水解度指标测定

水解度的测定
方法一：（前三酮比色法）
（1）标准曲线制定:
1、20 g/ml甘氨酸：2mg甘氨酸定容到100ml容量瓶中。

2、前三酮显示剂：水合前三酮0.5g ,果糖0.3g，磷酸氢二钠11.2g ,磷酸二氢钾6g,定
容到100ml.稍热溶解，避过低温保存1周。

3、40%^醇
标准曲线制作
试管0 1 2345678待测
样品标液ml0.000.1 0.20.30.40.50.60.7 1.00.5蒸储水ml 2.00 1.90 1.80 1.70 1.60 1.50 1.40 1.30 1.00 1.5
前二酮显示
剂ml
1 1 1
摇匀，沸水浴1
15min,
1 1 1
用冷水迅速冷却至室温
111
40%^醇ml5 5 55555555甘氨酸g
OD(570nm)
0 2 46810121420??因甘嬴酸的分子量为：75.07,换算成-NH?的呻。

1数的AQ关系: 水解度计算公式：DH-—>100%
水解液-心曲含萼5凹一原料蛋白质中游高_也含量（响0 g）
h^irnmol/g)
xioo%
所以米糠蛋白的加广7・3477
N----水解液蛋白含量（凯氏定氮）
F-----米糠蛋白换算系数5.95
方法二：采用甲醛滴定法。

水解度（%）=（水解后生成的氨基氮的量/样品中总氮含量）X 100%
（1）粗蛋白含量的测定：采用凯氏定氮法。

（2）氨基氮的测定
氨基酸含有氨基和埃基，具有两性，加入甲醛与氨基酸中的氨基作用，可消除其碱性，使埃基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定，即可对氨基酸进行定量。

1、酚猷指示剂：0.5g酚猷溶丁100ml 50%的乙醇中
2、中性甲醛溶液：甲醛溶液（36-37%,分析纯）50ml，加入0.5%的酚猷指示剂约
3ml，滴加0.1mol / L NaOH使溶液显微粉色，储存丁棕色瓶中，临用前配制。

具体方法如下：
分别吸取2mL不同水解度的水解液丁烧杯中加蒸僻水5mL,向烧杯中加入5滴酚猷指示剂，混合后加中性甲醛溶液 2.0ml再混合，用0.1mol /L NaOH滴定显微粉色。

同时取同浓度但未水解的蛋白液2mL做空白实验。

V-V n xNx 14.008
百甘£人n / 、
国基炎［含里（ing/inL）= -----------------
10
式中：
V—样品耗用氢氧化钠标准溶液毫升数；
V0—空白耗用氢氧化钠标准溶液毫升数；
N—氢氧化钠标准溶液摩尔浓度；
14.008— 1 mL浓度为1.000 mol/L氢氧化钠标准溶液相当丁氮的质量（mg）。

方法三：
2.2.6水解度的测定
采用pH-Stat滴定法啊任”根据多肽在不同pH的条件下解离状态不同：置pH位恒定时酶水解蛋白后形成的自由梭基，自由氛基或氨基艘残基数目不等；当在碱性条件卜水解时，释放的氨基酸使溶液pHffl明显卜'降，用稀碱液将其滴盅回起始pH值，可以知道蛋自质的肽健断裂的情况，根据消耗的碱量计算水解度DH值。

水解度=(水解的肽健数/总肽键数)xlOO%
计算公式：DH =VWN Na0H/(0・Mp，H龄)乂100% 2-2
公式中：V N1Ce!滴定消耗的碱体积(mL)
N Na0H :滴定消耗的碱当量浓度(jnol/L)
Mp ；参加蛋白水解的蛋白总量(g)
Hy 每克蛋白中肽键的克当量数(9.2mmd/g)
a : a-g基酸的平均解离度(S0T肘，pK=Zl士0.09) d=10pHpK/ (1+10
归谜)
pK=7.8+2400* (298-T) /298T
T=273.15+t t：反应环境的温度(莒)
pH:反应起pH值
2.3.3水解度(DH)的测定
贫白质的水解程:度常以蕴白质中的肽锤被断裂的臼分率来•费示，常见的水解度测定和监控的方法主要有pH-stat法(Alder-Niggen, 1986).三硝基苯璜酸法、甲醛滴定法、三氟乙酸沉淀法等，由于pH-stat法具有操作简单，连续测定的优点，并.IL当pH大于6时，水解过程中加入碱的果与断裂的肽键的数鼠有定/的关系.因此，本酬究采用该法来检测大米蛋白的水解度,
X100
h -^xjV^xl/ccxl / M
式中：h——单位质量蛋白质中被水解的肽奥的量（mind g1）；
B—消耗的碱液体积，niL；
N.——碱液的浓度，molt；
1/a校11 ：系数 < 碱性蚩白的1如=1,01）：
M#——底物中蛋白质的含晴，争
——底物中蛋白质中的肽键总数，mmol/g （大米蛋白取8.40）（Hainada. 2000）.
氮溶指数测定（TCA-NSI）
可以通过检测其氮溶解指数来初步判定小肽或寡肽含量。

NSI （ % ） = （ N1/ N0） *100
N0 =总氮
N1 =可溶性氮（用三氯乙酸——可溶性氮测定法）
三氯乙酸（TCA）是一种蛋白质沉淀剂，它可以沉淀蛋白质和较长的肽段。

可以被三氯乙酸沉淀的肽段所含的最少氨基酸残基数与底物的种类有关，就特定的底物而言，三氯乙酸氮溶解指数可以定性反映蛋白质的分解情况，溶解指数越高，表明较短肽段含量越高。

三氯乙酸氮溶指数（TCA— NSI）测定方法：
将20ml 1 0 % 三氯乙酸（TCA）溶液添加到20m l待测混合液（混合液浓度为10 %）,混合液震荡，静置10分钟，在4000转/分下离心20分钟，取上清液测可溶性总氮。

（福林酚法比色法）。

抗氧化活性测定方法
（一）试剂盒法测抗氧化活性。