丙醇(于4 ℃预冷火与4 ℃冷沉淀)，沉淀10 min。

再次1 2000 r/min离心10 min，弃上清液，加入1 mL 70%乙醇，悬浮洗涤沉淀。

最后12 000 r/min离心5 min，弃上清，晾干(半透明状)。

1.3 Sanger测序法对TERT启动子分析将包含有热点突变位点的TERT启动子区
域(-555到+60)加入上游引物TERT Primer(F: 5′-GGCGGGATGTGACCAGATGT-3′)及下游引物(R: 5′-GGAACCAGCGACATGCGG-3′)进行PCR扩增，扩增样本
50 μL，其中包括2×Power Taq 25 μL，ddH2O 15 μL，上、下游引物各2.5 μL，DNA模板5 μL。

热循环条件如下：预变性94 ℃10 min；接下来94 ℃变性30 s，61.6 ℃退火30 s，74 ℃延生75 s，如此35个循环；最后74 ℃总延生10 min。

梯度PCR用于寻找最佳循环条件。

PCR扩增后的产物大小为1 235 bp,送往测序
前用电泳检测PCR是否成功：称取0.4 g琼脂糖和40 mL 1%TBE溶液。

混匀倒
入锥形瓶中，加热溶解混匀。

待冷却至不烫手时加入核酸染料，混匀，倒入已经插好梳子的配胶槽中，冷却30 min至1 h；将冷却好的凝胶拔掉梳子后放入电泳槽中(将有点样孔的一端靠近负极)然后按照顺序点样，每孔加入2 μL产物，在第一
个孔上点2 kb Marker溶液5 μL；打开电泳开关，200 V电泳20 min左右；电
泳结束后，将胶取出，放入透视镜下照射，拍照，读带(见图1A)。

然后将产物送
往博迈德基因技术(北京)有限公司测序。

测序结果回报后，应用Chromas软件寻
找测序图谱中的突变(套峰)，寻找出套峰点后，在UCSC基因库中比对TERT启动子正常序列，寻找出突变位点距离起始子ATG上游的位置(见图1A、1B)。

1.4 统计学方法 TERT启动子区突变与其他参数之间的关系用χ2检验。

如果
P<0.05说明差别具有统计学意义。

用SPSS17.0 统计软件完成相应统计分析。

所
有统计P值均为双尾计算。

2.1 Sanger测序结果 PCR扩增产物片段长度约为1 235 bp。

测序结果显示TERT 启动子区域突变发生在5号染色体1 295 228与1 295 250位点，突变类型均为
T碱基替换C碱基(图1A、1B)。

2.2 TERT启动子突变与膀胱癌的关系 TERT启动子区域的突变占所有标本的
22.54%(16/71)。

其中C228T和C250T突变在膀胱尿路上皮癌中的发生率分别为14.08%(10/71)、8.45%(6/71)。

将71例癌组织作为实验组，22例癌旁组织作为对照组，实验组中共16例组织筛出突变，对照组中均未筛出突变，结果显示TERT启动子突变与膀胱癌有明显相关性(χ2=4.742 1，P<0.05，表1)。

根据国际抗癌联盟(Union International Cancer Control,UICC)的2009年第7版TNM分期法，Ta～T1占21.67%(13/60)，其中61.54%为C228T突变，38.46%为
C250T突变；T2～T4占27.27%(3/11)，其中C228T与C250T突变比例分别为66.7%与33.3%。

见表1。

根据UICC将TX、T0、Ta、Tis及T1期的肿瘤纳入T～T1分组，称之为早期组；将T2～T4期的肿瘤纳入T2～T4组，称之为晚期组，结果显示TERT启动子区突变与膀胱癌早晚期无统计学差异(P>0.05)。

2.3 不同病理分级之间TERT启动子区突变情况的比较根据WHO 2004年膀胱尿路上皮癌恶性程度分级系统，TERT启动子区基因突变情况：乳头状瘤占0%(0/2)，低度恶性潜能尿路上皮乳头状瘤占25%(1/4)，乳头状尿路上皮癌低级别占
15.79%(3/19)，乳头状尿路上皮癌高级别占27.27%(12/44)。

将乳头状瘤、低度
恶性潜能尿路上皮癌及乳头状尿路上皮癌低级别均纳入到低级别组，将乳头状尿路上皮癌高级别纳入高级别组，结果显示TERT启动子区突变与不同病理分级之间无
统计学差异(P>0.05)。

2.4 TERT启动子区域突变与膀胱癌复发之间的关系对所收集标本当中行经尿道膀胱肿物电切术(transurethral resection of bladder tumor，TURBt)的47例患者进行随访6～12个月，其中2例患者失访。

对所收集的26例行根治性膀胱全切
标本的随访，该队列患者未发生远处转移，未纳入复发随访队列。

在6～12个月
期间患者复发共10人，占随访人数的22.22%(10/45)，其中3例患者膀胱癌组织中筛出突变。

表2显示经电切后的膀胱癌复发率与TERT启动子突变阳性有明显差异(χ2=7.471，P<0.05)。

因部分随访人群不够1年，故用人时为单位计算膀胱癌复发的发病密度[7]，结果显示经电切后的膀胱癌患者术后复发密度与TERT启动
子突变阳性有明显差异(χ2=10.817 8，P<0.05，表3)。

2.5 TERT启动子突变与其他临床特点之间的关系进一步分析膀胱癌组织中TERT
启动子区域突变与临床参数之间的关系，结果显示突变与年龄、性别及核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)阳性与否之间均无统计学意义
(P>0.05，表4)。

之前报道过的TERT启动子区域突变热点在所有可用的病例中成功完成筛查。

利用Sanger测序突变分析在71例癌组织及22例癌旁组织成功进行，在21例癌组织及2例癌旁病例中，由于不足的脱氧核糖核酸的质量核心启动子区域未能扩增。

总的来说，热点突变C228T(14.08%)和C250T(8.45%)是最常见的，且相互排斥。

自从第一次在黑色素瘤中发现了TERT启动子突变[4-5]，已经完成了许多研究，
以建立其在人类肿瘤遗传机制的作用。

黑色素瘤中报道了TERT启动子区域存在两个体细胞突变[4-5]。

最常见的两个体细胞突变发生在TERT起始子ATG上游-124
位和-146位。

BOJESEN等[7]报道了TERT启动子区SNP研究，提示C228T和
C250T突变不是SNPs。

这些突变发生在近乎70% 的黑色素瘤及细胞系中。

TERT 启动子区突变后会形成一段特殊的DNA碱基序列，5′-CCCCTTCCGGG-3′，该序列含有ETS转录因子结合位点，该位点大量募集ETS家族转录因子与之结合，随
后引起TERT表达的上调[5,8]。

TERT启动子突变与多种肿瘤类型有强烈的相关性[9]。

有报道称TERT启动子突变并不局限在黑色素瘤中，还在几种类型的肿瘤中
频繁出现，包括胶质瘤[8-9]、脂肪肉瘤[8]、尿路上皮肿瘤[9-12]和肝细胞癌[9,13]。

端粒对维持基因组的稳定性和完整性起着至关重要的作用，端粒的稳定性需要一种核糖核蛋白复合体，即端粒酶。

端粒酶由多种蛋白组成，其中包括TERT和它的RNA催化亚基。

失去端粒功能和无限增殖会导致细胞发生端端融合、染色体降解、断裂-融合-桥循环和遗传不稳定，导致基因变化的细胞获得进一步生长优势，最终发展成肿瘤细胞[14]。

TERT启动子突变在成人黑色素瘤中与端粒酶高度相关，这些突变分别加强了TERT编码启动子的转录活性[15]。

这些突变的后果还不完全清楚，但它们导致一
个2～4倍增加转录活性的影响[5]。

随后，这些突变被发现在其他几个恶性肿瘤，如膀胱癌、甲状腺癌或神经系统的癌症，并讨论是否作为早期的恶变导向[16]，端粒酶的表达和激活被认为是膀胱癌的一个重要特点。

膀胱癌中端粒酶激活的分子及细胞途径仍然未知。

TERT启动子突变普遍见于多种肿瘤中，并且在中国肿瘤人群中也有类似的分布[15]。

因为之前大多数大型报告都局限在西方人群，因此我们试图在中国东北人群中验证已发现的有意义的突变并寻找额外的TERT启动子突变。

最终我们评估出最常见的突变结果及其相关性。

本研究成功对71例样品的TERT基因核心启动子区域进行序列分析，结果表明TERT启动子区突变阳性率达22.54%，其中C228T和C250T阳性分别占14.08%
和8.45%，而癌旁组织均未发现突变，说明TERT启动子突变与膀胱癌有明显的相关性。

但突变与否与膀胱癌病理分级及临床分期并无统计学意义。

由此说明TERT 启动子区突变在膀胱癌早期阶段就已存在。

TERT启动子突变在非浸润性膀胱癌及浸润性膀胱癌中均有较高的频率，说明这些突变是尿路上皮致瘤的所有通路中的前提条件。

这种分布的原因目前尚不清楚，但有一种可能性就是端粒酶在不同细胞类型中均产生作用。

膀胱癌的生物学行为复杂多变，早期发现和严密随访是及时治疗膀胱癌的重要条件。

综上所述，我们的结果表明TERT启动子区突变在膀胱癌中显著发生，并且与膀胱癌行TUR-BT术后复发具有明显相关性，这可能与手术方案选择有关，因为活检
病理检查分级较高的患者选择膀胱全切，术后复发几率较低。

TERT启动子区突变可能通过上调TERT的表达，进而激活端粒酶，维持端粒的长度和结构，从而保护了染色体结构和功能，延迟了细胞的衰老凋亡，实现肿瘤细胞的永生化。

这可能也是TERT启动子区突变影响膀胱尿路上皮癌患者术后复发的重要分子机制之一。

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