简易快速高效制备T载体
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T4 DNA 聚合酶消化后, 可 根据需要进行不同处理, 如果 要求严格, 可通过电泳回收去 除杂蛋白和寡核苷酸。如 果仅 与 某 一 DNA 片 段 连 接 , 可 直 接用乙醇沉淀, 离心干燥后, 就可进行 TA 连接。
利用紫外分光光度计, 调 整 T 载 体 溶 液 浓 度 达 到 50
36 卷 2 期
分析表 1 数据可知, pMD18"T 的平均白斑率为 99.4 %,
1 μg 载体可得到 3.55 万个转化菌落, 而自制 T 载体的平均
白 斑 率 为 99.7 %, 1 μg 载 体 可 得 到 3.38 万 个 转 化 菌 落 。另
外, 随机各挑取 12 个白斑单菌落, 进行菌落 PCR, 琼脂糖电 泳的结果证明都有外源片断插入。
PCR 作为分子生物学的一项基本技术, 被广泛 用 于 体 外扩增 DNA 片段, 而 PCR 产物的克隆是对其进行鉴定、扩 增 以 及实 现 PCR 产 物 多 种 用 途 的 必经 之 路 。因 此 , 近 年 来 人 们围 绕 如 何 提 高 PCR 产 物 的 克 隆效 率 进 行 了 一 系 列 研 究[1-2]。不过现有的克隆载体虽然能够达到克隆的目的, 但是 也有 一 定 的 不 足 之 处 。例 如有 的 载 体 容 易 自 连 , 有 的 不 好 筛选阳性克隆, 有的费用较高, 且在一般情况下克隆效率 都不太高。笔者采用新方法制备了一种新的 T 载体, 该载体 具有成本低廉、使用方便、效率高等特点, 特别适合 经费 不 足或者购买不方便的偏僻地区使用。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌 株 和 载 体 。E.coli JM109、pUC19 由 长 江 大 学 生 命 科学学院实验室保存, pMD18!T Vector 购于 TaKaRa 公司。 1.1.2 主要 试 剂 。树 脂 型 TM PCR 产 物 纯 化 试 剂 盒 购 于 赛 百盛公司, T4 DNA 连接酶、T4 DNA 聚合酶为 BioLab 公司产 品 。Pst I 限 制 性 内 切 酶 购 于 TaKaRa 公 司 。2 ×Tag PCR MasterMix 购于北京天为时代生物技术公司。 1.2 方法 1.2.1 质粒 DNA 的提取、酶切、回收、连接、转化、琼脂糖凝 胶 电 泳 等 参 照 文 献 [3]进 行 。 1.2.2 制 备 T 载 体 。制 备 原 理 如 图 1 所 示 。纯 化 的 质 粒 pUC19, 用限制酶 Pst I 37 ℃酶切 1 h, 电泳检测酶切充分后, 乙醇沉淀除去酶切缓 冲 液 , 再 用 T4 DNA 聚合酶 37 ℃消化 15 min, 电泳回收后- 20 ℃保存备用。 1.2.3 用基 因 EF062504 的 Tag 酶 扩 增 产 物( 1 kb 左 右) 作 为检 测 T 载 体 的 连 接 片段 。连 接 转 化 大 肠 杆 菌 JM109, 计
简易快速高效制备 T 载体
徐 锋 , 武晓丽 1
2 ( 1.长江大学生命科学学院, 湖北荆州 434025; 2.中国农业科学院植物保护研究所, 北京 100094)
摘要 [目的]制备成本廉价、使用方便、效率高的 T 载体。[方法]用 Pst I 充分酶切纯化的质粒 pUC19, 再用 T4 DNA 聚合酶消化 15 min, 电泳得到 T 载体, 进行质量检测, 并与商品化的 T 载体 pMD18!T 进行对比。[结果]自制的 T 载体自连检测只发现 2 个菌落与 PCR 扩 增片段连接。经转化大肠杆菌 JM109, pMD18!T 的平均白斑率为 99.4 %, 转化菌落为 3.55 万个/μg, 自制 T 载体的平均白斑率为 99.7 %, 转化菌落为 3.38 万个/μg, 完全可以与商品出售的 T 载体媲美。[结论]该研究自制的 T 载体自连率低, 假阳性率低, 克隆效率高, 可替 代商品化的 T 载体用于 TA 连接, 而且制备时间短, 成本低廉, 技术简单, 值得推广。 关键词 T 载体; Pst I; PCR; 克隆载体 中图分类号 Q78 文献标识码 A 文章编号 0517- 6611( 2008) 02- 00460- 02
徐 锋等 简易快速高效制备 T 载体
461
ng/μl 后, - 20 ℃保存备用。
2.2 T 载体质量检测
2.2.1 自 连 检 测 。取 自 制 的 T 载 体 8.5 μl, 加 入 T4 DNA 连 接 酶 缓 冲 液 1 μl 和 T4 DNA 连 接 酶 0.5 μl, 16 ℃保 温 12~ 16 h, 取连接产物转化大肠杆菌 JM109, 涂布含 amp 的平
基金项目 作者简介
收稿日期
长江大学资助项目。 徐峰( 1978- ) , 男, 江西九 江人 , 讲师 , 从事 生物化 学和 分子 生物学研究。 2007! 09!05
数, 重复 3 次。 2 结果与分析 2.1 制 备 T 载 体 为 与 商 品 化 的 T 载 体 pMD18!T 进 行 对 比, 选用 pUC19 作为制备 T 载 体 的 原 料 , 经 Pst I 酶 切 和 T4 DNA 聚合酶消化后, 电泳结果 见图 2。
表 1 pMD18!T 和自制 T 载体的转化情况
Table 1 Tr ansfor mation of pMD18!T and self!made T!vector
个
菌落 Colony 蓝斑 Blue spot 白斑 White spot 合计 Total
pMD18"T 3
860 863
第 1 次 First time 自制 T 载体 Self"made T"vector
A Simple, Rapid and High Efficient Method for Pr epar ing T!vector XU Feng et al (College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025) Abstr act [Objective] The study aimed to prepare T!vector with low cost, convenience in use and high efficiency. [Method] T!vector was obtained through doing sufficient enzymolysis with Pst I on purified plasmid pUC19, then digesting with T4 DNA polymerase for 15 min and finally carrying out electrophoresis, which was conducted for quality detection and compared with commercialized T!vector pMD18!T. [Result] Only 2 colonies connected with PCR amplified fragments were found in self!connection detection of self!made T!vector. The average white spot rate of translated Escherichia coli JM109 and pMD18!T was 99.4 % with translated colonies being 3.55×104 /μg. The average white spot rate of self! made T!vector was 99.7 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ with translated colonies being 3.38×104 /μg, which could be compared with T!vector sold as commodity completely. [Conclusion] The self!made T!vector in the research had low self!connection rate, low false!positive rate and high clone efficiency, and could replace commercialized T!vector to use in TA connection with short preparation time, low cost and simple technology, was worthy of popularizing. Key wor ds T!vector; Pst I; PCR; Cloning vector
2 730 732
第 2 次 Second time
pMD18"T 自制 T 载体 Self"made T"vector
8
3
978
980
986
983
pMD18"T 5
810 815
第 3 次 Third time 自制 T 载体 Self"made T"vector
2 820 822
3 小结与讨论 在分子生物学试验中, 不论研究已知基因还是未知基
t进行对比选用puc19作为制备体的原料经psti酶切和dna聚合酶消化后电泳结果见图dna聚合酶消化后可根据需要进行不同处理如果要求严格可通过电泳回收去除杂蛋白和寡核苷酸
安徽农业科学, Journal of Anhui Agri. Sci. 2008, 36( 2) : 460- 461
责任编辑 金琼琼 责任校对 王 淼
因 , 往 往 需 要 将 扩 增 的 PCR 产 物 装 入 适 当 的 载 体 中 , 以 便 用于各种分析。
笔者 首 次 用 Pst I 酶 切 结 合 T4 DNA 聚 合酶 消 化 制 备 T 载体, 无论是阳性率还是转化效率, 都得到比较满意的结 果 , 完 全 可 媲 美 商 品 化 的 T 载 体 。Pst I 限 制 性 内 切 酶 在 TaKaRa 公司出售的 酶 中 是 除 EcoR I 限 制 性 内 切 酶外 最 便 宜 的 酶 。T4 DNA 聚 合 酶 价格 与 Pst I 限 制 性 内 切 酶 相 似 。采 用该方法, 可降低试验成本, 尤其是在经费不足或位置偏远 购买不方便的实验室里可自己制备 T 载体, 与 PCR 产物进 行 TA 连接。
除了降低成本外, 还可以方便基因与其他载体的连接。 一般对某基因进行分析表达时, 通常先要把 PCR 产物与克 隆载体连接, 确定后再与其他分析或表达载体连接。利用该 实 验 方 法 , 可 减 少 克 隆 载 体 这 一 步 , 直 接 把 PCR 产 物 与 分 析或表达载体连接。Pst I 的酶切位点在很多载体上都有, 除 常 见 的 克 隆 载 体 外 , 还 有 表 达 载 体 pQE 系 列 、酵 母 双 杂 交 检测用的 pGBKT7 和 pGADT7 等载体。目前制备 T 载体的 方法有不少, 有的采用 EcoR V 或 Klenow 片段酶切载体, 再 用 Tag 酶 加 上 T[4], 有 的 通 过 引 入 Xcm I、Eam1105 I 等 不 常 见的酶切位点, 再用相应的内切酶切出带 T 的粘性末端[5-6]。 这些方法有的操作步骤繁琐, 有的由于所需酶的品种增多, 且是较为稀少的酶, 增加了实验费用, 有的采用引物合成, 使 成 本 增 加 , 并 且 有 些 内 切 酶 对 位 于 DNA 片 段 末 端 的 作 用位点切割效率很 低 。相 比 这 些 方 法, 笔 者 采 用 的 方 法 , 不 仅 成 本 低 廉 , 而 且 可 适 用 多 种 载 体 包 括 克 隆 载 体 、表 达 载 体、分析载体等, 适用面更广。
板, 37 ℃倒置培养过夜, 观察生长的菌落, 结果见图 3。检测
发现只有 2 个菌落出现, 说明自连率低, 后期试验的假阳
性率也会低。
2.2.2 连接与转化效率检测。调整用于连接的 Tag 酶 PCR
片段浓度至 10 ng/μl, 分 别 与 自 制 T 载 体 和 pMD18"T 载体
连接, 转化培养后, 各重复 3 次, 并进行菌落计数, 结果见表1。
利用紫外分光光度计, 调 整 T 载 体 溶 液 浓 度 达 到 50
36 卷 2 期
分析表 1 数据可知, pMD18"T 的平均白斑率为 99.4 %,
1 μg 载体可得到 3.55 万个转化菌落, 而自制 T 载体的平均
白 斑 率 为 99.7 %, 1 μg 载 体 可 得 到 3.38 万 个 转 化 菌 落 。另
外, 随机各挑取 12 个白斑单菌落, 进行菌落 PCR, 琼脂糖电 泳的结果证明都有外源片断插入。
PCR 作为分子生物学的一项基本技术, 被广泛 用 于 体 外扩增 DNA 片段, 而 PCR 产物的克隆是对其进行鉴定、扩 增 以 及实 现 PCR 产 物 多 种 用 途 的 必经 之 路 。因 此 , 近 年 来 人 们围 绕 如 何 提 高 PCR 产 物 的 克 隆效 率 进 行 了 一 系 列 研 究[1-2]。不过现有的克隆载体虽然能够达到克隆的目的, 但是 也有 一 定 的 不 足 之 处 。例 如有 的 载 体 容 易 自 连 , 有 的 不 好 筛选阳性克隆, 有的费用较高, 且在一般情况下克隆效率 都不太高。笔者采用新方法制备了一种新的 T 载体, 该载体 具有成本低廉、使用方便、效率高等特点, 特别适合 经费 不 足或者购买不方便的偏僻地区使用。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌 株 和 载 体 。E.coli JM109、pUC19 由 长 江 大 学 生 命 科学学院实验室保存, pMD18!T Vector 购于 TaKaRa 公司。 1.1.2 主要 试 剂 。树 脂 型 TM PCR 产 物 纯 化 试 剂 盒 购 于 赛 百盛公司, T4 DNA 连接酶、T4 DNA 聚合酶为 BioLab 公司产 品 。Pst I 限 制 性 内 切 酶 购 于 TaKaRa 公 司 。2 ×Tag PCR MasterMix 购于北京天为时代生物技术公司。 1.2 方法 1.2.1 质粒 DNA 的提取、酶切、回收、连接、转化、琼脂糖凝 胶 电 泳 等 参 照 文 献 [3]进 行 。 1.2.2 制 备 T 载 体 。制 备 原 理 如 图 1 所 示 。纯 化 的 质 粒 pUC19, 用限制酶 Pst I 37 ℃酶切 1 h, 电泳检测酶切充分后, 乙醇沉淀除去酶切缓 冲 液 , 再 用 T4 DNA 聚合酶 37 ℃消化 15 min, 电泳回收后- 20 ℃保存备用。 1.2.3 用基 因 EF062504 的 Tag 酶 扩 增 产 物( 1 kb 左 右) 作 为检 测 T 载 体 的 连 接 片段 。连 接 转 化 大 肠 杆 菌 JM109, 计
简易快速高效制备 T 载体
徐 锋 , 武晓丽 1
2 ( 1.长江大学生命科学学院, 湖北荆州 434025; 2.中国农业科学院植物保护研究所, 北京 100094)
摘要 [目的]制备成本廉价、使用方便、效率高的 T 载体。[方法]用 Pst I 充分酶切纯化的质粒 pUC19, 再用 T4 DNA 聚合酶消化 15 min, 电泳得到 T 载体, 进行质量检测, 并与商品化的 T 载体 pMD18!T 进行对比。[结果]自制的 T 载体自连检测只发现 2 个菌落与 PCR 扩 增片段连接。经转化大肠杆菌 JM109, pMD18!T 的平均白斑率为 99.4 %, 转化菌落为 3.55 万个/μg, 自制 T 载体的平均白斑率为 99.7 %, 转化菌落为 3.38 万个/μg, 完全可以与商品出售的 T 载体媲美。[结论]该研究自制的 T 载体自连率低, 假阳性率低, 克隆效率高, 可替 代商品化的 T 载体用于 TA 连接, 而且制备时间短, 成本低廉, 技术简单, 值得推广。 关键词 T 载体; Pst I; PCR; 克隆载体 中图分类号 Q78 文献标识码 A 文章编号 0517- 6611( 2008) 02- 00460- 02
徐 锋等 简易快速高效制备 T 载体
461
ng/μl 后, - 20 ℃保存备用。
2.2 T 载体质量检测
2.2.1 自 连 检 测 。取 自 制 的 T 载 体 8.5 μl, 加 入 T4 DNA 连 接 酶 缓 冲 液 1 μl 和 T4 DNA 连 接 酶 0.5 μl, 16 ℃保 温 12~ 16 h, 取连接产物转化大肠杆菌 JM109, 涂布含 amp 的平
基金项目 作者简介
收稿日期
长江大学资助项目。 徐峰( 1978- ) , 男, 江西九 江人 , 讲师 , 从事 生物化 学和 分子 生物学研究。 2007! 09!05
数, 重复 3 次。 2 结果与分析 2.1 制 备 T 载 体 为 与 商 品 化 的 T 载 体 pMD18!T 进 行 对 比, 选用 pUC19 作为制备 T 载 体 的 原 料 , 经 Pst I 酶 切 和 T4 DNA 聚合酶消化后, 电泳结果 见图 2。
表 1 pMD18!T 和自制 T 载体的转化情况
Table 1 Tr ansfor mation of pMD18!T and self!made T!vector
个
菌落 Colony 蓝斑 Blue spot 白斑 White spot 合计 Total
pMD18"T 3
860 863
第 1 次 First time 自制 T 载体 Self"made T"vector
A Simple, Rapid and High Efficient Method for Pr epar ing T!vector XU Feng et al (College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou, Hubei 434025) Abstr act [Objective] The study aimed to prepare T!vector with low cost, convenience in use and high efficiency. [Method] T!vector was obtained through doing sufficient enzymolysis with Pst I on purified plasmid pUC19, then digesting with T4 DNA polymerase for 15 min and finally carrying out electrophoresis, which was conducted for quality detection and compared with commercialized T!vector pMD18!T. [Result] Only 2 colonies connected with PCR amplified fragments were found in self!connection detection of self!made T!vector. The average white spot rate of translated Escherichia coli JM109 and pMD18!T was 99.4 % with translated colonies being 3.55×104 /μg. The average white spot rate of self! made T!vector was 99.7 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ with translated colonies being 3.38×104 /μg, which could be compared with T!vector sold as commodity completely. [Conclusion] The self!made T!vector in the research had low self!connection rate, low false!positive rate and high clone efficiency, and could replace commercialized T!vector to use in TA connection with short preparation time, low cost and simple technology, was worthy of popularizing. Key wor ds T!vector; Pst I; PCR; Cloning vector
2 730 732
第 2 次 Second time
pMD18"T 自制 T 载体 Self"made T"vector
8
3
978
980
986
983
pMD18"T 5
810 815
第 3 次 Third time 自制 T 载体 Self"made T"vector
2 820 822
3 小结与讨论 在分子生物学试验中, 不论研究已知基因还是未知基
t进行对比选用puc19作为制备体的原料经psti酶切和dna聚合酶消化后电泳结果见图dna聚合酶消化后可根据需要进行不同处理如果要求严格可通过电泳回收去除杂蛋白和寡核苷酸
安徽农业科学, Journal of Anhui Agri. Sci. 2008, 36( 2) : 460- 461
责任编辑 金琼琼 责任校对 王 淼
因 , 往 往 需 要 将 扩 增 的 PCR 产 物 装 入 适 当 的 载 体 中 , 以 便 用于各种分析。
笔者 首 次 用 Pst I 酶 切 结 合 T4 DNA 聚 合酶 消 化 制 备 T 载体, 无论是阳性率还是转化效率, 都得到比较满意的结 果 , 完 全 可 媲 美 商 品 化 的 T 载 体 。Pst I 限 制 性 内 切 酶 在 TaKaRa 公司出售的 酶 中 是 除 EcoR I 限 制 性 内 切 酶外 最 便 宜 的 酶 。T4 DNA 聚 合 酶 价格 与 Pst I 限 制 性 内 切 酶 相 似 。采 用该方法, 可降低试验成本, 尤其是在经费不足或位置偏远 购买不方便的实验室里可自己制备 T 载体, 与 PCR 产物进 行 TA 连接。
除了降低成本外, 还可以方便基因与其他载体的连接。 一般对某基因进行分析表达时, 通常先要把 PCR 产物与克 隆载体连接, 确定后再与其他分析或表达载体连接。利用该 实 验 方 法 , 可 减 少 克 隆 载 体 这 一 步 , 直 接 把 PCR 产 物 与 分 析或表达载体连接。Pst I 的酶切位点在很多载体上都有, 除 常 见 的 克 隆 载 体 外 , 还 有 表 达 载 体 pQE 系 列 、酵 母 双 杂 交 检测用的 pGBKT7 和 pGADT7 等载体。目前制备 T 载体的 方法有不少, 有的采用 EcoR V 或 Klenow 片段酶切载体, 再 用 Tag 酶 加 上 T[4], 有 的 通 过 引 入 Xcm I、Eam1105 I 等 不 常 见的酶切位点, 再用相应的内切酶切出带 T 的粘性末端[5-6]。 这些方法有的操作步骤繁琐, 有的由于所需酶的品种增多, 且是较为稀少的酶, 增加了实验费用, 有的采用引物合成, 使 成 本 增 加 , 并 且 有 些 内 切 酶 对 位 于 DNA 片 段 末 端 的 作 用位点切割效率很 低 。相 比 这 些 方 法, 笔 者 采 用 的 方 法 , 不 仅 成 本 低 廉 , 而 且 可 适 用 多 种 载 体 包 括 克 隆 载 体 、表 达 载 体、分析载体等, 适用面更广。
板, 37 ℃倒置培养过夜, 观察生长的菌落, 结果见图 3。检测
发现只有 2 个菌落出现, 说明自连率低, 后期试验的假阳
性率也会低。
2.2.2 连接与转化效率检测。调整用于连接的 Tag 酶 PCR
片段浓度至 10 ng/μl, 分 别 与 自 制 T 载 体 和 pMD18"T 载体
连接, 转化培养后, 各重复 3 次, 并进行菌落计数, 结果见表1。