生物芯片分析
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生物芯片分析
本章提纲
生物芯片简介与沿革 生物芯片的分类 基因芯片基本原理、流程与应用 蛋白质芯片及应用 其它芯片技术
第一节 生物芯片简介与沿革
什么是生物芯片 生物芯片(Biochip)主要指
通过平面微细加工技术，在 固体芯片表面等载体上的微 型生物化学分析系统，以实 现对细胞、蛋白质、核酸以
图像处理
1. 栅格化：确定点的位置 2. 图象分割 (Segmentation)：将点从背景中分离出来。 3. 抽提亮度：各个像素亮度的平均值 (mean)或中位数
(median) 4. 背景校正：局部或全局
植根区域生长法(SRG) Fixed Circle
基因表达量的定量
对于每个点，我们可以计算 Red intensity = Rfg - Rbg
1. cDNA microarrays: 将500~5,000bp的cDNA固 载到介质上 (例如玻璃)，Stanford开发设计，通 常为双通道
2. DNA chips: 将寡核苷酸探针 (20~80-mer) 合成 到芯片上，Affymetrix开发设计，通常为单通道
(1) cDNA microarrays
按实验要求分类
1. 单通道 (Single Channel): 一次检验一种状态 2. 双通道 (Dual Channel): 差异表达基因的筛选
1 片上原位合成寡核苷酸点阵芯片（ONA） 2 微量点样技术制作的CDNA 点阵芯片（CDA） ONA特点： （1）易寻址，利用组合化学的原理安排各寡核苷
(1) 差异表达基因的分析
1.差异表达基因的分析: 寻找处理前后表达上调或者 下调的基因
2. Are the treatments different 3. 使用标准的统计学方法检验 (t-test or f-test)，发
现统计显著性差异表达的基因， 4. 如果处理本身并不显著，则结果无意义
统计学分析
Red/green 比值存在亮度的倾向
M = log2R/G = log2R - log2G
Values should scatter about zero.
= (log2R + log2G )/2
数据标准化
before
after
3. 基因芯片的数据分析
(1) 差异表达基因的分析 (2) 基因共表达分析 (3) 基因表达数据的聚类 (4) 基因表达数据的分类 (5) Map to GO (6) Gene regulatory network
Southern hybridization
Juang RH (2004) BCbasics
基因芯片的密度：100-1 million DNA 探针/1cm2
碱基互补
将样品中的DNA/RNA表上 荧光标记，则可以定量检验 基因的表达水平
基因芯片流程
样品制备
杂交
芯片制备
杂交信号检测
数据分析
实验流程
1. 一般选择双尾分布 2. 异方差双样本检验 3. Excel函数：=TTEST(B2:D2,E2:G2,2,3) 4. C：对照组；T：实验组
Multiple Comparisons
1. 在基因芯片的实验中，每一个基因/探针，都是一个 独立的实验
2. 基因芯片：高通量，>1,000个基因/探针 3. 因此，无论怎么比较，总会有一些基因会是统计显
cDNA clones
cDNA microarrays的制备
Robot spotter 普通的盖玻片
差异表达基因的筛选
Treatment / control Normal / tumor tissue Brain / liver …
点样后的cDNA Microarrays
基因表达的数据
1 2
基因芯片发展历史
Southern & Northern Blot Dot Blot
Macroarray
Microarray
基因芯片
1. 根据免疫测定的 (immunoassay)的方法 予以改进
2. 高通量、点阵以及Northern杂交 3. 同时测定细胞内数千个基因的表达情况 4. 芯片的体积非常小：微量样品的检测 5. 基因表达情况的定量分析
中国在生物芯片领域起步较晚，我国是从一九九 七年才开始对生物芯片研究，而国外从八十年代 起就开始研制生物芯片。
中国医药生物技术协会生物芯片分会——国际生 物芯片领域的第一个行业性组织2006在北京成立 。
中国在北京、上海、陕西、天津、南京建立了五 大生物芯片研发和产业化基地 。
我国生物芯片产业尚未形成统一的技术标准，不 规范。在产品认证认可方面也存在与国际惯例不 接轨的情况。
Genes 3
4 5
mRNA samples
sample1 sample2 sample3 sample4 sample5 …
0.46 0.30 0.80 1.51 0.90 ... -0.10 0.49 0.24 0.06 0.46 ... 0.15 0.74 0.04 0.10 0.20 ... -0.45 -1.03 -0.79 -0.56 -0.32 ... -0.06 1.06 1.35 1.09 -1.09 ...
探针长度：25 bp 每个基因：22-40个探针 Perfect Match (PM) vs.
MisMatch (MM) probes
点样后的Gene chip
总结
基因芯片的实验流程
2. 图像处理与数据标准化
单通道基因芯片 white (very high) red (high) Yellow (a little high) green (medium) blue (low) black (no)
按探针分类 寡核苷酸阵列（芯片） DNA阵列 基因芯片 cDNA芯片 RNA芯片
Comparison of DNA Chip Technologies
Oligo-Chip
8 n or 20 n
cDNA-Chip
< 2,000 n
Genomic Chip
> 50,000 n
sequencing expression
第二节 生物芯片的分类
一般分类
根据用途还可以把生物芯片分为两类： 信息生物芯片和功能生物芯片
第三节 基因芯片 ——基本原理、流程与应用
本节内容提要
1. 简介 2. 图像处理与数据标准化 3. 基因芯片的数据分析 4. 芯片工具&数据库
简介
基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵列 (Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过 高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或 排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面， 以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交 原理，进行大量的基因表达及检测等研究的 技术。
芯片上每平方厘米可密集排列成千上 万个生物分子(Microarray)，能快速准 确地检测细胞、蛋白质、DNA及其他 生物组分，并获取样品中的有关信息 ，其效率是传统检测方法的成百上千 倍。
生物芯片分析基本流程
点阵固定 光刻合成 微量点样 喷墨
光化学检测 电化学检测
试样处理 纯化、标记
反应或杂交
crosshyb.) Hybridization efficiency (lots of factors) Detection technology (signal type, efficiency, noise)
基因芯片技术的类型
按技术手段、探针类型分类
1. Short oligonucleotide arrays (Affymetrix) 2. cDNA arrays (Brown/Botstein) 3. Long oligo arrays (Agilent) 4. Serial analysis of gene expression (SAGE)
Gene expression level of gene i in mRNA sample j
Log (Red intensity / Green intensity) =
Log(Avg. PM - Avg. MM)
(1) DNA chips
DNA chips的制备：Affymetrix photolitography
fg = foreground, bg = background, and Green intensity = Gfg - Gbg
and combine them in the log (base 2) ratio Log2( Red intensity / Green intensity)
Green intensity (medium): ~1
洗涤
计算处理
检测扫描
建立
1996年美国Affymetrix公司成功地制作出 世界上首批用于药物筛选和实验室试验用 的生物芯片，并制作出相应的芯片系统。 此外，美国的Hyseq公司、Aurora公司、 Nanogen公司、Incyte公司等也在积极开 展DNA芯片研究工作。近二年，摩托罗拉 、惠普、IBM等跨国公司也相继投以巨资 加入生物芯片的研究开发。
基因表达情况的定量测定
1. 发现在特定生长时期，或者随着环境变化，那些 基因的表达收到诱导或者抑制
2. 在相同条件下，上调或者下调变化规律相似的基 因，可能具有功能上的关联
3. 可以从共表达的基因中寻找调控模体 4. 基因表达的模式可以用来表征异常的细胞调控，
例如，癌症的诊断
基因芯片分类
按芯片制备方法分类 原位合成芯片（synthetic genechip） DNA微阵列芯片（DNA microarray）
expression
genomic analysis
Sensitivity of DNA chip based assays is a function of: Probe and target DNA/RNA (Complexity) Chip surface (autofluorescence & non-spec. bkg) Attachment chemistry/methodology (hyb. efficiency &
log signal intensity
Microarray: 误差的来源
系统的 随机的
log RNA abundance
Microarray: 误差的来、混合均匀程度等 4. 探针的标记 5. RNA的抽提 6. 加样 7. 其他
酸的位点，芯片反应后易寻址；
（2）点位牢固，用表面化学方法处理基片(玻璃、 硅片、尼龙片)，使核苷酸固定在基片上；
（3）定点合成，光导向平板印刷技术，芯片表面可 用屏蔽物屏蔽，光照选择性脱保护，有利于定点 合成寡核苷酸中的各个碱基；目前技术： 1.6cm2；40万个点；20个核苷酸；
两类主流的DNA芯片
Array1为第一个数据集 Array2为第二个数据集 Tails指示分布曲线的尾数。如果 tails = 1，函数
TTEST 使用单尾分布。如果 tails = 2，函数 TTEST 使 用双尾分布 Type为 t 检验的类型
1 成对 2 等方差双样本检验 3 异方差双样本检验
P-value: 学生分布
著性差异表的 —— 可能是随机产生的 4. 如何评估表达差异基因预测的有效性？ 5. 例：1,000个探针的双通道芯片，以p-value < 0.01
为域值，发现7个上调基因，5个下调基因，分析结 果是否具有统计学意义？
1. Fold change, 一般2-fold increase or decrease (平行实验的样本较少)
2. p-value (平行实验的样本较多)
under-expressed
over-expressed
/2
/2
P-value: 学生分布
1. T-test: 学生分布 2. Excel函数：TTEST(array1,array2,tails,type)
基因芯片的原理
依据双螺旋原理，核酸分子杂交技术， 在靶标样品与探针之间进行选择性反应， 将反应一方(探针)固定在芯片上，另一方( 荧光标记,即制备好的cDNA，分别标记绿 色的Cy3和红色的Cy5)通过流路或加至芯 片上。
核酸杂交
DNA1
RNA
DNA2 Probe
Northern hybridization
本章提纲
生物芯片简介与沿革 生物芯片的分类 基因芯片基本原理、流程与应用 蛋白质芯片及应用 其它芯片技术
第一节 生物芯片简介与沿革
什么是生物芯片 生物芯片(Biochip)主要指
通过平面微细加工技术，在 固体芯片表面等载体上的微 型生物化学分析系统，以实 现对细胞、蛋白质、核酸以
图像处理
1. 栅格化：确定点的位置 2. 图象分割 (Segmentation)：将点从背景中分离出来。 3. 抽提亮度：各个像素亮度的平均值 (mean)或中位数
(median) 4. 背景校正：局部或全局
植根区域生长法(SRG) Fixed Circle
基因表达量的定量
对于每个点，我们可以计算 Red intensity = Rfg - Rbg
1. cDNA microarrays: 将500~5,000bp的cDNA固 载到介质上 (例如玻璃)，Stanford开发设计，通 常为双通道
2. DNA chips: 将寡核苷酸探针 (20~80-mer) 合成 到芯片上，Affymetrix开发设计，通常为单通道
(1) cDNA microarrays
按实验要求分类
1. 单通道 (Single Channel): 一次检验一种状态 2. 双通道 (Dual Channel): 差异表达基因的筛选
1 片上原位合成寡核苷酸点阵芯片（ONA） 2 微量点样技术制作的CDNA 点阵芯片（CDA） ONA特点： （1）易寻址，利用组合化学的原理安排各寡核苷
(1) 差异表达基因的分析
1.差异表达基因的分析: 寻找处理前后表达上调或者 下调的基因
2. Are the treatments different 3. 使用标准的统计学方法检验 (t-test or f-test)，发
现统计显著性差异表达的基因， 4. 如果处理本身并不显著，则结果无意义
统计学分析
Red/green 比值存在亮度的倾向
M = log2R/G = log2R - log2G
Values should scatter about zero.
= (log2R + log2G )/2
数据标准化
before
after
3. 基因芯片的数据分析
(1) 差异表达基因的分析 (2) 基因共表达分析 (3) 基因表达数据的聚类 (4) 基因表达数据的分类 (5) Map to GO (6) Gene regulatory network
Southern hybridization
Juang RH (2004) BCbasics
基因芯片的密度：100-1 million DNA 探针/1cm2
碱基互补
将样品中的DNA/RNA表上 荧光标记，则可以定量检验 基因的表达水平
基因芯片流程
样品制备
杂交
芯片制备
杂交信号检测
数据分析
实验流程
1. 一般选择双尾分布 2. 异方差双样本检验 3. Excel函数：=TTEST(B2:D2,E2:G2,2,3) 4. C：对照组；T：实验组
Multiple Comparisons
1. 在基因芯片的实验中，每一个基因/探针，都是一个 独立的实验
2. 基因芯片：高通量，>1,000个基因/探针 3. 因此，无论怎么比较，总会有一些基因会是统计显
cDNA clones
cDNA microarrays的制备
Robot spotter 普通的盖玻片
差异表达基因的筛选
Treatment / control Normal / tumor tissue Brain / liver …
点样后的cDNA Microarrays
基因表达的数据
1 2
基因芯片发展历史
Southern & Northern Blot Dot Blot
Macroarray
Microarray
基因芯片
1. 根据免疫测定的 (immunoassay)的方法 予以改进
2. 高通量、点阵以及Northern杂交 3. 同时测定细胞内数千个基因的表达情况 4. 芯片的体积非常小：微量样品的检测 5. 基因表达情况的定量分析
中国在生物芯片领域起步较晚，我国是从一九九 七年才开始对生物芯片研究，而国外从八十年代 起就开始研制生物芯片。
中国医药生物技术协会生物芯片分会——国际生 物芯片领域的第一个行业性组织2006在北京成立 。
中国在北京、上海、陕西、天津、南京建立了五 大生物芯片研发和产业化基地 。
我国生物芯片产业尚未形成统一的技术标准，不 规范。在产品认证认可方面也存在与国际惯例不 接轨的情况。
Genes 3
4 5
mRNA samples
sample1 sample2 sample3 sample4 sample5 …
0.46 0.30 0.80 1.51 0.90 ... -0.10 0.49 0.24 0.06 0.46 ... 0.15 0.74 0.04 0.10 0.20 ... -0.45 -1.03 -0.79 -0.56 -0.32 ... -0.06 1.06 1.35 1.09 -1.09 ...
探针长度：25 bp 每个基因：22-40个探针 Perfect Match (PM) vs.
MisMatch (MM) probes
点样后的Gene chip
总结
基因芯片的实验流程
2. 图像处理与数据标准化
单通道基因芯片 white (very high) red (high) Yellow (a little high) green (medium) blue (low) black (no)
按探针分类 寡核苷酸阵列（芯片） DNA阵列 基因芯片 cDNA芯片 RNA芯片
Comparison of DNA Chip Technologies
Oligo-Chip
8 n or 20 n
cDNA-Chip
< 2,000 n
Genomic Chip
> 50,000 n
sequencing expression
第二节 生物芯片的分类
一般分类
根据用途还可以把生物芯片分为两类： 信息生物芯片和功能生物芯片
第三节 基因芯片 ——基本原理、流程与应用
本节内容提要
1. 简介 2. 图像处理与数据标准化 3. 基因芯片的数据分析 4. 芯片工具&数据库
简介
基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵列 (Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过 高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或 排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面， 以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交 原理，进行大量的基因表达及检测等研究的 技术。
芯片上每平方厘米可密集排列成千上 万个生物分子(Microarray)，能快速准 确地检测细胞、蛋白质、DNA及其他 生物组分，并获取样品中的有关信息 ，其效率是传统检测方法的成百上千 倍。
生物芯片分析基本流程
点阵固定 光刻合成 微量点样 喷墨
光化学检测 电化学检测
试样处理 纯化、标记
反应或杂交
crosshyb.) Hybridization efficiency (lots of factors) Detection technology (signal type, efficiency, noise)
基因芯片技术的类型
按技术手段、探针类型分类
1. Short oligonucleotide arrays (Affymetrix) 2. cDNA arrays (Brown/Botstein) 3. Long oligo arrays (Agilent) 4. Serial analysis of gene expression (SAGE)
Gene expression level of gene i in mRNA sample j
Log (Red intensity / Green intensity) =
Log(Avg. PM - Avg. MM)
(1) DNA chips
DNA chips的制备：Affymetrix photolitography
fg = foreground, bg = background, and Green intensity = Gfg - Gbg
and combine them in the log (base 2) ratio Log2( Red intensity / Green intensity)
Green intensity (medium): ~1
洗涤
计算处理
检测扫描
建立
1996年美国Affymetrix公司成功地制作出 世界上首批用于药物筛选和实验室试验用 的生物芯片，并制作出相应的芯片系统。 此外，美国的Hyseq公司、Aurora公司、 Nanogen公司、Incyte公司等也在积极开 展DNA芯片研究工作。近二年，摩托罗拉 、惠普、IBM等跨国公司也相继投以巨资 加入生物芯片的研究开发。
基因表达情况的定量测定
1. 发现在特定生长时期，或者随着环境变化，那些 基因的表达收到诱导或者抑制
2. 在相同条件下，上调或者下调变化规律相似的基 因，可能具有功能上的关联
3. 可以从共表达的基因中寻找调控模体 4. 基因表达的模式可以用来表征异常的细胞调控，
例如，癌症的诊断
基因芯片分类
按芯片制备方法分类 原位合成芯片（synthetic genechip） DNA微阵列芯片（DNA microarray）
expression
genomic analysis
Sensitivity of DNA chip based assays is a function of: Probe and target DNA/RNA (Complexity) Chip surface (autofluorescence & non-spec. bkg) Attachment chemistry/methodology (hyb. efficiency &
log signal intensity
Microarray: 误差的来源
系统的 随机的
log RNA abundance
Microarray: 误差的来、混合均匀程度等 4. 探针的标记 5. RNA的抽提 6. 加样 7. 其他
酸的位点，芯片反应后易寻址；
（2）点位牢固，用表面化学方法处理基片(玻璃、 硅片、尼龙片)，使核苷酸固定在基片上；
（3）定点合成，光导向平板印刷技术，芯片表面可 用屏蔽物屏蔽，光照选择性脱保护，有利于定点 合成寡核苷酸中的各个碱基；目前技术： 1.6cm2；40万个点；20个核苷酸；
两类主流的DNA芯片
Array1为第一个数据集 Array2为第二个数据集 Tails指示分布曲线的尾数。如果 tails = 1，函数
TTEST 使用单尾分布。如果 tails = 2，函数 TTEST 使 用双尾分布 Type为 t 检验的类型
1 成对 2 等方差双样本检验 3 异方差双样本检验
P-value: 学生分布
著性差异表的 —— 可能是随机产生的 4. 如何评估表达差异基因预测的有效性？ 5. 例：1,000个探针的双通道芯片，以p-value < 0.01
为域值，发现7个上调基因，5个下调基因，分析结 果是否具有统计学意义？
1. Fold change, 一般2-fold increase or decrease (平行实验的样本较少)
2. p-value (平行实验的样本较多)
under-expressed
over-expressed
/2
/2
P-value: 学生分布
1. T-test: 学生分布 2. Excel函数：TTEST(array1,array2,tails,type)
基因芯片的原理
依据双螺旋原理，核酸分子杂交技术， 在靶标样品与探针之间进行选择性反应， 将反应一方(探针)固定在芯片上，另一方( 荧光标记,即制备好的cDNA，分别标记绿 色的Cy3和红色的Cy5)通过流路或加至芯 片上。
核酸杂交
DNA1
RNA
DNA2 Probe
Northern hybridization