棉铃虫6龄幼虫中肠与脂肪体微粒体P450酶系的比较(有用)

动物学报　48(2):208～212,2002A cta Zoologica S i nica
棉铃虫6龄幼虫中肠与脂肪体
微粒体P450酶系的比较
3
邱星辉　李　薇　冷欣夫
(中国科学院动物研究所农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室,北京100080)
摘　要　报道了棉铃虫6龄幼虫中肠和脂肪体微粒体P450酶系的组成与加单氧酶活性。

与脂肪体微粒体相比,中肠微粒体具有更高的细胞色素P450、细胞色素b5和NADPH -细胞色素P450还原酶含量,表现出较高的艾氏剂环氧化酶和对-硝基苯甲醚O -脱甲基酶活性。

SDS 2PA GE 电泳显示,中肠与脂肪体微粒体介于P450分子量范围内(45～60kDa )的蛋白图谱有所不同,反映出中肠和脂肪体微粒体蛋白组成存在差异。

通过对-硝基苯甲醚O -脱甲基酶的动力学分析发现脂肪体微粒体的对-硝基苯甲醚O -脱甲基酶对底物有更强的亲和性,表明不同组织来源的P450同功酶存在质的不同。

关键词　棉铃虫　中肠　脂肪体　细胞色素P450　加单氧酶
　2000212218收稿,2001201217修回
　3　国家自然科学基金资助项目(No.39670491)
　第一作者简介　邱星辉,36岁,博士,副研究员。

研究方向:昆虫分子毒理学。

E 2mail :qiuxh @
细胞色素P450加单氧酶系(以下简称P450
酶系)是广泛存在于生物体的一类代谢酶系,因其生物学重要性,一直是生物学研究的一个重要对象(Wong ,1998)。

它的作用包括对内源性物质(激素、脂肪酸等)的代谢,以及对外源性的植物次生物质、农药、药物以及环境污染物等天然和人工合成物质的代谢(Wong ,1998)。

昆虫细胞色素P450酶系不仅参与保幼激素、蜕皮激素及其类似
物的代谢,而且还在昆虫对杀虫剂以及植物毒素的
解毒中发挥重要作用(Feyereisen ,1999)。

棉铃虫是重要的经济害虫,它的大发生已造成巨大的经济损失。

棉铃虫防治失败的一个主要原因是其产生了抗药性(Dong et al .,1999)。

近年来的研究结果表明,P450酶系活性的增强是昆虫抗药性的主要机制(Dong et al .,1999)。

但迄今为止,有关棉铃虫P450酶系的研究十分有限,大多数报道只是比较抗性与感性昆虫酶系活性的差异,以此间接证明P450酶系在昆虫抗药性中的作用,而对昆虫P450的基本生化特征缺乏更细致深入的了解。

一般认为,中肠和脂肪体构成昆虫的两大防御部位,经口物质由中肠解毒,而经皮物质由脂肪体解毒。

我们在分析棉铃虫P450酶系活性的组织分布时发现,无论是总活性还是比活性,中肠和脂肪
体均占绝对优势(Qiu et al .,2000)。

本文就中肠和脂肪体微粒体P450酶系的特征做一更全面深入地探讨。

1　材料与方法
111　化学试剂
NADPH ,NADH (>98%),D TT (1,4-二
硫代苏糖醇,>97%)为B.M.产品;Tris 、BSA 、ED TA 和电泳标志蛋白购自Sigma 公司;SDS 和丙
烯酰胺为Merck Darm Stadt 公司出品;考马斯亮兰G 2250为Fluka 公司提供;过硫酸铵购于Bio 2Rad 公司;TEM ED 为K och 2Light 公司产品;PMSF (苯甲基磺酰氟)为Serva 产品,Aldrin ,Dieldrin
(>99%)
为Riedel 2Dehaenagseelze 2
Hannover 生产,PTU (苯硫尿)等其它试剂为国
产分析纯。

112　试虫
棉铃虫为室内种群,虫源由本所吴坤君教授研究组友好赠送。

饲养环境为25±1℃,光照昼∶夜为14∶10,人工饲料喂养(Wu et al .,1997)。

6龄3日龄幼虫用于实验,每次制备用虫35～40头。

113　微粒体制备
参考Lee 等(1989)方法,棉铃虫幼虫(体重平均400mg 左右)在1115%的KCl 溶液中解剖,
中肠在去除内含物洗净后置匀浆缓冲液(011mol/ L磷酸钠缓冲液p H715,含1mmol/L ED TA、011 mmol/L D TT、1mmol/L PTU、1mmol/L PMSF 和10%甘油)。

幼虫脂肪体直接置于匀浆缓冲液中,去除其它成分并用缓冲液清洗后用于匀浆。

匀浆用全玻璃匀浆器在冰浴中进行,匀浆液经4层纱布过滤后在10kg离心力下离心15min(Beckman J2-MC高速离心机)。

过滤上清液后,在100kg 下离心1h(Hitachi CP270超速离心机),将微粒体沉淀在重悬缓冲液(011mol/L磷酸钠缓冲液p H715、1mmol/L ED TA、011mmol/L D TT、1 mmol/L PMSF和20%甘油)中重悬作酶源。

中肠和脂肪体的物质构成不同,因此得到的微粒体的成分不尽相同。

中肠微粒体沉淀均一,而脂肪体微粒体沉淀中可分为上下两层,上层(Ⅰ)浅黄色,下层(Ⅱ)无色冻状,两层较易剥离。

在沉淀重新悬浮时,如包括Ⅱ组分,则悬浮液呈乳状,这种制备液给P450常规的光谱分析带来极大的困难———基线不稳。

经仔细分析,在微粒体制备液中,Ⅱ组分的蛋白含量很低,是总蛋白量的10%,其O-脱甲基酶活性和艾氏剂环氧化活性分别占总活力317%和8%。

而剔除Ⅱ组分的制备液保留了90%以上的蛋白量和酶活性,且能较好地适合分光光度分析要求,差光谱分析中基线平稳,P450及b5的差光谱特征明显。

脂肪体微粒体酶液制备只取组分Ⅰ。

114　酶分析
11411　细胞色素P450含量测定　参考Omura与Sato(1964)方法,结合Kulkarni等(1975)及Jefcoate(1976)等指出的注意要点,按以下述方法进行。

将微粒体悬浮液稀释至1mg/ml左右,一分为二,分别加入参比杯和样品杯中,待基线平稳后,在样品杯中通CO1min,再在参比杯和样品杯中分别加入约2mg连二亚硫酸钠,平衡5 min后,在波长400～500nm处扫描(Beckman DU-650),记录CO差光谱,以(ΔOD450-490=91为mmol消光系数,计算P450含量。

11412　细胞色素b5含量测定　参考Omura与Sato(1964),Wheelock et al.(1994)方法。

将微粒体悬浮液稀释至1mg/ml左右,一分为二,分别加入参比杯和样品杯中,待基线平稳后,在样品杯中加入约5mg连二亚硫酸钠,在波长400～500 nm处扫描,记录差光谱。

以(ΔOD426-409=185为mmol消光系数,计算b5含量。

11413　细胞色素P450还原酶活性测定　主要参考Capdevila et al.(1973),Feng et al.(1992)方法,反应体系包括011m ol/L磷酸钠缓冲液(pH=718),015 mg/ml细胞色素C,40100μg微粒体蛋白,用011μm ol的NADPH启始反应,在30℃下动态记录光吸收(550nm)变化3min,以mm ol消光系数=2111来计算细胞色素C被还原的量。

11414　对硝基苯甲醚O-脱甲基酶活性(ODM)测定　参考Hansen等(1971)、Shang和Soderlund (1984)等方法,反应体系的总体积为2ml,含011mol/L磷酸钠缓冲液(p H=718)、0136mmol/L NADPH、115%BSA、3mmol/L对硝基苯甲醚(30μl乙醇液)和015ml微粒体酶液。

在25℃振荡温育30min后,用015ml浓度为110mol/L HCl 溶液终止反应,加入215ml三氯甲烷萃取产物,离心分层后,取115ml三氯甲烷层,加入等体积的015mol/L NaOH溶液反提取产物,将NaOH层在400nm波长比色,以015mol/L NaOH溶液为空白。

以对硝基酚作标准曲线,定量产物对硝基酚。

11415　艾氏剂环氧化酶活性(AE)测定　参考Lee和Scott(1989)方法,1ml反应体系中包括011ml酶液,011mol/L磷酸钠缓冲液p H=718, 0136mmol/L NADPH,用5μl艾氏剂(4mg/ml,乙醇液)启始反应,在25℃反应10～15min后,用2ml的冷石油醚(60～90℃)终止反应并提取产物狄氏剂。

石油醚相经无水硫酸钠脱水后,用于气相色谱分析。

色谱条件:HP5890气相色谱, ECD检测器;毛细柱:BPX250;进样口温度: 250℃;柱温230℃,检测器温度:300℃,柱流量:3103ml/min,该条件下样品保留时间为613 min,最小检出量为110ng/ml。

115　SDS-PAGE电泳
参考Laemmli(1970)方法,Bio2Rad Protean Ⅱ垂直板电泳仪,按Bio2Rad推荐程序操作,4%浓缩胶,12%的分离胶,恒流19mA。

上样量15～20μg/well。

116　蛋白含量测定
按Bradford(1976)方法,以BSA为标准。

117　数据分析
本文报道的数据为2～4次实验的结果,使用Microsoft Excel软件进行数据分析,用成对样本的t检验(双尾)来比较样本平均数的差异。

表1　棉铃虫6龄幼虫中肠、脂肪体微粒体细胞色素P450、b5含量和细胞色素P450还原酶活性T able1　The components of P450monooxygenase electron transport systems of
midgut and fatbody microsomes of6th instar larvae of H.armigera3
细胞色素P450Cytochrome P450 (nmol/mg protein)细胞色素b5Cytochrome
b5(nmol/mg protein)
细胞色素P450还原酶Cytochrome P450reductase
(nmol cytochrome C reduced/mg protein/min)
中肠(Midgut)01617±010*******±010*******±2192
脂肪体(Fatbody)01288±010*********±010*********±419033
t检验(t2test)t=7147,P=01005t=8143,P=01002t=13187,P=01001
中肠/脂肪体(Midgut/Fatb ody)211421622100
3数据为4次实验的平均数±标准差(Data are Mean±SD of four replicates)
33样本平均数差异显著(成对样本t检验,df=3,P<0105)[Means are Significantly different between midgut and fatbody(Student’s t2 test for paired samples,df=3,P<0105)]
2　结　果
211　中肠与脂肪体P450酶系成分的比较
微粒体的3个主要成分:P450,b5和细胞色
素P450还原酶在中肠都要比脂肪体高(表1),是
脂肪体组织的2倍以上。

212　中肠与脂肪体P450酶系活性
从测定的O-去甲基酶和艾氏剂环氧酶的比活
力来看,中肠活性比脂肪体高,中肠O-去甲基活
性是脂肪体的1178倍,而中肠的艾氏剂还氧化活
性却是脂肪体组织的2173倍(表2)。

表2　棉铃虫6龄幼虫中肠和脂肪体微粒体P450
加单氧酶活性(nmol/mg protein/min)3
T able2　P450Monooxgenase activities of mid gut
and fatbody microsomes of6th instar larvae
of H.armigera(nmol/mg protein/min)3
O-脱甲基酶O2demethylase ODM艾氏剂还氧化酶Aldrin epoxidase
AE中肠(Midgut)3114±0123336122±117933
脂肪体(Fatbody)1176±01502128±0145
t检验(t2test)t=4171,P=01018t=31896,P=0103中肠/脂肪体
(Midgut/Fatbody)
11782173
3数据为4次实验的平均数±标准差(Data are Mean±SD of four replicates)
33样本平均数差异显著(成对样本t检验,df=3,P<0105) [Means are significantly different between midgut and fatbody (Student’s t2test for paired samples,df=3,P<0105)]
213　中肠与脂肪体微粒体中O-去甲基酶的酶促动力学
从图1中可以看出,不同组织来源的O-去甲基酶具有不同的酶动力学特征,脂肪体O-去甲基酶的Km(011646mmol/L)小于中肠(318498mmol/L)(t=-51994,df=2,P=01027)表明脂肪体O-去甲基酶对底物对-硝基苯甲醚具有更强的亲和性,反映出不同组织来源的P450同功酶存在质的不同。

图1　棉铃虫6龄幼虫中肠与脂肪体微粒体P450
O-脱甲基酶的Linew eaver2Burk曲线
Fig.1　Linew eaver2Burk plots of p2nitroanisole
O2demethylase of midgut and fatbody microsomes
of6th instar larvae of H.armigera
S:底物浓度(mmol/L)(substrate)　V:酶活性(p2
nitrophenol formed nmoles/mg protein/min)(enzyme activity)
214　中肠与脂肪体微粒体的SDS2PAGE电泳图谱分析
P450的分子量在45～60kDa范围内,从图2可以看到,中肠与脂肪体微粒体在P450蛋白范围内的蛋白电泳图谱有所不同,反映出中肠和脂肪体微粒体蛋白组成的差异。

3　讨　论
已有的研究结果表明,不同种类的昆虫,其主要解毒部位可能不同(Wilkinson et al.,1972; Hodgson,1985)。

对于大多数鳞翅目幼虫,中肠是其主要解毒部位。

从本试验结果来看,中肠微粒体P450酶系各成分含量以及比活性都比脂肪体更高,中肠当为棉铃虫对外来物质的主要解毒部位。

012动 物 学 报48卷
图2　棉铃虫6
龄幼虫中肠脂肪体微粒体的
SDS 2PAGE 电泳图谱
Fig.2　Sodium dodecyl sulfate 2polyacryamide gel electrophoresis patterns of midgut and fatbody microsomes of 6th instar larvae of H.armigera
M :标准蛋白(Marker )　1,3:中肠(Midgut )2,4:脂肪体(Fatbody )
由此可以推断,经口药物(如残留在作物上的农药)
更能被棉铃虫代谢;如这种代谢起解毒作用,则有利于棉铃虫的存活和抗药性的发展。

但要注意的是,由于P450底物的特异性以及测定条件的变化,不
同组织来源的加单氧酶的活性不同,不能排除脂肪体对其它底物具有更高活性的可能性。

棉铃虫中肠细胞色素P450的总含量比脂肪体高,但就某一种P450蛋白而言,它在不同组织中的分布种类和相对含量不同,Ranasinghe 等(1997)报道了棉铃虫中P450CYP6B2的mRNA 水平在脂肪体是中肠的314倍。

在自然条件下,棉铃虫主要通过取食接触外源物质,P450定位于中肠不难理解。

本试验显示棉铃虫脂肪体组织也表现相当程度的对不同底物的代谢活性,这些活性的存在是对中肠解毒活性的补充以保护昆虫免遭经皮物质的毒害,还是为补偿蛹或成虫期低P450表达做积累准备,还无法区分。

在飞蝗脂肪体微粒体中已发现存在参与脱皮素代谢的P450酶系(20-羟基化酶)(Feyereisen ,1985),棉铃虫微粒体P450是否与内源物质代谢有关,现未见任何报道。

脂肪体P450酶系在内源物质代谢中的作用还待研究。

来源于不同组织的组织微粒体其P450组成的差异可从SDS 2PA GE 电泳图谱中看出。

不同组织来源的P450存在质的不同,表现在对底物代谢活性的差异,如脂肪体P450酶系具有对底物对-硝基苯甲醚更强的亲和性。

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外　文　摘　要(Abstract)
COMPARISON OF MICROSOMAL P450MONOOX Y GENASES
IN MID GUT AN D FATBODY TISSUES OF 6TH INSTAR LARVAE OF COTTON BOLLWORM (H EL I COV ER PA A RM I GERA )
Q IU Xing 2Hui L I Wei L EN G Xin 2Fu
(State Key L aboratory of Integrated M anagement of Pest Insects and Rodents ,Instit ute of Zoology ,
Chi nese Academy of Sciences ,Beiji ng 100080,Chi na )
Cotton bollworm (Helicoverpa armigera )is a major pest of many agricultural plants around the world.The explosion of the cotton bollworm populations is mainly attributed to its tolerance of an adverse chemical environment.The major enzyme involved in the primary detoxification pathway of insecticide and other exogenous compounds in general is cytochrome P450monooxygenases.To better understand the biochemical property of these monooxygenases ,we assayed the components of P450monooxygenase electron transport systems and some activities of the microsomal P450monooxygenases in the two main detoxification tissues
(fatbody and midgut )of 6th instar larvae of cotton bollworm by spectrophotometry and gas chromatography.The results were compared between the two tissues.
The microsomal pellet from larval midgut was even ,while that from larval fatbody was separated as two
fractions :the upper layer (Fraction Ⅰ
)contained the majority of the microsomal proteins and preserved more than 90%of monooxygenase activities.The technical problem in determination of cytochrome P450and b5contents caused by the milk 2like fatbody microsomal preparation could be overcome if excluding fraction Ⅱfrom the preparations.
Compared with fatbody microsome ,the midgut microsome contained significantly higher levels of
cytochrome P450(2114fold ),b5(2162fold )and NADPH 2cytochrome P450reductase (2100fold )and showed significantly higher aldrin epoxidation (2173fold )and p 2nitroanisole demethylation (1178fold ).The assay results of the contents and the activities of the monooxygenases indicate that midgut plays very important roles in the metabolism of foreign compounds in cotton bollworm.The differences of monooxygenases in midgut and fatbody were observed in kinetic parameters and SDS 2PA GE patterns.The Km of p 2nitroanisole O 2demethylase from fatbody (011648mmol/L )was much lower than that from midgut (318498mmol/L ),which indicates that fatbody microsomes have stronger affinity to the substrate p 2nitroanisole.
K ey w ords Cotton bollworm (Helicoverpa armigera ),Midgut ,Fatbody ,Cytochrome P450,Monooxygenase
2
12动 物 学 报
48卷。