植物组织培养课程论文

天津师范大学
生命科学学院
《植物组织培养》课程论文——百合的组织培养研究
摘要：百合是百合科百合属，多年生草本球根植物。

是著名的观赏花卉，可食用，有很高的利用价值。

利用组织培养进行繁育是百合无毒化和商品化的必要途径。

由于百合的常规繁殖率低，易感染病毒，所以对繁殖技术提出了更高的要求，人工繁殖技术对百合具有重要的意义。

本实验主要通过植物组织培养手段，以MS为基本培养基，以百合鳞茎为外植体，对其进行灭菌消毒，并置于温度为25摄氏度，湿度为80%的温箱中，8小时睡眠16小时光照的情况下进行培养。

随后观察其生长情况，并拍照记录。

本次实验外植体成功发育成愈伤组织，并长出芽。

此实验主要在于掌握植物组织培养技术，了解其方法过程。

关键词：组织培养；百合；无菌操作
百合的组织培养
目录
摘要 (I)
一、文献综述 (1)
1.1百合组织培养技术进展 (1)
1.2植物组织培养概述 (1)
参考文献： (2)
二、百合植物组织培养 (3)
2.1实验试剂 (3)
2.2仪器 (3)
2.3生物材料 (3)
三、实验步骤 (3)
3.1培养基的配制 (3)
3.1.1配制培养基母液的配制方法 (3)
3.1.2 完全培养基的制备 (4)
3.2兰州百合外植体灭菌处理和初代培养 (4)
四、实验结果及讨论 (5)
4.1实验结果 (5)
4.2讨论 (10)
一、文献综述
1.1百合组织培养技术进展
百合植物资源丰富，栽培历史悠久，花色多样，它不仅适用于庭院栽培，布置花境，也可盆栽观赏，并早已成为花卉研究领域的佼佼者。

百合虽然观赏性很高，但大多抗性很弱，尤其抗寒性。

一般在东北地区种植商品百合时，每年秋季必须起球，窖藏或者冷库存放，这大大增加了百合的生产成本，限制了东北地区花卉业的发展。

随着百合在国内外鲜切花市场的走俏，百合花生产和消费逐年增加，但由于百合种球繁殖率低，病毒侵染造成退化，难于满足切花生产需要。

目前主要采用组织培养进行百合脱毒和快速繁殖，以促进百合商品种球的生产。

但是百合试管苗小鳞茎较小，结鳞茎时间较长，移植成活率低，制约了工厂化商品生产。

目前国内繁殖百合主要通过进口鳞茎进行繁殖。

但是市场售价较高，而且有时鳞茎质量难以保证、繁殖率低、易造成鳞茎退化。

采用组织培养的方法在很短时间内可以得到大量的组培苗，而且一般在第二年即可开花。

[1]
1.2植物组织培养概述
植物组织培养是一种将植物体的部分细胞或组织与母体分离，在适当的条件下加以培养，使它们能够生长、发育、分化与增殖的技术。

原理是来自植物细胞的全能性分化能力，也就是植物体内的某一类细胞，能够独立发育并且分化成为完整的植物成体。

植物组织培养能够以少量的母体培养出大量的植物，这使植物组织培养有许多的用途，例如基础植物学与遗传学研究，以及农业上的育种与品种保留。

[2]
植物组织培养是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官、组织或细胞以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。

1902年，德国著名植物学家G.Haberlanclt根据细胞学理论，大胆地提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直到单个细胞，即植物体细胞，在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜力的观点。

1943年，美国人White在烟草愈伤组织培养中，偶然发现形成一个芽，证实了G.Haberlanclt的论点。

组织培养选用的基础培养基一般较多采用的是MS。

采用固体培养基较多，
因为相比液体培养基，固体培养基在操作上更方便，被广泛使用。

在基础培养基里添加一定的外源激素，可以诱导出愈伤组织、胚状体、不定芽、根等器官，最终可获得再生植株或者次生产物。

常用的激素类型有生长素类、细胞分裂素类、赤霉素等。

[3]
参考文献：
[1]:周威，《百合的组织培养》，科技向导，2011年第09期
[2]:https:///wiki/%E6%A4%8D%E7%89%A9%E7%B5%84%E7%B9%94
%E5%9F%B9%E9%A4%8A
[3]:梁一池，杨华，《植物组织培养技术的研究进展》，福建林学院学报，2002,
22(1):93-96
二、百合植物组织培养
2.1实验试剂
NH4NO3, KNO3, CaCl2•2H2O, MgSO4•7H2O, KH2PO4, KI, H2BO3，MnSO4•4H2O, ZnSO4•7H2O, Na2•MoO4•2H2O, CuSO4•5H2O, CoCl2•6H2O, Na2•EDTA•2H2O，FeSO4•7H2O，烟酸，甘氨酸, 盐酸硫胺素, 肌醇, 盐酸吡哆醇；琼脂，蔗糖，蒸馏水，NAA，6-BA，1mol/L HCl，1mol/L NaOH；75%酒精。

2.2仪器
冰箱、天平、酸度计或pH试纸、电炉、高压灭菌锅、超净工作台、光照培养箱、三角瓶、容量瓶、量筒、移液管、烧杯、培养皿、滤纸、牛皮纸、绳、玻璃棒、镊子、刀等。

2.3生物材料
百合
三、实验步骤
3.1培养基的配制
3.1.1配制培养基母液的配制方法
a)大量元素的配制：依次称取KNO3 19g、NH4NO3 16.5g、MgSO4•7H2O 3.7g、
KH2PO4 0.17g、CaCl2•2H2O 4.4g,分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后
再将它们混溶，以防互相发生反应，最后用容量瓶定容至1L,转入试剂瓶
中，贴上标签，置冰箱冷藏保存。

b)微量元素的配制：依次称取MnSO4•4H2O 2.23g、ZnSO4•7H2O 0.86g、
H3BO3 0.32g、KI 0.083g、Na2Mo•2H2O 0.025g、CuSO4•5H2O 0.0025g、
CoCl2•6H2O 0.0025g ,分别用少量的蒸馏水彻底溶解，再将它们混溶，最
后用容量瓶定容至1L,转入试剂瓶中，贴上标签，置冰箱冷藏保存。

c)铁盐的配制：称取FeSO4•7H20 1.390g、Na2•EDTA1.856g，分别用少量的
蒸馏水彻底溶解，再将它们混溶，最后用容量瓶定容至500ml，保存在玻
璃瓶中,贴上标签，置冰箱冷藏保存。

d)有机物母液的配制: 依次称取甘氨酸0.1g、盐酸硫胺素 0.005g、盐酸吡
哆醇0.025g、烟酸0.025g、肌醇5g，用少量蒸馏水充分溶解，最后定容
至250ml,转入试剂瓶中，贴上标签，置冰箱冷藏保存。

e)激素溶液的配制：分别称取6-BA、NAA各10mg，将6-BA用1ml的0.1mmol/L
的NaOH溶液溶解，将NAA用1ml无水乙醇预溶，待溶解完全后，分别用
容量瓶定容至100ml，即得到0.1mg/ml的母液（实验时按需要量取）。

3.1.2 完全培养基的制备
1.取出母液并按添加顺序放好，将实验所需的量筒，移液枪，烧杯，移液管，
吸耳球和玻璃棒等放在实验台上，以备实验所需。

2.取一干净的烧杯，加入1/3左右（配制培养基总量的1/3左右）的蒸馏水，
取大量元素母液150ml、微量元素母液15ml、铁盐母液15ml、机物母液
7.5ml，上述溶液移入容量瓶中，加蒸馏水定容。

3.将定容好的培养基倒入烧杯中，称取琼脂粉，倒入上面配好的溶液中，放
在电炉上加热，直到琼脂粉完全熔化溶液透明。

4.然后称取蔗糖45g搅拌溶解。

5.初代培养基按1mg/L 6-BA 15微升、0.1mg/L NAA1.5微升。

用移液枪精确
量取所需激素母液，加入培养基中。

6.用精密试纸或PH计调整pH至6.0。

用配制好的0.1mol/L的HCl和0.1mol/L
的NaOH溶液来调节pH值。

7.稍微冷却后，分装入以洗净的三角培养瓶中。

再用布塞和牛皮纸封口，最
后用绳子扎紧。

8.另取适量滤纸（多张/组）、培养皿（2套/组），用牛皮纸包好扎紧；另取
去离子水适量装入盐水瓶,盖好塞子；另取小镊子和刀等包好（2套/组）。

9.将步骤7、8所准备的物品统一放入高压锅内，120KPa灭菌30min左右。

灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固，放入超净
台备用。

在开始操作前将所用器材放入超净台，打开紫外灯进行消毒。

3.2兰州百合外植体灭菌处理和初代培养
将买来的新鲜兰州百合的鳞茎拨开，洗去上面的泥土，在用流动的自来水冲洗2h，用前再用蒸馏水洗1-2遍放到4度冰箱保存待用。

在超净工作台上采用75%的酒精溶液侵泡90s，去离子水水冲洗3次，然后用3%NaClO3溶液浸泡15min，用去离子水冲洗3次，进行外植体消毒处理。

然后放在无菌滤纸上，用无菌刀切成
0.5cm大小的小块，凹面向上，接种于培养基上。

每人接种1瓶，每瓶接种3块外植体。

培养条件： 25℃、湿度80%、光照8h/d、光照强度2000lx。

每5天向培养箱中加一次水，每隔两天进行观察和记录生长情况，一周左右鳞片的颜色会发生变化，由刚开始的白色慢慢有点变紫色，培养10天左右鳞片由淡绿色慢慢变为绿色。

四、实验结果及讨论
4.1实验结果
图1：5月20日，第4天，生长正常，边缘变成浅黑色
图2、3：5月23日，第7天，无染菌现象，黑色边缘加深，表面有紫色纹路
图4:5月27日，第11天，表面紫色加深，有绿色出现
图5:5月30日，第14天，表面绿色加深，无染菌现象
图6：6月3日，第18天，和上次相比没有太大变化，无染菌现象
图7：6月6日，第21天，无太大变化，此时边缘变为深黑色
图8、9：6月14日，第29天，长出芽
图10：6月22日，第37天，芽变大
4.2讨论
在本次百合的植物组织培养实验中，我接种的锥形瓶中一次就成功长出了愈伤组织，且没有出现染菌现象。

在接种后第十天左右，百合鳞茎表面出现绿色；第18天时观察到绿色加深；第29天时长出芽。

总结实验成功原因如下：1、实验台、器材等灭菌彻底，无菌操作严格，包扎严密，因此没有杂菌污染；2、配制母液时各试剂用量严格控制，保证没有某些物质过多或过少影响百合生长；3、培养环境适宜；4、接种时用镊子动作要轻，防止破坏组织；5、在接种过程中控制百合鳞茎在酒精中的浸泡时间；6、选取较为强壮的百合鳞茎，切成适宜的大小。

但是在培养过程中外植体生长速度较慢，可能是因为培养箱内湿度不够，接种时鳞茎凹面朝下。

通过本次实验，我认识到了无菌操作的重要性，并且在老师和学姐的悉心指导下，规范了操作动作，熟悉了实验步骤，积累了实战经验，为以后各学科的实验操作打下坚固基础。

本课程论文是在李硕老师和学姐的悉心指导下完成的，特此感谢！。