致谢衷心感谢导师黄巧冰副教授在学...

缩写词表
（ＡＢＢＲＥＶＩＡＴＩＯＮＳ）
ＢＫｃｈａｎｎｅｌｌａｒｇｅｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ，ｃａｌｃｉｕｍ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｏｔａｓｓｉｕｍｃｈａｎｎｅｌ
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缺血预处理保护严重脑缺血对大鼠海马ＣＡｌ锥体细胞的损伤并ｔｉｐｓｙ］大电导钙依赖性钾通道活动
硕士研究生：胡平
导师：黄巧冰
高天明
摘要
／缺血预处理可以使脑组织对随后严重脑缺血具有耐受性（缺血耐受）。

３分钟前脑缺血对大鼠海马ＣＡｌ锥体细胞不产生明显损害，但是可以对随后更长时间的能引起ＣＡｌ锥体细胞死亡的前脑缺血所致的脑损伤起保护作用。

已有实验表明热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＳＰ）、Ｂ细胞淋巴瘤／白血病．２蛋白（Ｂｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａ／ｌｅｕｋｅｍｉａ－２，Ｂｃｌ．２、活性氧自由基（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）、核转录因子．ＫＢ（ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ－ｋａｐｐａＢ，ＮＦＫＢ）的上调参与了预缺血处理调节的神经元保护，但是，确切的机制有待进一步阐明。

ｉ户７Ｌ—
ｆ大鼠全脑缺血后海马ＣＡｌ区锥体神经元发生延迟性死亡。

兴奋性氨基酸学说即细胞外兴奋性氨基酸过度积累导致钙超载而引起细胞毒性一直被认为是缺血性脑损伤的重要机制。

然而，近来运用在体和离体细胞细胞内记录发现，严重脑缺血后ＣＡＩ锥体细胞的放电频率和兴奋性持续下降。

钾通道在控制神经元膜的兴奋性方面发挥重要作用，脑缺血后神经元兴奋性的降低可能是由于钾通道活动的增强所致。

最近用膜片钳单通道和全细胞记录确实发现短暂性脑缺血后大鼠ＣＡＩ区锥体神经元的钾通道电流显著增强。

而且在培养的皮层神经元上的研究发现，外向钾电流的增加可以触发细胞的程序性死亡；在体与离体的实验均证明钾通道的阻断剂可以抑制细胞的凋亡。

上述结果表明钾通道活动增强可能是全
－－２－－
＼口／。

一脑缺血后大鼠海马ＣＡｌ锥体细胞的迟发性死亡的机制之一。

上／我室最近的研究表明大电导钙依赖性钾通道（ＢＫ通道）活动的增加参与了前脑缺血后大鼠海马ＣＡＩ锥体神经元的凋亡。

因此我们推测ＢＫ通道活动的抑制可能参与了脑缺血耐受。

在本次研究中，大鼠四血管夹闭３分钟脑缺血为预缺血组，只给予手术而无缺血处理为假手术组，预缺血组３天后再给予四血管夹闭８分钟脑缺血处理分别为缺血耐受组，
只给予四血管夹闭８分钟脑缺血处理为严重缺血组。

再灌流７天后，预缺血组与假手术组组织学相比无改变。

严重缺血组可导致海马ＣＡｌ区９０％以上的锥体细胞死亡；但是，缺血耐受组海马ＣＡｌ区８９％以上的锥体细胞得以存活。

我们运用内面向外式膜片钳技术研究预缺血组缺血后６小时，２４小时，４８小时以及严重缺血组和缺血耐受组缺血后２４小时急性分离的大鼠海马ＣＡｌ区锥体神经元ＢＫ通道活动的变化。

实验结果发现预缺血组缺血后第一个２４小时内ＢＫ通道的开放概率明显下降，而严重脑缺血组缺血后２４小时ＢＫ通道的开放概率明显增加，经通道动力学分析，预缺血组ＢＫ通道开放概率的降低是由于关闭时间的延长，开放频率的降低所致，而与开放时间无关；严重缺血组ＢＫ通道开放概率增加是由于开放时间的延长、关闭时间的缩短、开放频率的增加所致；
而对ＣＡｌ区锥体神经元具有明显保护作用的缺血耐受组ＢＫ通道的开放概率与正常对照组无明显变化。

缺血前后通道的电导、反转电位无明显改变；因此，上述结果提示ＢＫ通道活动降低与脑缺血耐受有关。

关键词：；缺血预处理；大电导钙依赖性钾通道；
海马；膜片钳。

ＰＲＥＣｏＮＤＩＴｌ０ＮＩＮＧＰＲＯＴＥＣＴＳＬＥＴＨＡＬＩＳＣＨＥＭＩＡ．ＩＮＤＵＣＥＤ
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３－ｍｉｎｐｅｒｉｏｄｏｆｆｏｒｅｂｒａｉｎｉｓｃｈｅｍｉａｉｎｒａｔｓｐｒｏｄｕｃｅｓＳＯａｐｐｒｅｃｉａｂｌｅｎｅｕｒｏｎａｌｄａｍａｇｅｉｎｔｈｅＣＡｌｓｕｂｆｉｅｌｄｏｆｔｈｅｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｂｕｔｃａｎｎｐｒｏｔｅｃｔａｇａｉｎｓｔｎｅｕｒｏｎａｌｄａｍａｇｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｏｎｇｅｒｐｅｒｉｏｄｓｏｆｉｓｃｈｅｍｉａ，ｗｈｉｃｈｎｏｒｍａｌｌｙｋｉｌｌｓＣＡｌｎｅｕｒｏｎｓｉｎｔｈｅｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ－ｍｅｄｉａｔｅｄ
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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｏｔａｓｓｉｕｍｃｈａｎｎｅｌ；Ｂｒａｉｎｉｓｃｈｅｍｉｃｔｏｌｅｒａｎｃｅ；Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ；
一５一
ＢＫｃｈａｎｎｅｌ；Ｒａｔ；Ｐｙｒａｍｉｄａｌｎｅｕｒｏｎｓ；Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ；Ｐａｔｃｈｃｌａｍｐ
一６－
引言
脑血管病严重危害人类健康，已成为世界第三大死亡原因和首要致残原因，其中缺血性脑血管病约占５６．６～６０％，即使存活者也因迟发性死亡（ＤＮＤ）而出现程度不同的运动，语言，及认知功能上的障碍等神经系统后遗症。

并且随着人口老龄化的到来，其发病率里上升趋势，而且目前临床上尚无理想的治疗手段。

前脑缺血在临床多见于心跳骤停、心肌梗死、休克以及溺水、窒息、呼吸衰竭等造成的脑部血液低灌流，缺血范围广泛，海马等缺血损伤敏感区易发生选择性的神经元损伤【”】。

近年来的研究表明海马与情绪、内脏活动、学习记忆有关。

因此，以动物脑缺血再灌注模型模拟人类缺血性脑血管病并对之研究是当代神经科学的重大课题之一。

缺血预适应（ｉｓｃｈｅｍｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ，ＩＰ），是指某一组织～次或者多次短暂性缺血再灌注后，该组织对以后较长时间的缺血性损伤产生显著的耐受性，表现为实质细胞死亡明显减少，梗死范围大幅度减少，器官功能障碍明显减轻等。

ＩＰ现象最初见于心脏，随后在脑、骨骼肌、肝、肾脏、小肠等器官中也发现类似的现象Ⅲ。

脑缺血预适应（ｂｒａｉｎｉｓｃｈｃｍｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ，ＢＩＰ）是对脑组织神经元细胞不具有损伤的２－３分铸短暂脑缺血能对随后２－４天能导致神经元细胞死亡的严重脑缺血造成的损伤具有明显的保护作ｊ君［４１。

Ｐｕｌｓｉｎｅｌｌｉ建立的大鼠四血管夹闭短暂性前脑缺血模型是目前国际上研究脑血管病机制普遍采用的模型之一。

严重致死性的脑缺血再灌流后，海马ＣＡｌ区锥体细胞发生迟发性细胞死亡【¨】，即缺血４８小时后，光镜下才见到ＣＡｌ区锥体细胞死亡，而ＣＡ３区的锥体细胞却几乎不受损害；非致死性的２—３分钟的脑缺血再灌流后，海马ＣＡＩ区锥体细胞不发生迟发性细胞死亡，并对随后的严重脑缺血的脑损伤具有明显的保护作用。

在实验中发现已诱导缺血耐受的海马ＣＡｌ的神经元并没有改变其对缺血起初的极具有意义的反应，包括微管的溶解、蛋白合成的停滞、多聚核糖体的分解嘲；但是这些改变能够恢复。

在对脑缺血耐受机制研究中发现，热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＳＰ）家族表达量增加，他们参与新蛋白的折叠，保护线粒体，干扰应激反应诱导的凋亡而发挥保护作用［６１。

氧自由基内源性清除酶超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ
－７－
ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ），谷光甘肽过氧化物（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｐｅｒｏｘｉｄｅｓ，ＧＳＨ—Ｐｘ）在短暂非致死性脑缺血后活性明显增高，造成脂质过氧化物的减少，减弱了氧自由基的损伤｜７Ｊ。

亦有研究发现在短暂非致死性脑缺血后一氧化氮（ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ，ＮＯ）合成酶活性增强，其抑制剂７－硝基吲哚可抑制ＩＰ，用外源性ＮＯ可以模拟ＢＩＰ瞵１；即早基因（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒ］ｙｇｅｎｅ．ＩＥＧ）中的ｃ—ｆｏｓ，ｃ—ｊｕｎ的表达参与了ＢＩｐ［９１；短暂性脑缺血有效抑制抑癌基因ｐ５３的活化以及靶基因ｐ２１、ＰＡＧ６１８／Ｖ／ｉｇｌ的表达，可能通过抗凋亡及促进细胞周期的转换而发挥脑保护作用【加Ｉ。

最近有实验证明白介素（ｉｎｔｅｒｉｅｕｋｉｎ，Ｉ乙）‘ｕ】与肿瘤坏死因子（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ，ＴＮＦ）１１２】参与了缺血后的脑保护。

事实上，在脑缺血耐受的机制上仍有很多相关的细节并不清楚。

因此，ＢＩＰ的确切的机制还有待进一步阐明。

研究缺血耐受机制能够为进一步研究与治疗脑缺血性疾病提供新的视角与方法。

很长时间以来，兴奋形神经毒学说即兴奋性突触过度兴奋所触发的胞内Ｃａ２＋自稳态的紊乱及ｃａ２＋经谷氨酸受体通道持续大量的内流一直被认为是缺血性脑损伤的重要机制之一【ｕＪ。

然而，近年来通过严格控制动物的体温和脑温后发现，以往观察到的ＮＭＤＡ受体拮抗剂如ＭＫ．８０１和ＡＭＰＡ受体拮抗剂ＣＮＱＸ对海马ＣＡｌ锥体神经元的保护作用是由于药物降低体温所致，在排除体温因素后，这些谷氨酸受体拮抗剂并无明显的保护作用［１４－１５１，因而，对该学说提出了极大的挑战。

而且，在脑缺血后海马ＣＡｌ区锥体神经元上并末观察到兴奋毒性学说所预期的神经元的过度兴奋性活动。

离体【１６１和在体【１７１的细胞内记录的研究表明，ＣＡｌ区锥体神经元的自发放电频率及细胞膜兴奋性在缺血再灌注后呈持续性降低，并且有Ｃａ２＋依赖性钾电流介导的超级化后电位（ＡＩ珀）的幅度持续性升蒯１７】，而缺血耐受神经元（ＣＡ３锥体细胞齿状回颗粒细胞）的这些特性仅呈一过性变化【Ⅲ．提示细胞膜兴奋性持续性降低可能是触发迟发性神经元的一个重要因素。

钾通道在控制神经元膜的兴奋性方面发挥重要的作用。

神经元兴奋性的降低可能是由于钾通道活动的增强所致。

全细胞记录也确实发现短暂性前脑缺血后大鼠ＣＡＩ区锥体细胞的钾通道电流显著增科”Ｊ。

最近一系列的研究表明钾通道活动增强参与了细胞调亡。

在培养皮层神经元时发现，去除血清可引起神经元延迟整流性钾通道增强而使细胞内钾大量
丧失而导致神经元死亡，当使用钾通道阻断剂ＴＥＡ减少钾电流或提高细胞外钾均可显著减少神经元死亡，而ｃａ”、ｃｌ。

通道阻断剂无此保护作用；并用钾通道开通剂ｃｒｏｍａｋａｌｉｍ和钾通道的开孔剂Ｖａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ可以诱导该神经细胞的凋亡［２０１。

同时，在细胞外低Ｎａ＋，Ｃａ２＋的情况下使培养的神经元暴露于２００ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮＭＤＡ环境中，结果发现皮层神经元内钾浓度显著降低并发生死亡，表明此时神经元的损伤与Ｎａ＋，Ｃａ２＋无关，而可能与Ｋ＋相关。

进一步的研究发现提高细胞外Ｋ＋浓度可同时减少胞内Ｋ＋外流与神经元死亡［２１１。

由于凋亡参与了大鼠前脑缺血后海马ＣＡＩ区锥体神经元的迟发性死亡，因此提示，钾通道活动增强可能是脑缺血后神经元损伤的重要机制之一。

大电导钙激活钾通道（ＢＫ通道）是钾离子通道的一种，广泛地分布在组织中，其活动由膜去极化并随细胞内钙浓度的升高而增加，为细胞代谢与膜电生理特性之间提供联系。

ＢＫ通道首次从果蝇上成功克隆，其主要基因序列显示它们属于电压门控钾通道大家族【ｎ１。

ＢＫ通道是包括两个完整的跨膜亚单位组成的复合蛋白，形成孔道的Ｃｌ亚基和具有调节作用的Ｂ亚基。

在海马，ＢＫ通道由动作电位的上升相所进入的ｃａ２＋和膜的去极化所激活，它介导了动作电位复极化和快后超级化电位（ｆＡＨＰ）的产生删，且在调节静息电位时神经元兴奋性中也具有重要作用‘２４１。

低浓度ＴＥＡ（Ｏ．５ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ）可以较选择性阻断ＢＫ通道【２Ｓｌ，而ＣＨＴＸ是其特异性的阻断剂１２。

ｆｌ。

我室的最近的工作表明：（１）前脑严重缺血后大鼠海马ＣＡｌ锥体神经元ＢＫ通道功能显著增强［２７１；（２）侧脑室给予ＴＥＡ对前脑缺血后大鼠海马ＣＡｌ区锥体细胞的迟发性死亡具有明显的保护作用【２９１，（３）侧脑室给予ＢＫ通道特异性阻断剂ＣＨＴＸ对前脑缺血后大鼠海马ＣＡｌ区锥体细胞的迟发性死亡具有明显的保护作用Ｂ”，其保护程度与ＴＥＡ相同；结果表明对ＴＥＡ敏感的钾通道（主要是ＢＫ通道）可能参与了海马ＣＡｌ区锥体神经元的迟发性死亡。

总而言之，ＢＫ活动增强与脑缺血ＣＡｌ锥体细胞的凋亡有关，阻断ＢＫ通道对脑缺血后的脑损伤具有明显的保护作用。

严重脑缺血后，ＢＫ活动的增强与ＣＡｌ神经元细胞凋亡有关。

那么，我们推测：ＢＫ通道活动的下降可能与具有脑保护作用的脑预缺血耐受有关。

我们拟观察：（１）不导致ＣＡｌ锥体神经元死亡的３分钟前脑缺血再
灌流后６小时、２４小时、４８小时的ＢＫ通道活动的动态变化；（２）导致海马ＣＡｌ锥体神经元严重损伤的８分钟脑缺血再灌流后２４小时的ＢＫ通道活动特性；（３）３分钟脑缺血后３天再缺血８分钟后２４小时的ＢＫ通道活动特性。

以进一步阐明ＢＫ通道在脑缺血损伤中的作用并探讨ＢＫ通道在脑缺血耐受中的作用。

一１０－
材料与方法
一，主要溶液的配制
１，蔗糖溶液（１升）
蔗糖８０克
ＫＣｌ０．１８６克
Ｎａ２ＨＰ０４０．１４２克
ＣａＣｌ２０．０１４７克
ＨＥＰＥＳ３．５７４克
葡萄糖·１．９８２克
ｐＨ７．２～７．４ｗｉｔｈＮａＯＨ
用途：大鼠脑的冷冻，脑片的制备。

２，羟乙基磺酸钠液（１升）
羟乙基磺酸钠·
ＫＣｌ
ＣａＣｌ２·２Ｉ－１２０
ＭｇＣｌ２。

６Ｈ２０
ＨＥＰＥＳ＊
葡萄糖
ｐＨ
用途：脑片的清洗
３，Ｅａｒｌ’ｓ平衡盐溶液ＮａＨＣ０１
ＣａＣｌ２·２Ｈ２０
ＭｓＳ０４
ＫＣｌ
ＮａＣｌ
Ｎａ２ＨＰ０４
葡萄糖
酚红＋
１９．６克
０．１４９克
０．０１４７克
０．１８３克
３．５７４克
４．１４４克
７．２～７．４ｗｉｔｈＮａＧｌＨ
（Ｅａｒｌｅ’ＳＢａｌａｌｉｃｅＳａｌｉｎｅＳｏｌｕｔｉｏｎ．ＥＢＳＳ）
２．２克
０．２６５克
Ｏ．０９７６７克
０．４克
６．８克
０．１２２克
Ｉ．０克
Ｏ．０１１克
ｐＨ７．２～７．４ｗｉｔｈＮａＯＨ
用途：脑片的孵育
４，Ｈａｎｋ’Ｓ平衡盐溶液（Ｈａｎｋ’ＳＢａｌａｎｃｅＳａｌｉｎｅＳｏｌｕｔｉｏｎ、
ＫＣｌ０．４克
Ｋ２ＨＰ０４０．０６克
ＮａＣＩ８．０克
ＮａＨ２Ｐ０４Ｏ．０４７８８克
ＨＥＰＥＳ＋２．６克
ＭｇＣｌ２Ｏ．３８克
酚红＋Ｏ．０１１克
ｐＨ７．２～７．４ｗｉｔｈＮａＯＨ
用途：脑片的消化
５，高钾的细胞外液与电极内液
Ｇｌｕ—Ｋ＋１４０ｍｍ０１／Ｌ
ＮａＣｌ１０ｍｍ０１／Ｌ
ＨＥＰＥＳ＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ
ｐＨ７．２－－７．４ｗｉｔｈＫＯＨ
用途：所有实验的细胞膜的内外液
注：·表示试剂购于Ｓｉｇｍａ公司，其余试剂均为国产。

６，２ｐｍｏｌ／Ｌ钙离子浓度的配制
实验过程中通过加入Ｏ．５ｍｍｏｌ／ＬＥＧＴＡ于０．４８５ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２的于细胞外溶液中得到２ｐｍｏｌ／Ｌ的自由钙离子浓度．
二，前脑缺血模型的制各
成年雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠（第一军医大学动物中心提供），质量２００．２５０９。

采用改良的４血管夹闭方法进行短暂前脑缺血。

实验前一天，大鼠以水合氯醛麻醉（ｉｐ，４０ｍｇ／１００９），颈部正中切口，分离双侧颈总动脉约ｌｅｍ，然后大鼠固定在定位仪上，枕部皮肤切口，暴露第一颈椎及横突板上的
翼小孔，双极电凝针电凝双侧翼小孔内的锥动脉，缝合切１３后将动物置笼内饲养，夜间禁食。

以上方法制备的大鼠没有明显的脑损害，行为也如常。

实验当日，完全清醒的大鼠被抓住并用动脉夹造成４血管夹闭。

夹闭两侧颈动脉３ｍｉｎ造成短暂前脑预缺血模型（预缺血组）；夹闭两侧颈动脉８ｍｉｎ造成短暂严重前脑缺血模型（严重缺血组）：夹闭两侧颈动脉３ｍｉｎ后３天再夹闭两侧颈动脉８ｍｉｎ造成缺血耐受模型（缺血耐受组）。

大鼠在３０—６０秒内昏迷，翻正反射消失，双侧瞳孔放大，但能自主呼吸。

脑缺血后解除动脉夹，恢复脑血流。

假手术组只电凝锥动脉而不夹闭颈总动脉。

实验中保持大鼠体温３７．０＋０．５℃，未昏迷或缺血后有癫痫、抽搐等并发症的大鼠均放弃。

三，组织学观察
缺血再灌注７天后，大鼠经过量水合氯醛麻醉，开胸暴露心脏，直视下将穿刺针经左心室刺入主动脉。

先用生理盐水１００ｍｌ快速洗注，再灌注４％甲醛固定液５００ｍｌ。

开颅取脑，常规的脱水石蜡包埋并切片。

取背侧海马，厚度为６ｕｍ，Ｃｒｃｓｙｌｖｉｏｌｅｔ染色。

在Ｏｌｙｍｐｕｓ显微镜（４００倍）下计数海马ＣＡｌ区存活的锥体细胞数。

组织学鉴定分析和细胞计数由一无关人员进行。

每只大鼠海马ＣＡｌ区存活的细胞数由一张切片的左右两侧存活细胞的平均值（细胞数／ｒｎｍ线长度）来表示。

皱缩，胞浆空泡化的细胞被排除。

四，脑片的制备与神经元的急性分离
预缺血组大鼠在３分钟脑缺血后６小时、２４小时、４８小时；严重缺血组与缺血耐受组大鼠在缺血后２４小时；以水合氯醛麻醉（４０ｍｇ／ｌＯＯｇ，ｉｐ），快速断头取脑，于低钙缓冲液中切成４００１ａｍ厚脑片，缓冲液成分为（ｍｍｏｌ／Ｌ）：１４０ｓｏｄｉｕｍｉｓｅｔｈｉｏｎａｔｅ，２ＫＣＩ，４ＭｇＣｌ２，０．１ＣａＣｌ２，２３ｇｌｕｃｏｓｅ，１５ＨＥＰＥＳ．ｐＨ７．４（３００．３０５ｍＯｓｍ／Ｌ）。

脑片置于９５％０２＋５％Ｃ０２混合气的ＮａＨＣ０３一缓冲液的ＥＢＳＳ液中孵育１－６小时，此缓冲液成分为（ｍｍｏｌ／Ｌ）：１２６ＮａＣＩ，２．５ＫＣＩ，２ＣａＣｌ２，２ＭｇＣｌ２，２６ＮａＨＣＯｓ，１．２５ＮａＨ２Ｐ０４，
Ｉｐｙｒｕｖｉｃａｃｉｄ，０．００５Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，０．１Ｎ（Ｉ）一ｎｉｔｒｏ．Ｌ．ａｒｇｉｎｉｎｅ，１ｋｙｎｕｒｅｎｉｃａｃｉｄ．１０ｇｌｕｃｏｓｅ，（３００—３０５ｍＯｓｍ／Ｌ）。

ｌｍｏｌ／ＬＮａＯＨ滴定ｐＨ至７．４。

然后，在低钙的羟乙基磺酸钠缓冲液中分离海马ＣＡｌ区，放置于３３℃用１００％０２饱和的ＨＢＳＳ液中细菌蛋白酶（ＳｉｇｍａｐｒｏｔｅａｓｅｔｙｐｅＸＩＶｌ－１．５ｍｇ／ｍ１）消化３０—４５分钟，组织在低钙羟乙基磺酸钠缓冲液中洗涤３次并梯度吹打分散组织。

细胞悬液放置于倒置显微镜的浴槽中，细胞沉底贴壁后孵育液换成记录液即可进行记录。

五，单通道电流记录
１，膜片钳技术简介
１９７６年，德国的Ｎｅｈｅｒ和Ｓａｋｍａｎｎ发明了小片膜电压钳位技术（ＰａｔｃｈＣｌａｍｐ），简称膜片钳．１９８１年，Ｈａｍｉｌｌ，Ｎｅｈｅｒ等又对最早的膜片钳实验方法和电子线路作料较大改进，使方法更加成熟，成为今天广泛应用的实验技术。

膜片钳技术本质上也属于电压钳范畴，两者的区别关键在于实验膜电位固定的方法不同，电位固定的细胞膜面积不同，进而所研究的离子通道数目不同。

电压钳只研究整个细胞膜或一大块细胞膜所有离子通道的活动，而膜片钳则可研究一小片细胞膜上几个，甚至一个离子通道的活动。

膜片钳方法实现膜电位固定的关键布置是在玻璃微电极边缘与细胞膜之间形成高阻密封，其阻抗可达１０—１００Ｇｆ２（此密封是指微电极与细胞膜之间的电阻）。

由于此阻值如此之大，故基本上看作绝缘，其上的电流可看成零，因此，信噪比大大改善。

形成高阻密封的力主要后氢键、范得华力、盐键等。

此密封不仅电学上近乎绝缘，在机械上也是极牢固的。

又由于玻璃微电极尖端管径很小，其膜下的膜面积仅为１１．ｔｍ２，在这么小的面积上离予通道数量很少，一般只有一个，或几个通道。

经这一个或几个通道流出的离子量相对与整个细胞来讲可以忽略。

与就是说，电极下的离子对整个细胞膜的静息电位的影响可以忽略。

那么，只要保持电极内的电位不变，从而实现电位固定，膜片钳技术即是通过负反馈电子线路，向细胞内注入一与离子电流幅度相等，极性相反的电流，保持电极内电位不变，而达到电压牵制的目的。

注入电极内的
电流可测得，从而也知道了离子电流。

这样，便可研究单个通道的活动。

上述的形式称为为细胞贴附式（Ｃｅｌｌ，ａｔｔａｃｈｅｄ），在此基础上将电极拉开，使电极下的－ｄ，片膜与细胞的其余部分分离，且这部分膜的内面向浴槽溶液，这便是内面向外式（Ｉｎｓｉｄｅ．ｏｕｔ）。

另外还有外面向外式（Ｏｕｔｓｉｄｅ—ｏｕｔ）和全细胞式（Ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ）。

八十年代初发展起来的膜片钳技术，可以测得ｌｐＡ的电流灵敏度，具有１ｐ．ｍ空间分辨力及１０９ｓ时间分辨力，为从分子水平了解生物膜离子通道的开启和关闭动力学，离子选择性和通透性等膜信息提供了直接的手段。

２，单通道记录
本实验采用膜片钳技术的内面向外式。

在每次实验前均用记录浴槽内的溶液冲洗带有细胞的盏玻片，以洗去细胞上的其他成分，然后才将盖玻片放入盛有溶液的浴槽内。

实验所用的溶液的ｐＨ值均调到７．２￣７．４，并用孔径为０．２２９ｍ的纤维滤过膜过滤，以除去灰尘颗粒和细菌。

实验在室温下进行（２ｌ￣２３℃）。

记录用玻璃电极的制作，参照所述方法，硬质厚壁毛坯在垂直微电极拉制仪（日本ＮＡＩｕＳＨＩＧＥ）上分两到三步拉微电极，电极尖端直径约为ＩＢｍ，内灌电极液后，电阻为８－１２ＭＱ。

内插泛极化氯化银与膜片钳放大器探头相连。

单通道电流用ＣＥＺ．２３００型膜片钳放大器（ＣＥＺ．２３００，日本光电），放大器反馈电阻为５０Ｇｆｌ，低通滤波器滤波频率为３ｋＨｚ，经ＴＬ．１２５接口的１２５ｋＨｚＬａｂｍａｓｔｅｒＤＭＡ数据采集系统采集，将单通道资料采入计算机以备以后分析，采样频率为５ＫＨｚ。

通过倒置显微镜（ＯｌｙｍｐｉｃＩＸ７００）和微电极操纵器（ＮＡＲＩＳ—ＨＩＧＥＭＯ．２０３，日本）监视，驱动微电极接近细胞。

当微电极尖端刚刚碰到细胞时，稍加负压，高阻密封即刻形成。

实验中仅选用密封电阻大于５Ｇｆｌ的细胞．
当高阻密封形成后，即可通过改变电极内的电位而控制电极下的一小片细胞膜的跨膜电位，以此观察此小片膜上的离子通道电流随电压改变的变化。

膜片钳记录采用内面向外式，实验仅选用锥体细胞，依其形态特征易从背景细胞中分辨出来，记录电极阻抗８～１２Ｍｆｌ，封接阻抗大于５Ｇｆ２。

膜片的胞浆面孵育液成份为（ｍｍｏｌ／Ｌ）：Ｇｌｕ．Ｋ１４０，ＮａＣＩ１０，ＨＥＰＥＳ１０：实验过程中通过加入Ｏ．５ｍｍｏｌ／ＬＥＧＴＡ于０．４８５ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２的溶液中得到２９ｍｏｌ／Ｌ的自由钙离子浓度。

溶液ｐＨ值由Ｉｍｍｏｌ／ＬＫＯＨ调至７．４０。

电极液与孵育液相同，使膜两侧溶液对称。

为了在其他二价离子缺少的情况下便于封接的形成，电极液中加入Ｏ．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２。

３，单通道记录资料分析
用ＰＣＬＡＭＰ分析程序（８．０版，美国ＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）中的ＦＥＴＣＨＡＮ测量通道电流幅度与时程，以某电压下的单位电流值５０％作为标准以判断通道开放与关闭转换。

记录中可见通道的多级与单级开放，计算总开放概率。

总开放概率（ＮＰｏ）是根据公式ＮＰｏ＝∑｛ｔｌ＋２ｔ２＋３ｔ３＋…＋ｎｔ。

）计算，测量Ｏｍｓ．３０００ｍｓ的原始通道图＇Ｎ＝通道数目，Ｐｏ是开放概率，ｔｌ，ｔ２，ｔ３，ｔ。

，是每一级通道水平上每一个通道的开放时间与总时间的比值。

将测量获得的资料转入ｐＣＬＡＭＰ中的ｐＳＴＡＴ程序进行统计处理，如幅度分布直方图、开放和关闭时间直方图、高斯拟和、指数拟和等。

六，数据采集步骤
记录±６０、±４Ｄ、±２０ｍＹ钳制电位下通道的活动。

形成内面向外式膜片后通道可能处于失活（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）状态，通常有６０％的膜片未见有通道活动，超级化可以使通道从失活状态转为关闭状态。

因此，如果此膜片下有ＢＫ通道，持续给予超级化电位（－６０ｍＹ）是很有必要的，这样失活的ＢＫ通道通常在３分钟内开放。

超过３分钟未见开放则放弃。

去极化电位可以使ＢＫ通道激活（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）同时又可以使通道失活，因此，在记录．４０ｍＶ、－２０ｍＶ、２０ｎｌｖ、４０ｍＶ、６０ｍＶ电位下通道活动前，均持续给予超级化．６０ｍＶ电位１分钟以排除通道失活对开放概率的影响。

七，统计方法
所有实验数据均用平均数±标准误（ｍｅａｎ士ＳＥＭ）表示，统计方法采用单因素方差分析（Ｏｎｅ·ＷａｙＡＮＯＶＡ）法，方差齐同用Ｄｕｎｎｅｔｔ比较法，方差不齐用Ｔａｍｈａｎｅ比较法，Ｐ＜０．０５被认为差异有显著性意义。

Ｐａｔｃｈ数用ｎ表示。

结果
一，脑缺血耐受的组织学观察
各组大鼠海马ＣＡＩ区锥体神经元的密度改变如图ｌ。

１所示。

假手术组的ＣＡＩ区的锥体神经元密度是２８７±５．６／ｒａｍ（ｎ＝６）（图１．２）：３分钟前脑缺血不引起ＣＡＩ锥体神经元的损害（图１．３），平均细胞密度是２７１±２．２／ｍｍ（ｎ＝６）；８分钟前脑缺血能够导致ＣＡｌ区锥体神经元严重损害（图卜４），平均细胞密度是１２±５．０／ｒａｍ（ｎ＝６）；３分钟脑缺血后３天再缺血８分钟却不见明显的ＣＡｌ区锥体神经元的损害（图１－５），平均细胞密度是２５６±８．３／ｍｍ（ｎ＝６）。

上述结果表明８分钟前脑缺血可以导致９０％以上ＣＡｌ锥体神经元死亡；但是，如果先前有３分钟预缺血处理，８分钟前脑缺血只能引起大约１０％的锥体神经元死亡，３分钟脑预缺血的保护作用很明显。

二，ＢＫ通道的基本特性
本实验浴槽液和电极液中钾离子浓度均为１４０ｍｍｏｌ／Ｌ。

当细胞的内面向外式形成后，钾离子通道电流的翻转电位为０ｍＹ，电极下膜片的跨膜电位（ｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ）就等于膜片钳放大器输出的钳制电位（ｈｏｌｄｉｎｇｐｏｔｅｎｔｉａｌ）。

从翻转电位和电导弘７Ｊ很容易鉴别出ＢＫ通道。

通道活动具有明显的电压依赖性，随着钳制电压由超极化（－－６０ｍＶ）向去极化（＋６０ｍＶ）转换，ＢＫ通道开放概率逐渐增加；通道的电流的幅值随超级化或去极化程度加大而增大（图２－１Ａ），在同一钳制电压下，通道的电流幅值基本相同，呈波宽不等的矩形方波，其幅度分布直方图呈对称的单峰状，并能进行很好的高斯拟合。

电流－电压曲线里直线（图２－１Ｂ）。

通道的开放时间与关闭时间分布均呈指数分布，可进行二级指数拟合，图２－２为正
常对照组的海马ＣＡＩ区锥体细胞上的ＢＫ通道在超级化一６０ｍＶ的开放时间和关闭时间分布直方图，图上显示拟合的曲线和时间常数的拟合值。

Ｒ＝Ｉ－ＳＳＥＩＳＳ，Ｒ值＞Ｏ．９５说明和数据的实际情况很接近。

拟合后Ｒ值均在０．９５以上。

ＢＫ通道在活动过程中会出现失活现象（图２．３），由高开放概率突然转向低开放概率，失活发生的频率并不随胞内钙浓度和钳制电压的不同而改变幽Ｊ，推测可能是由于与ＢＫ通道相连的对胰蛋白酶敏感的内源性的微粒作用与ＢＫ通道的膜内侧端。

超级化可以使通道的失活状态转变为关闭状态。

因此，在记录通道活动前给予．６０ｍＶ超级化电压是很有必要的，可以最大限度的去除通道失活对开放概率的影响。

三，３分钟脑缺血后ＢＫ通道的变化
图３．１示为ＣＡＩ神经元缺血前，缺血后６小时，２４小时和４８小时的单通道电流的原始图。

不同组之间在相同的钳制电位下单通道电流的幅度没有明显的区别。

为了确定ＢＫ通道的电导和反转电位，我们测量了在不同钳制电位下单通道电流的幅度，单位电导是由直线回归的斜率确定的。

实验中所记录到的通道其特性与本实验室以前的报道相一致【２９－３０ｌ。

图３．２和表ｌ的数据很明显地表明ＢＫ通道的单位电导和反转电位，缺血后４８小时内与对照组相比无明显变化。

相反，如图３．１所示，在钳制电位为．６０ｍＶ，［ｃａ２＋】Ｉ为２９ｍｏｌ／Ｌ时，ＢＫ通道的活动在缺血再灌注后２４小时内明显低于对照组神经元，再灌注后４８小时回复到正常水平。

ＣＡＩ神经元缺血前、缺血后６小时，２４小时和４８小时的通道开放概率分别约为０．２３４－０．０５（ｎ＿ｌ３），０．０２８＋０．０１９（Ｐ（ｏ．０５，ｎ＝７），０．０５５士０．０２２（Ｐ＜ｏ．０５，ｎ＝１１），Ｏ．１１士０．０２５（Ｐ＞Ｏ．０５，ｎ＝ｌＯ）。

在不同膜电位上也可以看到相似的变化（图３．３）。

对膜片上可观察到的ＢＫ单通道活动进行动力学分析，在确定的膜电位和固定的【ｃａ２＋】ｉ，开放概率是由通道的开放、关闭时间和开放频率所决定的。

为了解哪一个因素对缺血后ＢＫ通道开放概率的下降影响最大，对正常组和缺血后各时间组的通道动力学进行比较。

对每组在．６０ｍＶ电位下ＢＫ通道的开放和关闭时间进行两级指数函数拟合。

表ｌ数据很。