盐酸小檗碱自组装小珠载药系统的制备与体外评价

盐酸小檗碱自组装小珠载药系统的制备与体外评价该文主要研究一种使用α-环糊精和大豆油在室温下连续振荡即可制得的自
组装小珠给药系统，在制备过程中不需要使用任何表面活性剂或有机溶剂。

以盐酸小檗碱为模型药物，对制备的小珠进行形态、结构、载药量、体外释药行为考察。

药物的负载方法为制备之前溶解于大豆油中，小珠粒径为（2.25±0.23）mm，载药量为（67.02±0.64）μg·g-1。

荧光标记后激光共聚焦显微镜观察显示，小珠为核壳结构，水难溶性药物主要分布在大豆油内核中。

小珠在模拟肠液中的释药速率和累积释药量均显著高于原料药。

这表明小珠是一种适用于水难溶性中药的有发展潜力的脂质新剂型。

标签：小珠；α-环糊精；大豆油；盐酸小檗碱；自组装给药系统；脂质制剂
脂质制剂可以提高水难溶性药物的口服生物利用度[1-2]，如脂质纳米粒[3-4]、微乳[5-6]和自乳化给药系统[7-8]等。

这些脂质制剂在制备过程中常需使用表面活性剂或有机溶剂，可能产生过敏、黏膜刺激、溶血甚至致癌等毒副作用[9-10]；而且许多脂质制剂的制备方法复杂，对制备条件（如温度，pH，压力等）要求较高，可能影响药物稳定性[3-8]。

小珠（beads）作为一种基于环糊精与油相互作用的新型自组装脂质给药系统，仅使用环糊精、油、水3种材料在室温下连续振荡，即可获得的毫米尺寸囊腔结构的球状颗粒[11]。

在制备过程中不需使用任何表面活性剂或者有机溶剂，其脂质内核能够负载水难溶性药物或脂溶性药物，可提高口服生物利用度，具有很好的发展应用前景[12]。

中药活性成分盐酸小檗碱（berberine hydrochloride，BH）具有降血脂、降血糖、抗肿瘤等作用，由于其水难溶性、口服生物利用度低在实际使用中受到限制[13]，本研究以BH为模型药物，采用α-环糊精（α-cyclodextrin，α-CD）与大豆油室温振摇法制备BH-beads，并研究评价其体外性质和释药性能，以期为进一步深入进行药动学研究提供基础。

1 材料
HYG-A全温摇瓶柜（江苏太仓市实验设备厂）；Agilent 1200高效液相色谱（美国安捷伦科技有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；Coolsafe 100-9 Pro真空冷冻干燥仪（丹麦Labogene公司）；Leica Tcs spz AoBs 激光共聚焦显微镜（德国徕卡有限公司）；Hitachi S-3000N扫描电子显微镜（日本日立公司）；尼康SMZ-1000体视显微镜（日本尼康仪器有限公司）；Image-Pro Plus 6.0软件（media cybernetics公司）。

α-CD（批號60P306，德国瓦克化学有限公司，药用级）；大豆油（批号y12080204-3-01，铁岭北亚药用油有限公司，注射级，皂化值191，碘值129）；
BH（批号H20044706，四川省玉鑫药业有限公司）；其他所有试剂均为分析纯。

2 方法
2.1 beads的制备条件优化
根据文献[12]和预试验结果，将大豆油16 mL加入至11.25%的α-CD溶液40 mL中，密封后将其放置于恒温振荡摇床，分别在不同转速（150，175，200 r·min-1）和不同温度（24，28，32 ℃）下持续振摇5 d，观察最终结果以确定较优的制备条件。

2.2 空白beads的制备
将大豆油16 mL加入至11.25%的α-CD溶液40 mL中，密封后将其放置于恒温振荡摇床，按研究确定的较优制备条件（温度和转速）持续振摇，直至出现大量beads。

使用纯水对beads进行多次洗涤，冷冻干燥即可获得成品。

2.3 beads的荧光标记取少量钙黄绿素和尼罗红分别溶解于α-CD溶液和大豆油中，后续制备方法与空白beads一致。

2.4 BH的含量测定方法[14]
Ultimate ODS色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Easy Guard预柱（4.6 mm×10 mm）；柱温25 ℃；流动相0.03 mol·L-1磷酸二氢钾溶液-乙腈（60∶40）；流速
1.0 mL·min-1；检测波长347 nm；进样量20 μL。

2.5 BH在大豆油中的溶解度测定
将过量的BH加入大豆油中，涡旋5 min，置于37 ℃条件下持续振摇72 h，以12 000 r·min-1离心5 min，分离得到上清液，即为BH-大豆油饱和溶液。

移取BH-大豆油饱和溶液300 μL，加入氯仿-甲醇（2∶1）溶液3 mL，涡旋混匀后以5 000 r·min-1离心5 min，取上清液，测定BH的含量，计算其在大豆油中的溶解度。

2.6 BH-beads的制备
将BH-大豆油饱和溶液16 mL加入到11.25%的α-CD溶液40 mL中，后续制备方法与空白beads一致。

2.7 显微镜观察
2.7.1 光学显微镜观察取少量BH-beads置于体视显微镜（MPO）下观察。

随机选取15粒BH-beads，在低倍视野下拍照，使用Image-Pro Plus 6.0软件对其粒径进行测量和统计。

2.7.2 扫描电子显微镜观察（SEM）将冷冻干燥后的BH-beads表面喷金处理，再用扫描电子显微镜观察其表面特征。

2.7.3 激光共聚焦显微镜观察将荧光标记的beads从中间剖开后置于激光共聚焦显微镜下观察其荧光分布与强度。

同一视野下，分别以488 nm激发波长观察钙黄绿素的分布，获得绿色共聚焦图像；以543 nm激发波长观察尼罗红的分布，获得红色共聚焦图像。

2.8 BH-beads载药量的测定
称取冷冻干燥后的BH-beads 50 mg，碾压破碎，加入氯仿-甲醇（2∶1）溶液3 mL持续振摇，使BH溶解完全，5 000 r·min-1离心5 min，吸取上清液，测定BH的含量，按下式计算载药量（DL）。

DL（μg·g-1）=WBH/Wbeads。

WBH 和Wbeads分别表示beads中BH的含量和beads的质量。

2.9 BH-beads的体外释药行为测定
模拟肠液的配制[15]：取磷酸二氢钠1.03 g、氯化钠1.24 g、牛黄胆酸钠0.32 g、卵磷脂0.12 g，加水稀释至100 mL，调节pH至6.8，即得。

分别称取一定量的BH-beads和BH加入至透析袋（33 mm×60 mm，截留相对分子质量1万）中，再放入装有模拟肠液30 mL的EP管中，在37 ℃，75 r·min-1条件下持续振摇，分别在1，3，5，10，15，30 min，1，2，4，6 h取样1 mL （同时补充同温等量的模拟肠液），以5 000 r·min-1离心5 min，取上清液，测定BH的含量，计算释药率[16]。

3 结果与讨论
3.1 BH-beads的制备
α-CD溶液与大豆油混合振摇，在不同制备条件下出现了油-水明显分层（two nonmiscible liquids）、白色乳状液体（fluid milky mixture）、白色黏性固体（viscous milky mixture）以及小珠（beads）等4种结果，见表1。

beads的自组装原理见图1，CD能与油中的甘油三酯（triglyceride，TG）部分结构包合形成两性超分子（amphiphilic supramolecular，ASM），该超分子由于存在部分裸露的油分子链而具有亲水亲油特性，可在油水界面形成膜状结构，具有表面活性作用，而且其表面活性随着油脂链长增加而增强[11]。

一定条件下ASM能够聚集于油滴表面，对油滴形成包裹，自动组装形成beads[12，17]。

在beads实际制备过程中，要求产生的ASM应具有数量多、状态稳定、表面活性较高等特点，故应选用的CD水溶性较高，且内部的空穴大小与长链的TG能形成紧密结合[12]。

目前，通过大量试验得知选用α-CD与大豆油搭配制得的beads性质优良，是理想的制备原料。

由于CD的乳化能力与温度有关，在一定范围内温度越高，乳化能力越弱[18]。

CD乳化能力过高，可能导致油滴粒径过小，不能形成beads；CD乳化能力过低则不能将α-CD溶液與大豆油充分乳化。

振荡的目的是使油滴在水相中充分分散，振荡速率慢可能导致α-CD溶液与大豆油不能混合均匀，而振荡速率过快则可能影响ASM在油滴表面的吸附[11-12]。

根据优化试验结果，采用28 ℃，175 r·min-1的制备条件较为适宜。

负载BH的beads的制备过程见图2，图中显示振摇前大豆油和α-CD溶液存在明显的分界面，振摇24 h后两者完全混合形成白色乳液，白色乳液中正在形成的beads（黑色小球），其周围存在大量的ASM晶体（絮状物）正在吸附到beads表面。

由此可见，beads的制备过程中首先需要α-CD溶液和大豆油充分混合，产生大量的ASM，然后ASM对油滴进行自组装包裹。

BH-beads的粒径与空白beads相比没有明显变化。

但是BH-beads的制备时间（4 d）比空白beads（2.5 d）长，这可能是由于BH影响了CD与TG的结合，延长了ASM的形成时间，另外BH也可能对ASM在油滴表面的包裹和分布造成影响[17]。

3.2 BH-beads的形态
光学显微镜观察结果见图3，BH-beads为一种白色球体，粒径为（2.25±0.23）mm。

这与文献[12]相比，粒径略微偏大，原因可能与制备中使用的大豆油纯度有关，一般要求甘油三酯含量达到99%以上[19]。

最近有文献报道，使用小麦胚芽油和甜杏仁油与α-CD 合用已经成功制得beads，这将扩大beads的应用范围[20]。

扫描电子显微镜观察发现，冷冻干燥后的BH-beads基本为球形，表面凹凸，有突起物。

3.3 BH-beads的结构
激光共聚焦显微镜观察荧光标记的beads发现，在同一视野下脂溶性的尼罗红主要集中于beads内部的A区域；而由于该beads为新鲜制备，其内部还存在一定量的水，所以导致水溶性的钙黄绿素不仅分布于外部的B区域，还分布于内部的A区域，见图4。

由此推论，A区域为beads的脂质内核，而B区域为beads的外部膜壳，而且脂质内核相对较大。

这与文献[12，21]报道一致，beads 为一种核壳结构的球体，水难溶性或脂溶性药物主要分布在内部脂质中，而且由于内部脂质结构比例较大，有利于负载更多的水难溶性药物或脂溶性药物。

3.4 BH-beads的载药量
由于水难溶性或脂溶性药物主要分布在beads的脂质内核中，所以beads的载药量主要与药物在大豆油中的溶解度有关。

本研究测定BH在大豆油中的溶解度为131.4 mg·L-1，BH-beads的载药量为（67.02±0.64）μg·g-1。

文献报道beads 在负载溶解度较低（86 mg·L-1）的阿达帕林时，载药量较低[21]；但在负载溶解度为4.0 g·L-1的异维甲酸时，载药量能达到（3.4±0.2）mg·g-1[22]。

因此提高
beads载药量需要提高药物在大豆油中的溶解量。

大豆油对许多药物的溶解能力有限，因此考虑使用对药物具有较强溶解能力的中链TG替换大豆油，但是中链TG与CD形成的ASM乳化能力偏低，可能影响beads的自组装[24]。

目前有研究将药物分散于大豆油中形成混悬液，再制备beads，如将阿达帕林混悬于大豆油中后，beads载药量可明显提高[22]。

3.5 BH-beads的体外释药行为
研究发现，beads在模拟胃液中主要是其表面的少量α-CD溶解脱落而其结构和外形并没有受到破坏，药物的释放量较少；当进入模拟肠液时，由于受到牛磺胆酸钠和卵磷脂的作用，beads开始破裂并释放出内部的油滴，最终完全破裂成碎片，药物从油滴中释放出来，因此beads的主要释药部位在肠道[15，21]。

本研究体外模拟肠液的释药结果见图5，BH-beads的释药速率明显快于BH 原料药，BH-beads在5，10，15，30 min时分别释放13.96%，23.20%，33.86%，56.84%的药物，而在相同时间点BH原料药仅仅释药4.74%，9.58%，13.2%，24.57%。

60 min时，BH-beads在模拟肠液中的累积释药率达到69.72%，是BH 原料药（32.73%）的2倍多。

该结果说明beads能提高BH在肠内的释放速率和程度。

由于药物溶解在beads内部的油中，而油被充分分散，粒径小，比表面积大，可能有利于药物吸收[8]。

同时CD能与生物膜中的胆固醇和卵磷脂作用产生部分或完全的包合而破坏生物膜结构，提高生物膜的通透性，有可能增加药物吸收[25]。

因此beads从结构和辅料组成2方面均可能提高药物的生物利用度，下一步将进行药动学试验对beads在提高难溶性药物口服生物利用度方面的性能进行验证。

4 结论
本研究结果表明，beads制备过程简单，不使用表面活性剂和有机溶剂，在模擬肠液中释药速率快、累积释药量高，有利于药物吸收，有可能提高药物的口服生物利用度，为水难溶性中药和脂溶性中药的口服给药提供了新的解决方案。

beads的载药量受到药物在大豆油中溶解度的限制，需要在处方筛选和制备工艺等方面进一步研究，同时有关beads提高药物口服生物利用度的机制也需要进一步研究。

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Preparation and in vitro evaluation of self-assembled beads
drug delivery system of berberine hydrochloride
LIU Chuan1，XU Yan1，OUYANG Hui1，YI Tao2*
（1. College of Pharmaceutical Sciences，Southwest University，Chongqing 400715，China；
2. State Key Laboratong of Quality Research in Chinese Medicine，Macau Institute for Applied Research in Medicine and Health，
Macau University of Science and Technology，Macau 000853，China）
[Abstract] The purpose of the present work was to investigate the innovative
self-assembling system，“beads”，prepared by continuously s haking α-cyclodextrin and soybean oil without the use of organic solvents and surfactants at room temperature. Berberine hydrochloride previously dissolved in soybean oil was chosen as a model drug to explore the shape，structure，drug loading and in vitro release of beads. The particle size and drug loading of berberine hydrochloride-loaded beads were （2.25±0.23）mm and （67.02±0.64）μg·g-1，respectively. Confocal microscopy showed that the core-shell structure of beads could contain poorly water soluble drugs or lipophilic drugs in the lipid core. The drug release rate and cumulative releases of beads were both higher than those of raw medicine of berberine hydrochloride in simulated intestinal fluid. These results suggested that beads were the novel and potential lipid-based drug delivery system for lipophilic or poorly water soluble traditional Chinese medicine.
[Key words] beads；α-cyclodextrin；soybean oil；berberine hydrochloride；self-assembled drug delivery system；lipid-based formulations
doi：10.4268/cjcmm20131216。