白藓种壳粗提物体外抑菌作用的研究

白藓种壳粗提物体外抑菌作用的研究
丁芬
【摘要】白藓(Dictamnus dasycarpus Turcz)为芸香科(Rutaceae)白藓属(Dictamnus)植物.本实验主要对黑龙江牡丹江地区白藓的95％乙醇提取物通过纸片琼脂扩散法和MIC法进行了抑菌实验.研究结果表明:白藓种壳醇提物的氯仿相、乙酸乙醇相萃取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草杆菌的抑菌作用相似,对变形杆菌的抑制作用主要表现在其中等强度的极性部位乙酸乙酯萃取相.从上述实验结果可得出结论:极性较强的乙酸乙酯相提取物对4种细菌抑菌效果较为突出.白藓种壳粗提物氯仿相对供试菌的最小抑菌浓度分别是金葡菌1.57 mg· ml-1、大肠杆菌1.57mg· ml-1、枯草杆菌3.13 mg.ml-1,变形杆菌3.13 mg·ml-1.白藓种壳粗提物乙酸乙酯相对供试菌的最小抑菌浓度分别:金葡菌1.57 mg·ml-1、大肠杆菌1.57 mg· ml-1、枯草杆菌3.13 mg·ml-1,且对变形杆菌无抑菌效果.
【期刊名称】《黑龙江医药》
【年(卷),期】2013(026)001
【总页数】2页(P58-59)
【关键词】白藓;抑菌;纸片琼脂扩散法;MIC法
【作者】丁芬
【作者单位】哈尔滨圣泰生物制药有限公司,黑龙江哈尔滨150025
【正文语种】中文
【中图分类】R285
1 实验过程
1.1 培养基的制备
LB(Luria－Bertani)固体培养基:45g营养琼脂加1000ml蒸馏水煮沸后定容。

于121℃灭菌20min。

LB液体培养基:牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml、调 PH7.2－7.4于121℃灭菌20min。

1.2 白藓种壳提取液的制备[1－2]
采用溶剂冷浸法:将采集的白藓全草清洗干净、阴处晒干，挑选出阴干的白藓种壳，将其粉碎、过筛。

准确称取330g种壳干粉，放入锥形瓶中，按料液比1:5加入95%的乙醇水溶液，然后于室温下浸提24h，浸提过程每隔2h搅拌一次，抽滤，重复3次，将滤液合并，用旋转蒸发仪减压浓缩至无乙醇味，最后得浓缩液A0为250ml。

密封保存于4℃冰箱中备用。

1.3 白藓种壳不同溶剂提取物的制备
采用液－液萃取法:将提取的浓缩液依次用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正
丁醇萃取，每种溶剂萃取3次，合并3次萃取液，减压浓缩至蒸干溶剂，分别获
得石油醚萃取相(A1)、氯仿萃取相(A2)、乙酸乙酯萃取相(A3)和水萃取相(A4)。

1.4 样品的制备
准确称取A2、A3，分别溶于DMSO中配制成25mg/ml的溶液。

头孢氨苄霉素(T)配制成10mg/ml作为阳性对照。

每种样品经微孔滤膜(孔径0.22μm)过滤灭菌后待用。

A1、A4、萃取物质量太少，因此未被选用。

1.5 菌液的制备
在无菌室中将供试菌种移接入相对应的试管斜面培养基上，进行活化，细菌置于37℃培养箱中培养24 h，用无菌水配制成1×107－1×108CFU/ml的菌液。

1.6 体外抑菌试验(滤纸片法)
用打孔器将滤纸打成直径为10mm的圆纸片，121℃灭菌30min，在每种待测样品中浸入无菌滤纸片，充分浸泡后取出、晾干。

在超净工作台上将灭菌后的固体培养基倒入无菌培养皿中，每皿20ml左右。

待冷却凝固后，加入制备好的菌悬液各0.1ml用涂布棒将菌液涂布均匀。

用无菌镊子夹取含样品液的滤纸片贴在培养基表面。

每皿贴3片，每个菌种3次重复，放在37℃恒温培养箱中培养24 h，用游标卡尺测定其抑菌圈直径，取3个平行的平均值。

以DMSO做为空白对照。

1.7 最低抑菌浓度(M IC值)的测定
以A1为例:取灭菌试管若干支，按每组9支进行分组。

第1－7支试管中加入灭菌的营养琼脂培养基2ml，向第1支试管中加入2ml药液，混匀后吸出2ml加至2号试管中，如此稀释至第7管，此管弃去2ml。

则各管药物稀释倍数依次为 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128，药液浓度分别为12.5、6.25、3.13、1.57、0.78、0.39、0.20mg/ml。

然后向各管中加入0.1ml的菌悬液。

第8支试管中加
入2 ml LB液体培养基不加样品液作为阳性对照，第9支试管中加入提取液但不
加菌悬液作为阴性对照，于37℃培养24h，观察抑菌效果。

试验重复3次。

培养基透明为无菌生长，混浊为有菌生长。

以无菌生长的最低药物浓度作为最低抑菌浓度(MIC)。

对药液颜色较深、肉眼不宜判定有无细菌生长者，在营养琼脂平板上划线接种，37℃恒温培养24h后取出，以无细菌生长平板内药物的最小浓度为
此药物对该菌株的最低抑菌浓度[3－5]。

其余样品操作方法同A1。

1.8 实验数据处理
1.8.1 三氯甲烷相抑菌圈法抑菌效果分析
表1 白藓种壳氯仿相乙酸乙酯相滤纸片法的抑菌结果注:“－”没有抑菌活性样品
液浓度:25 mg.ml－1供试菌种Testing strain Diameter of bacteriostasis/mm
A2 A3抑菌圈直径T金黄色葡萄球菌Bacillus subtilis 12.7 12.8 16.0
Staphylococcus aureus 15.3 15.0 30.1大肠杆菌Escherichia coli 14.5 14.1 24.1变形杆菌Proteus vulgaris 13.2 －－枯草杆菌
从以上数据可以得出:白藓种壳粗提物氯仿相的抑菌圈直径金葡菌＞大肠杆菌＞变形杆菌＞枯草杆菌。

白藓种壳粗提物乙酸乙酯相对菌株的抑制效果:金葡菌＞大肠杆菌＞枯草杆菌，对变形杆菌无抑菌效果。

其中金黄色葡萄球菌、枯草杆菌为革兰氏阳性菌，大肠杆菌、变形杆菌为革兰氏阴性菌。

白藓种壳粗提物氯仿相和乙酸乙酯萃取相的抑菌圈直径结果趋势基本一致，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果强于变形杆菌和枯草杆菌，且乙酸乙酯相对变形杆菌不具抑菌作用。

1.8.2 三氯甲烷相和乙酸乙酯相对供试菌的最小抑菌浓度研究
表2 白藓种壳提物对供试菌的最小抑菌浓度注:“－”没有抑菌活性“+”无菌生长显示对应的拉丁字符的拼音MIC/mg.ml －1萃取相Extraction phase金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus Escherichia coli变形杆菌Proteus vulgaris 枯草杆菌大肠杆菌Bacillus subtilis 1.57 1.57 3.13 3.13 A31.571.57－3.13阳性－－－－阴性 + + + +A2 T0.160.31－1.25
从以上数据可以得出:白藓种壳粗提物氯仿相对供试菌的最小抑菌浓度分别是金葡菌1.57 mg.ml－1、大肠杆菌1.57mg.ml－1、枯草杆菌 3.13 mg.ml－1，变形杆菌 3.13 mg.ml－1。

白藓种壳粗提物乙酸乙酯相对供试菌的最小抑菌浓度分别:金葡菌 1.57 mg.ml－1、大肠杆菌 1.57 mg.ml－1、枯草杆菌 3.13 mg.ml－1，且对变形杆菌无抑菌效果。

其中金黄色葡萄球菌、枯草杆菌为革兰氏阳性菌，大肠杆菌、变形杆菌为革兰氏阴性菌。

阳性对照均没有抑菌活性，阴性对照均为无菌生长。

符合抑菌实验要求。

2 研究结论
氯仿相和乙酸乙酯相对四种供试菌都具有较好的抑菌效果，但抑菌效果不同。

其中
氯仿相和乙酸乙酯相对大肠杆菌、金葡菌抑菌效果较好，其最低抑菌浓度均为
1.57mg/ml，氯仿相对变形杆菌和枯草杆菌抑菌效果稍差，其最低抑菌浓度均为3.13mg/ml;乙酸乙酯相对枯草杆菌的最小抑菌浓度为3.13mg/ml，且对变形杆菌不具抑菌作用。

白藓种壳的两个萃取相对金葡菌、大肠杆菌和枯草杆菌的抑菌作用相似，对变形杆菌的抑制作用主要表现在其中等强度的极性部位乙酸乙酯萃取相。

结果证明本实验方法是可以实施，希望能为我国芸香科植物的抑菌药理活性提供科学依据。

参考文献
[1]袁呈山，赵培华.白藓化学成分及其生物活性研究[C].甘肃:兰州大学出版社.1997，5.
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