雷公藤甲素对大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响

雷公藤甲素对大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响
朱建华;胡永良;张武;关伟;黄光照
【摘要】目的从形态和功能两方面观察雷公藤甲素(Triptolide,TP)对大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPAA)的影响.方法将雄性SD大鼠随机分为3组,分别灌服2%丙二醇、丙二醇醋酸泼尼松混合溶液和丙二醇雷公藤甲素混合溶液7周,检测各组血浆皮质醇(cortisol,COR)、促肾上腺皮质激素(adrencocorticotropic hormone,ACTH)和促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)含量;行体质量、肾上腺器官系数测定及肾上腺皮质束状带组织病理学观察;免疫组织化学染色法观察ACTH在各组垂体中的表达.结果 (1)TP组与泼尼松组血浆COR含量低于对照组(P<0.05);血浆ACTH 与对照组比较无显著差异;TP组血浆CRH高于对照组(P<0.05).(2)TP组与泼尼松组大鼠实验后体质量均低于对照组,肾上腺器官系数与对照组比较无差异;光镜及电镜观察均表明TP组与泼尼松组肾上腺皮质束状带变薄、萎缩,肾上腺功能低
下;ACTH在TP组大鼠垂体中的表达高于对照组(P<0.05).结论形态和功能两方面均提示较长期服用TP可引起大鼠肾上腺皮质萎缩、功能低下,通过负反馈调节,进而使下丘脑和垂体合成、分泌CRH和ACTH增加.
【期刊名称】《法医学杂志》
【年(卷),期】2010(026)004
【总页数】6页(P260-265)
【关键词】法医毒理学;雷公藤内酯;下丘脑-垂体系统;免疫组织化学;大鼠
【作者】朱建华;胡永良;张武;关伟;黄光照
【作者单位】皖南医学院,医学三系,安徽,芜湖,241002;皖南医学院,医学三系,安徽,
芜湖,241002;皖南医学院,医学三系,安徽,芜湖,241002;长沙市星城地区检察院,湖南,长沙,410000;华中科技大学,同济医学院,湖北,武汉,430030
【正文语种】中文
【中图分类】DF795.1
雷公藤又名黄藤、黄藤木、黄腊藤、断肠草等，属卫矛科雷公藤属植物，全株有毒，在我国法医学典籍《洗冤集录》中列举的鼠莽草，据考证即为雷公藤。

雷公藤有清热解毒，祛风除湿、消肿止痛、通经活络、杀虫止血等功效。

现代药理及临床研究证实，雷公藤具有抗炎、抗肿瘤、免疫抑制及抗生育等作用。

但由于其治疗量与中毒量比较接近，疗效大小又与剂量相关，所以，屡见使用雷公藤制剂过量或时间过长而发生中毒的病例报道，亦有服用过量而中毒死亡者[1-3]。

雷公藤甲素（雷公藤内酯醇，Triptolide，TP）系由雷公藤根中提取分离的有效单体，是一种有三个环氧基团以及一个α，β-不饱和五元内酯环结构的构型独特的松香烷型二萜化合物[4]，其化学结构式与糖皮质激素相似。

TP抗炎、免疫抑制作用及部分毒副作用的产生均由其特定的化学结构式所决定[5-6]，其作用机制之一，
与其对下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamicpituitary-adrenal axis，HPAA）
的影响有关，以往的研究主要集中在对肾上腺的质量、大小和VitC含量检测，以
及光镜下HE染色的组织结构变化观察[7-8]。

本研究采用放射免疫分析方法检测
大鼠血浆皮质醇（cortisol，COR）、促肾上腺皮质激素（adrencocorticotropic hormone，ACTH）含量，ELISA法测定血浆促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）含量，免疫组化法检测大鼠垂体中ACTH表达水平，结合光镜观察肾上腺皮质束状带组织结构及电镜观察其超微结构改变，多层面、多角度地从形态和功能两方面综合评价TP对大鼠HPAA的影响。

1.1 主要试剂
TP，纯度99.3%（北京美迪克斯生物技术有限公司）；醋酸泼尼松（山东新华制
药股份有限公司）；COR放射免疫分析药盒、ACTH放射免疫分析药盒（北京北
方生物技术研究所）；CRH ELISA检测试剂盒（上海朗顿生物科技有限公司）；
兔抗人ACTH抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德公司）。

1.2 主要仪器
JEM-1230型透射电镜（日本电子株式会社），GC-911型自动γ免疫计数器
（科大创新股份有限公司中佳分公司），KDC-2042低速冷冻离心机（科大创新
股份有限公司中佳分公司），CMIAS病理图像分析系统4.10（北京麦克奥迪图像技术有限公司）。

1.3 动物分组及给药
1.3.1 动物分组
清洁级雄性SD大鼠30只，体质量160～180 g，由浙江省实验动物中心提供，
许可证号：SCXK（浙）2003-0001。

将30只大鼠随机分为空白对照组、泼尼松
组和TP组，每组10只。

1.3.2 药物配制和给药方法
将TP和泼尼松分别用2%丙二醇配成混合溶液，4℃保存。

大鼠适应性喂养1周
后连续给药，每组给药浓度不同，均灌服等体积溶液（2mL/kg），每日两次。

给药量：空白对照组为2%丙二醇2mL/kg，泼尼松组为2mg/kg，TP组为
20μg/kg。

实验期间，动物自由饮水进食。

每3d称体质量一次，以调整用药剂量。

室温25℃，自然光线。

连续灌胃7周后断头处死大鼠。

1.4 实验方法
1.4.1 放射免疫法测定COR和ACTH含量
大鼠断头取血（1min内完成），分别注入含肝素抗凝剂的试管和含10%EDTA二
钠30μL的试管中，混匀，4℃，以离心半径113mm，3500r/min，离心15min，分离血浆。

按试剂盒说明书操作步骤进行测定。

1.4.2 ELISA法测定CRH含量
大鼠快速断头取血（1 min内完成），分别注入含肝素抗凝剂的试管中，按试剂盒说明书操作步骤进行测定。

1.4.3 肾上腺器官系数测定
实验大鼠适应性喂养1周后，称实验前体质量；连续灌胃7周后处死大鼠前，称
实验后体质量；取出肾上腺后用电子分析天平称双侧肾上腺质量。

按下列公式计算器官系数：器官系数=器官质量（g）/实验后体质量（kg）。

1.4.4 肾上腺HE染色
将左侧肾上腺以无冰醋酸的Bouin氏固定液固定24h。

取出固定液中肾上腺标本，常规脱水、石蜡包埋、制片，光学显微镜观察。

1.4.5 肾上腺皮质束状带透射电镜检测
将右侧肾上腺在束状带位置取1 mm×1 mm× 1 mm大小组织固定于2.5%戊二
醛磷酸钠缓冲液中，4℃冰箱保存4h，常规脱水、浸透，包埋聚合，切片，透射
电镜观察。

1.4.6 免疫组织化学SP法测定腺垂体中ACTH
取出大鼠脑垂体，放入无冰醋酸的Bouin氏固定液中固定24h。

取出固定液中脑
垂体标本，常规脱水、石蜡包埋。

脑组织做冠状面连续切片，厚度约5μm，经黏
片剂处理过的载玻片捞片，置于60℃烤箱烘烤1 h。

相邻切片行HE及免疫组化染色。

切片常规脱蜡至水，30%H2O21份+蒸馏水10份混合，室温10min以灭活内源性酶，滴加复合消化液10 min，加5% BSA封闭液，室温20 min，滴加
Fas抗体4℃过夜，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，20～37℃ 20 min，滴加SABC室温20min，各步间用PBS漂洗，DAB显色，镜下监测，满意后PBS液
终止反应。

苏木素轻度复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

各组设阴性对照，用PBS代替一抗，其余操作同上。

采用CMIAS病理图像分析系统测定ACTH在各组大鼠垂体中表达的灰度值及平均光密度（D）。

1.5 统计学分析
实验数据均采用SPSS 11.5统计软件进行统计学处理，以上资料均为计量资料，以±s表示，全部数据经方差齐性分析后，采用单因素方差分析进行显著性检验，另采用LDS法比较各组之间差异，检验水准α＝0.05。

2.1 大鼠血浆COR和ACTH测定结果
TP组与泼尼松组大鼠血浆COR含量均低于空白对照组，根据单因素方差分析，差异有统计学意义（F＝4.345，P＜0.01）。

经LSD法统计分析，空白对照组大鼠血浆COR含量与各组差异均有统计学意义。

TP组大鼠血浆ACTH均数高于空白对照组；泼尼松组大鼠血浆ACTH均数低于空白对照组，但经单因素方差分析各组大鼠血浆ACTH，差异无统计学意义（F＝0.805，P＞0.05）。

结果见表1。

2.2 大鼠血浆CRH测定结果
TP组与泼尼松组大鼠血浆CRH含量，根据单因素方差分析，各组之间差异有统计学意义（F＝3.453，P＜0.05）。

经LSD法统计分析TP组大鼠血浆CRH含量高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

泼尼松组大鼠血浆CRH含量低于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

结果见表2。

2.3 大鼠肾上腺器官系数
各组大鼠实验前体质量差异无统计学意义（P＞0.05），实验后，TP组、泼尼松组大鼠体质量与空白对照组大鼠体质量相比均明显下降，各组之间差异有统计学意义（F＝5.843，P＜0.01）。

各组大鼠肾上腺质量经单因素方差分析，差异无统计学意义（F＝2.590，P＞0.05），另经LSD法分析，空白对照组肾上腺质量与泼尼松组相比差异有统计学意义（P＜0.05），与TP组相比较差异无统计学意义。

各组大鼠肾上腺器官系数之间差异无统计学意义（F＝1.128，P＞0.05）。

结果见表3。

2.4 大鼠肾上腺HE染色光镜观察结果
肾上腺皮质球状带：两实验组与空白对照组相近，球状带较薄，细胞小，染色深，排列成团。

肾上腺皮质束状带：对照组束状带细胞排列成束，染色淡，胞质内有溶解的脂肪小泡（图1）；泼尼松组肾上腺皮质较对照组变薄，束状带面积变窄，脂质空泡减少（图2）；TP组肾上腺皮质稍变薄，结构不清，束状带萎缩、面积变窄，脂质空泡减少（图3）。

肾上腺皮质网状带：细胞索排列成网，细胞质略嗜酸性，各组之间无明显差异。

2.5 透射电子显微镜观察各组大鼠肾上腺皮质束状带超微结构
空白对照组大鼠肾上腺皮质束状带细胞胞浆线粒体丰富，线粒体嵴突完整，可见高尔基体，粗面、光面内质网较多，核糖体较多；泼尼松组大鼠肾上腺皮质束状带细胞内水肿，线粒体密度下降，脂滴密度下降（图4）；TP组大鼠肾上腺皮质束状带细胞内轻度水肿，脂滴密度下降（图5）。

2.6 ACTH在各组大鼠腺垂体中的表达结果
根据ACTH在各组大鼠垂体中免疫组织化学表达的灰度值分析：TP组大鼠垂体中ACTH表达水平高于空白对照组，差异有统计学意义（Plt;0.05）；泼尼松组大鼠垂体中ACTH表达水平却低于空白对照组，差异有统计学意义（F＝5.378，Plt;0.05）。

TP组大鼠垂体中ACTH平均光密度（D）值高于空白对照组，差异有统计学意义（Plt;0.05），泼尼松组大鼠垂体中ACTH平均D值低于空白对照组，差异有统计学意义（F＝7.050，Plt;0.05）。

结果见表4。

ACTH细胞的免疫组织化学观察：免疫组织化学染色后，腺垂体ACTH阳性细胞胞质呈棕褐色阳性反应细胞，ACTH细胞多为不规则形或星形，有胞质突起，少数细胞为圆形，ACTH细胞呈弥散分布于腺垂体远侧部。

空白对照组有ACTH细胞
表达；泼尼松组大鼠ACTH细胞免疫反应降低，着色浅淡，多位于胞膜，胞浆内很少（图6）；TP组大鼠腺垂体ACTH细胞免疫反应较空白对照组增强，ACTH 细胞明显加深，胞膜和胞浆中均见丰富的ACTH着色颗粒（图7）。

光镜观察各组大鼠腺垂体未见明显形态学改变。

目前已从雷公藤属植物中分离得100多种成分[9]，属生物碱类成分16种、二萜类成分14种、三萜类成分17种、倍半萜类12种，还有有机酸、卫矛醇、卫矛碱、多糖等成分[10-11]。

雷公藤醋酸乙酯提取物（TWEE）是一种复合物，除含TP外，还含有生物碱、苷类、其他萜类等成分。

既往研究表明TWEE可能通过兴奋HPAA而促进肾上腺皮质功能，发挥其类皮质激素作用的抗炎效果[12-14]。

研究表明TWEE对大鼠HPAA在形态和功能两方面均具有促进作用[15-18]。

由于TWEE成分复杂，在机体内可产生复合（综合）效应，其虽对HPAA有影响，但却不能完全等同于TP对HPAA的影响。

TP在TWEE中虽是微量成分，但却是发挥疗效（抗炎、免疫抑制作用）和产生毒副作用的主要活性成分[19-20]。

在药理作用方面，李乐真等[7]报道TP能减轻巴豆油合剂诱发的小鼠耳部水肿，对红细胞膜有稳定作用，但不影响大鼠肾上腺内抗坏血酸的含量，其抗炎作用不是通过兴奋垂体-肾上腺皮质系统。

相反，郑幼兰等[8]报道TP对渗出性和增殖性炎症均有明显抑制作用。

对摘除双侧肾上腺大鼠TP可使角叉菜足跖肿胀的作用消失，并能使大鼠肾上腺内抗坏血酸含量明显降低，且会被地塞米松所阻断，表明其抗炎作用与兴奋垂体-肾上腺皮质系统有关。

因此，多层面、多角度地从形态和功能两方面观察TP对大鼠HPAA的影响，阐明其药理作用（抗炎、免疫抑制）机制之一，无疑具有极为重要的理论和实际意义。

在毒理作用方面，由于TP是雷公藤的主要毒性成分，多层面、多角度地从形态和功能两方面观察TP对大鼠HPAA的影响，阐明其毒理作用机制，亦具有重要的理论和实际意义。

3.1 TP对大鼠HPAA功能的影响
根据本实验结果分析，与空白对照组比较：TP组与泼尼松组大鼠血浆COR含量
均降低（P＜0.01），前组血浆CRH含量增高（P＜0.05），后组血浆CRH含量
降低（P＜0.05），表明较长期使用TP对大鼠肾上腺皮质功能具有抑制作用，导
致肾上腺皮质合成、分泌COR减少，血浆COR含量降低，可能通过负反馈调节（负反馈抑制作用减弱），进而使下丘脑和垂体合成、分泌CRH和ACTH增加。

而较长期使用泼尼松却对大鼠整个HPAA呈抑制作用。

3.2 TP对大鼠HPAA形态的影响
本实验中各组大鼠实验前体质量差异无统计学意义，实验后TP组与泼尼松组大鼠体质量明显低于空白对照组（P＜0.05），表明较长期使用TP大鼠生长发育较差，体质量增长缓慢。

实验后TP组与泼尼松组大鼠体质量、肾上腺质量均较空白对照组相应降低，故器官系数各组间比较差异无统计学意义。

与空白对照组比较：光镜下TP组见肾上腺皮质稍变薄，结构不清，束状带萎缩，面积变窄，脂质空泡减少；泼尼松组见肾上腺皮质变薄、束状带面积变窄、脂质空泡减少。

电镜观察TP组束状带细胞内轻度水肿，脂滴密度下降；泼尼松组束状带细胞内水肿，线粒体密度下降，脂滴密度下降。

两组比较均有束状带细胞内水肿，脂滴密度下降，而泼尼松组尚有线粒体密度下降。

上述通过光镜和电镜超微结构水平观察，从形态学方面亦印证较长期使用TP、泼尼松均可导致大鼠肾上腺皮质萎缩，肾上腺皮质功能低下。

根据ACTH在各组大鼠垂体中免疫组织化学表达的灰度值和D值分析：TP组大鼠垂体中ACTH表达水平高于空白对照组（P＜0.05）；泼尼松组大鼠垂体中ACTH 表达水平低于空白对照组（P＜0.05），提示较长期使用TP与泼尼松，前者使大
鼠腺垂体合成、分泌ACTH增加，而后者对大鼠腺垂体呈抑制作用。

3.3 综合评价TP对大鼠HPAA的影响
虽然本实验大鼠血浆ACTH含量：TP组高于空白对照组，泼尼松组低于空白对照组，而结果无统计学意义（P＞0.05）；但免疫组化实验大鼠腺垂体中ACTH表达
水平：TP组高于空白对照组（P＜0.05），泼尼松组低于空白对照组（P＜0.05）。

从形态和功能两方面进行综合评价，表明较长期服用TP与泼尼松，前者使大鼠腺垂体合成、分泌ACTH增加，而后者则对大鼠腺垂体呈抑制作用。

综上所述，本
实验从形态和功能两方面证实较长期使用TP可使大鼠肾上腺皮质萎缩、肾上腺皮质功能低下，通过负反馈调节，进而使下丘脑和垂体合成、分泌CRH和ACTH增加。

陈龙等[15-18]通过动物实验从形态和功能两方面证实TWEE对大鼠HPAA具有促进作用，与本实验结果不同，可能与前者实验用药为TWEE（复合物产生综合效应），而本实验用药为TP（单体产生单一效应）有关。

由此提示TWEE为复合物（各成分之间相互协同或拮抗），除含对肾上腺皮质有抑制作用的TP组分外，可能还含对HPAA有促进（兴奋）作用组分，且其效应大于TP的效应，可使TWEE的综合效应表现为对HPAA的促进作用，然而对此推测亟待研究证实。

本
实验结果与李乐真等[7-8]有关TP对垂体-肾上腺皮质系统影响的研究结果不同，
可能与TP的给药剂量、给药时间长短、动物模型及观察指标等不同所致。

鉴于
TP对大鼠HPAA影响的关键是对肾上腺的抑制作用，对其作用机制亟待进一步研究。

TP是目前市售雷公藤片的主要活性成分，又是其主要毒性成分，本研究可为其临
床安全、合理用药提供实验依据。

本实验从形态和功能两方面证实较长期使用TP可使大鼠肾上腺皮质萎缩、肾上腺皮质功能低下，可为TP中毒的法医学鉴定提供科学依据。

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