利用高速逆流色谱分离制备达托霉素

利用高速逆流色谱分离制备达托霉素
夏兴;戈梅;罗敏玉;阮丽军
【摘要】Daptomycin is an anti-resistant antibiotics, which is difficult to separate from fermentation broth. In this paper, high speed counter-current chromatography (HSCCC) was applied to preparation of daptomycin. A biphasic solvent system composed of ethyl acetate-n-butanol-2mmol/L trifluoroacetic acid (4:1:5, volume ratio) was used. The top phase was chosen as the stationary phase, and the bottom phase was chosen as the mobile phase. The fractions purified and collected was analyzed by high-performance liquid chromatography. A pale yellow powder with purity above 95 percent was obtained through lyophilization. And the structure of fractions was identified by UPLC-MS Analysis as daptomycin.This method is convenient to obtain pure daptomycin.%达托霉素是一种重要的临床抗耐药菌抗生素,其分离纯化较困难.本文研究了利用高速逆流色谱法快速制备达托霉素纯品的方法.研究获得的两相系统为乙酸乙酯-正丁醇-水(2mmol/L TFA)(4∶1∶5 V/V),上相为固定相,下相为流动相.在该条件下通过高速逆流色谱收集纯化目标产物,并冻干后获得淡黄色的粉末,液相纯度大于95％.经UPLC-MS分析鉴定产物与达托霉素一致.该方法可以用于达托霉素纯品的快速制备.
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2012(037)009
【总页数】4页(P683-686)
【关键词】高速逆流色谱;达托霉素;UPLC-MS
【作者】夏兴;戈梅;罗敏玉;阮丽军
【作者单位】上海交通大学药学院,上海200240;上海来益生物药物研究开发中心,上海200240;上海来益生物药物研究开发中心,上海200240;上海来益生物药物研究开发中心,上海200240;上海交通大学药学院,上海200240;上海来益生物药物研究开发中心,上海200240
【正文语种】中文
【中图分类】R978.1
达托霉素是由玫瑰孢链霉菌发酵产生的脂肽类抗生素，对于包括耐甲氧西林金葡菌(MRSA)与耐万古霉素肠球菌在内的革兰阳性菌具有强大的杀灭作用[1-2]，于2003年成功上市。

其含有13个氨基酸，其中10个氨基酸形成环十脂肽，另外3个氨基酸与癸酰基相连形成侧链，结构复杂，很难进行化学合成[3]。

目前而言，通过微生物生产达托霉素是唯一合理的方法。

目前的分离工艺主要通过大孔树脂吸附、离子交换树脂分离、以及反相柱层析等进行。

但由于发酵产物众多，整个工艺路线较长，期间会使用大量的有机溶剂[4-6]。

而达托霉素结构稳定性较差[7]，分离过程中容易发生水解等变化，获得高纯度样品的难度比较高。

高速逆流色谱是一种液液分配色谱方法，由Ito发明。

该技术已被广泛用于制备少量的天然产物，在抗生素领域高速逆流色谱也得到应用[8]。

高速逆流理论非常容易理解，对于大多数的极性分析物而言溶剂混合物也是已知的。

目前为止，利用高速逆流分离纯化达托霉素还没有被报道过。

本研究旨在开发一种新的快速分离获得达托霉素纯品的方法。

图1 达托霉素结构图Fig.1 Structure of daptomycin
1 仪器和试剂
TBE300A高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司)，自动收集器DC-1000 (东京理化)；安捷伦1100液相系统；旋转蒸发仪(德国Heidolph)；冷冻干燥机(Christ)。

实验中用于分离和提取的有机试剂均为分析纯，购置于上海医药集团。

达托霉素发酵液由上海来益生物药物研究开发中心提供。

2 实验方法
2.1 达托霉素发酵液预处理
达托霉素为水溶性抗生素，主要分布在胞外。

将发酵液在4000r/min下离心，获得发酵液的上清溶液，菌渣弃去。

上清液使用大孔树脂HZ818静态吸附，然后装柱，水洗涤后用5倍体积的75%乙醇洗脱。

洗脱液进行减压浓缩脱去乙醇，调节pH至3.5，等体积正丁醇萃取2次。

将正丁醇减压浓缩至干，获得含有达托霉素的粗品[4,9]。

2.2 溶剂系统选择
依据目标化合物的分配系数(K)选择两相溶剂系统。

通过HPLC测定达托霉素的K 值：1mg粗品装于2mL的EP管中，加入2mL预先制备的两相溶剂。

盖塞，振荡1min，至样品在两相中完全平衡。

分别取上相和下相，然后通过HPLC分析。

分配系数(K)为上相与下相达托霉素峰面积的比值[10]。

分别试用了乙酸乙酯-乙醇-水、正丁醇-甲醇-水、乙酸乙酯-甲醇-水、乙酸乙酯-正丁醇-水多个溶剂系统，并在水中加入不同浓度的三氟乙酸调节pH。

最终选用乙酸乙酯-正丁醇-水(2mmol/L TFA)。

2.3 两相溶剂系统和样品溶液制备
根据所选择的乙酸乙酯-正丁醇-水(2mmol/L TFA) (4:1:5 V/V/V)两相溶剂系统，
按比例将各种不同溶剂加入分液漏斗中，剧烈振荡充分混合分相平衡后分出上相和下相，下相为流动相，上相为固定相。

使用前上、下相超声30min。

将粗品溶于
10mL上相和10mL下相的混合溶液中，制备样品溶液。

2.4 高速逆流分离过程
HSCCC系统以头到尾方式进行，上相为固定相，分离温度为20℃。

多层柱首先
用上相充满。

然后以1.5mL/min流速泵入下相，转速为750r/min。

将70mg含
有达托霉素、A21978C组分及其他杂质的粗品(其中达托霉素液相含量约25%)溶于20mL上相和下相的混合液中，平衡后经进样阀载入。

分离实验温度为20℃，利用自动收集器收集流出物，每6min收集1管(9mL)。

通过HPLC鉴定只含有达托霉素的流分，35℃下减压浓缩除去流分中残留的有机溶剂，冷冻干燥。

2.5 HPLC分析和UPLC-MS鉴定
HPLC方法参照文献[11]。

采用Hypersil ODS柱(100mm×4.6mm,5μm)，流动
相为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5)-乙腈=70:30，流速1.5mL/min，检测波长223nm。

通过UPLC-MS (ESI+)确认主产物峰与主要相关物质峰。

UPLC：ACQUITY UPLC BEH C18柱(100mm×2.1mm,1.7μm; Waters公
司,Milford,USA)。

A、B两个流动相梯度分析：A相为0.05%甲酸水溶液，B相为含0.05%甲酸的乙腈。

分析梯度：0～17min，A相95%到58%；17～18.5min，A相58%到0%；18.5～20min，A相95%。

质谱：Waters质谱Q-TOF Premier 质谱仪。

方法：毛细管(kV)3.0；采样锥 35.0；吸锥 4.0；离子导向装置 3.0；离子源温度105℃；脱溶剂温度350℃；锥孔气流(L/Hr) 50.0；脱溶剂气流 (L/Hr)600.0；低端分辨率(LM Resolution) 4.7；高端分辨率(HM Resolution) 15.0。

3 结果与讨论
3.1 HSCCC条件优化
HSCCC实验最关键步骤为选择好的溶剂系统。

为了有效分离目标物达托霉素，根据达托霉素的理化性质，初步测试了乙酸乙酯-乙醇-水、正丁醇-甲醇-水、乙酸乙酯-甲醇-水、乙酸乙酯-正丁醇-水多个溶剂系统。

这些不同溶剂系统所测量得到的达托霉素的K值罗列在表1中。

结果显示，乙酸乙酯-甲醇-水和乙酸乙酯-乙醇-水系统，达托霉素主要集中在下相中；正丁醇-甲醇-水系统中，达托霉素主要集中在上相中。

而乙酸乙酯-正丁醇-水系统中(K值最好在0.5～2.0间），达托霉素在上下相中都有分配，且两相分层较好。

因此，选择乙酸乙酯-正丁醇-水(TFA)系统，通过调节各溶剂的比例和TFA的浓度调节分配系数。

结果见表2。

表2中(f)乙酸乙酯-正丁醇-水(20mmol/L TFA)(9:1:10 V/V/V)和(i)乙酸乙酯-正丁醇-水(2mmol/L TFA)(4:1:5 V/V/V)的K值较好，符合分离的要求。

系统(f)的K值较小，洗脱时与溶剂前沿接近而使得分离度有所降低，选择系统(i)的K值合适，
分离度和峰宽都较合适。

溶剂系统中加入三氟乙酸目的在于调节溶剂的pH值和极性[10]。

为进一步确定所选溶剂系统是否合适，室温条件下测试了系统(i)的沉降时间和体积比(分开后上下相的体积比)，结果沉降时间为25s、体积比为1.0。

沉降时间与固
定相的保留率有关，而好的体积比则可以避免过浪费溶剂。

系统(i)提供了理想的上下相体积比，理想的沉降时间在25s的范围之内，因此适用于此后的HSCCC实验。

表1 达托霉素在不同两相系统中的分配系数(K值)Tab.1 Distribution coefficients (K) of daptomycin in different solvent system
经过优化，最终确定系统为乙酸乙酯-正丁醇-水(2mmol/L TFA)(4:1:5 V/V)，流速为1.5mL/min，转速为750r/min，分离温度为20℃，固定相保留率为40%。

3.2 达托霉素的HSCCC 分离和高效液相分析
由于达托霉素的最大吸收波长为223nm，而乙酸乙酯在此波长下也有吸收，因此在进行HSCCC时不能进行在线检测。

因此，需要将HSCCC的流分进行HPLC检测。

HPLC检测结果显示，达托霉素在第40管(240min)时开始出峰，至52管
(312min)时其在流分中的含量较低。

根据HPLC的结果，将达托霉素纯度较高的
部分进行合并，旋转减压浓缩脱去有机溶剂，冷冻干燥，最终获得13.5mg淡黄
色粉末，HPLC检测纯度大于95% (见图2)。

3.3 UPLC-MS鉴定结果
对获得的样品进行了UPLC-MS分析，确定主峰的分子量为1620.77，与达托霉
素的分子量一致。

除达托霉素外，Rt 7.252min的主要相关物质的分子量为1602，经与文献比较，确定该主要相关物质为脱水达托霉素[10]。

该相关物质是由达托霉素的天冬氨酰脱水所形成，与达托霉素结构上相似，并且是在分离提取过程中产生，无法通过一步HSCCC得到分离[7,12]。

样品的离子流图和相关的质谱见图3。

表2 达托霉素在不同乙酸乙酯-正丁醇-水(TFA)体系中分配系数(K值)Tab.2 Distribution coefficients (K) of daptomycin in defferent ethyl acetate-butanol- water (TFA) system
图2 发酵液经HSCCC分离前后的HPLC图Fig.2 HPLC protiles before (A) and after (B) HSCCC separation
4 结论
图3 样品的UPLC-MS图Fig.3 UPLC-MS chromatogram of sample
达托霉素的结构决定了其具有类表面活性剂的性质，在分离过程中容易裹挟其它杂质或类似物，纯化工艺复杂。

本文成功地将HSCCC方法应用于纯化达托霉素和快速获取达托霉素纯品，与传统柱层析方法(可能对目标混合物有不可逆的吸附)相比，具有纯化步骤短、溶剂用量少、分离快速避免杂质产生等优点。

一步分离获得的达
托霉素纯度大于95%，本研究结果可用于快速小规模制备达托霉素纯品。

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