生物脱硫催化剂的筛选

生物脱硫催化剂的筛选
沈齐英1　赵锁奇1　丁　媛2
(1.中国石油大学(北京)　2.北京石油化工学院)
摘　要　为了有效脱除石油及其产品中的有机硫,本实验采用复杂有机硫化合物为限制性底物的驯化方式,从被原油污染土壤中驯化、筛选,分离得到对有机硫具有一定脱除效果的菌株,鉴定为枯草芽孢杆菌亚种(Bacillus subtilis subs p.subtilis);以该菌株和白腐真菌作为出发菌株,通过原生质体融合获得具有双出发菌株性状、遗传稳定、可产生孢子和具有一定脱硫能力的融合子。

对成品油的脱硫实验可知:融合子可以直接应用于油品的脱硫,有较高的脱硫率,且有较大范围的环境耐受能力,有一定的实际应用价值。

关键词　原生质体融合　生物脱硫　成品油
石油及其产品中的硫几乎都是有机硫,燃烧时排放出的有毒气体会造成严重的空气污染;广泛使用的加氢脱硫技术成本较高,而且难以脱除石油燃料中的含硫杂环化合物;因此,迫切需要一种在较温和的条件下能进行脱硫的方法。

近年来,随着生物技术的发展以及石油炼制工业的不断复杂化和尖端化,采用生物技术脱硫越来越为人们所关注,其中生物催化剂的脱硫性能、遗传稳定性及环境耐受能力等是影响生物脱硫技术工业化的主要因素之一[1]。

1　实验材料与方法
1.1　实验材料
1.1.1　实验主要仪器
CL3010高效毛细管电泳液相色谱一体机(北京彩陆科学仪器有限公司)、LGR10-4.2型冷冻离心机(北京医用离心机厂)、SH-3600A电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)、不锈钢手提式灭菌器(上海申安医疗机械厂)、HZ Q-C恒温空气浴振荡器(哈尔滨市东明医疗仪器厂)。

1.1.2　实验主要试剂
溶菌酶、蜗牛酶(中科院上海生化所产品);青霉素、制霉菌素(美国Am resco公司产品,分析纯);聚乙二醇(6000)(上海化学试剂二厂,分析纯);二苯并噻吩、苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩、苯硫醚(ACROS公司产品,纯度均为99%);正十六烷(德国HALTER MANN公司产品,纯度99%);0#柴油、93#汽油(燕山石油化工公司炼油厂产品)。

其余试剂均为国产分析纯。

无机盐培养液:KH
2
P O40.5g、K2HP O40.5g、MgS O40.2g、CaCl20.1g、NaCl0.2g、MnS O4痕量、FeCl2痕量、NH4NO31.0g,加水定容至1000mL;
富集培养基、基本液体培养基、基本固体培养基、完全液体培养基、完全固体培养基、高渗再生选择培养基、原生质体稳定液[2]。

鉴别培养基如下:鉴别1=基本固体培养基+200u/mL青霉素(Penicillin,Pc);
鉴别2=基本固体培养基+200u/mL制霉菌素(Nystatin,N t);
鉴别3=基本固体培养基+200u/mL青霉素+ 200u/mL制霉菌素(Pc+N t)。

1.2　实验方法
1.2.1　脱硫微生物的驯化
5g菌源土壤充分溶于100mL生理盐水中,从中取出10mL菌悬液接种于80mL无机盐培养液中,无机盐培养液中加入原油溶解限制性底物10 mL(苯并噻吩0.1mmol/L、二苯并噻吩0.1mmol/ L、4,6-二甲基二苯并噻吩0.1mmol/L和苯硫醚
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石油与天然气化工
　第36卷　第3期 CHE M I C AL EN G I N EER I N G O F O I L&GAS
0.1mmol/L),120r/m in,28℃,振荡培养24h(1个周期);取振荡培养后菌悬液10mL加入上述相同90mL新鲜无机盐培养液中,120r/m in,28℃,振荡培养48h;如此重复10个周期(240h)。

1.2.2　菌种的琼脂平板分离和保存
驯化10个周期结束后,以无菌操作琼脂平板画线分离后,置于30℃恒温培养箱内培养,待琼脂平板长出孤立菌落后接种于斜面,4℃冰箱保存备用。

1.2.3　脱硫微生物的确定(菌种的脱硫实验)
菌种的活化富集培养:以无菌操作将冰箱保存的菌株接种于100mL活化富集培养基中,28℃、120 r/m in好氧振荡培养24h后,制备0.5g/mL(0.5g 湿菌体悬于1mL无机盐培养液中)菌悬液备用。

分别取浓度0.5g/mL菌悬液100mL,配制成含10%正十六烷溶解二苯并噻吩(DBT)2.72 mmol/L和5.44mmol/L,28℃、120r/m in好氧振荡培养12h和24h后,测定培养瓶内有机相中DBT 的含量。

测得的二苯并噻吩浓度越小,说明微生物脱硫效果越好,即为优势脱硫菌种[3,4]。

1.2.4　二苯并噻吩含量的测定
DBT的定量测定采用高效液相色谱法。

高效液相色谱仪的使用条件及方法:调节高效液相色谱检测波长为254n m,流动相为90%的甲醇水溶液,流速为1mL/m in,柱温为25℃,进样量20μL。

在使用条件下,测定各标准DBT溶液浓度对应的峰面积,由色谱工作站绘制成DBT浓度与对应峰面积的标准曲线,通过测定各样品中DBT的峰面积即可确定DBT的量[5]。

1.2.5　原生质体融合
出发菌株:以复杂有机硫化合物为限制性底物,从被原油污染菌源土壤中驯化、筛选,分离得到对有机硫具有一定脱除效果的菌株,经中国科学院微生物所鉴定为枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subs p.subtilis),以T L表示;白腐真菌由中国科学院微生物所提供。

活化出发菌株→制备原生质体→促融合→原生质体再生→检出融合子。

计算总菌数、剩余菌数,原生质体形成率、再生率、融合率。

凡是在再生选择培养基平板上丝状生长的菌落,将其接种到斜面培养基上冰箱保存[6,7]。

1.2.6　出发菌株和融合后丝状生长的菌株抗生素
抗性实验及其形态学比较
活化出发菌株和融合后丝状生长的菌株后,以鉴别培养基制成倾注平板后,置于32℃培养箱内培养观察,在鉴别1、鉴别2和鉴别3培养基内均呈丝状生长菌落可以认为是融合子,将其接种到斜面培养基上冰箱保存备用[8]。

1.2.7　融合子的筛选
融合子的活化富集培养:以无菌操作将冰箱保存的融合子接种于100mL活化富集培养基中, 28℃、120r/m in好氧振荡培养24h后,20℃、6000 r/m in离心分离收集菌体。

将菌体分别接种于含有10%正十六烷溶解DBT2.72mmol/L和5.44 mmol/L的100mL无机盐培养液中,28℃、120r/m in 好氧振荡培养12h和24h后,测定培养瓶内有机相中DBT的含量,测得的二苯并噻吩浓度越小,说明融合子脱硫效果越好。

1.2.8　融合子的增殖培养及稳定性检验
融合子的活化富集培养后离心分离收集菌体,取0.5g湿重融合子,接种于100mL富集培养基内28℃、120r/m in振荡培养24h;取此0.5g湿重融合子接种于100mL新鲜富集培养基内,相同条件振荡培养五个周期。

每一周期结束后检测融合子的脱硫能力(方法同融合子的筛选),观察脱硫稳定性[9]。

1.2.9　脱硫融合子对成品油中有机硫的脱除实验
脱硫融合子富集培养后离心收集菌体,将其分别加入100mL、含有15%93#汽油和0#柴油无机盐培养液中,120r/m in、28℃的条件下,分别以12h 和24h为周期,连续振荡培养三个周期(每周期结束后,培养液内重新加入富集培养后获得的菌体);三个周期结束后,测定其中有机相的总硫含量,再分别与脱硫前总硫含量进行比较,观察融合子对成品油中有机硫的脱除能力[10]
1.2.10　硫含量的测定
成品油中的总硫含量采用微库仑法测定。

微库仑仪操作条件:汽化段温度为600℃,燃烧段温度为800℃,稳定段温度700℃,氮气流量为
412生物脱硫催化剂的筛选 2007　
150mL /m in,氧气流量为150mL /m in,偏压E 为130
mV ,增益K 为1000,电阻R 为2k
Ω。

通过分析硫标准溶液,计算总硫的转化率,消除三氧化硫未参加反应带来的误差;对未知试样进行测定并进行计算后,可求得样品中硫含量。

2　实验结果与讨论
2.1　脱硫微生物的驯化、筛选和分离结果
本实验使用高效液相色谱仪获得的DBT 的浓度与吸收峰峰面积的关系绘制标准曲线见表1和图1。

通过驯化、筛选,分离出3株具有较好脱硫效果
的菌株,分别用T L -1、T L -2和T L -3表示,脱硫能力见表2;T L -1、T L -2和T L -3经中国科学院
微生物研究所鉴定为:Bacillus subtilis subs p.subtilis 枯草芽孢杆菌枯草亚种。

表1　DBT 的浓度与吸收峰峰面积的关系序号浓度,10-6峰面积序号浓度,10-6峰面积1755686907440028721069215010479485560042097638320014213763680056318618
DBT 的工作曲线方程为:Y =7.055e +0.04X ,
相关系数r =0.999912,线性范围为≤800×10-6
,线
性关系较好。

表2　脱硫菌株对含DBT 培养液的脱硫程度菌种
脱硫前DBT 浓度 脱硫12h 后 DBT 浓度脱硫率 脱硫24h 后
DBT 浓度脱硫率T L -1 2.72 1.82±0.002233.83 1.56±0.003142.65T L -2 2.72 2.27±0.003016.54 2.02±0.005425.73T L -3 2.72 1.42±0.005647.79 1.00±0.007963.24T L -1 5.44 4.00±0.002726.47 3.23±0.001740.63T L -2 5.44 4.27±0.003021.50 4.00±0.003826.47T L -3 5.44 3.47±0.006636.21 2.56±0.005652.94注:DBT 浓度mmol/L,脱硫率%;脱硫前后DBT 浓度比较均P <
0.01。

3菌株对含DBT 培养液的脱除程度见表2,表中数据以均值±标准差表示,样本数量n 为8,对脱硫后的DBT 量与处理前的DBT 量进行两两比较的T -test 。

p >0.05表示差别无统计学意义,p ≤0.05
表示差别有统计学意义,p ≤0.01表示差别有高度统计学意义。

从表2看出,3菌株对DBT 中的硫均有一定的脱除,其中T L -3脱硫效果最好;同时可以看出3菌株随着脱硫时间的延长,对硫的脱除能力逐渐增加。

2.2　出发菌株和融合子的抗生素抗性实验及其形
态学比较结果
出发菌株和经过稳定性检验的融合子的抗生素抗性实验及其形态学比较结果见表3。

表3　出发菌株和融合子的抗生素抗性及形态
项　目出　发　菌　株
T L -3白腐真菌
跨界融合子
鉴别1-++鉴别2+-+鉴别3--+丝状生长-++产生孢子-++
核-++
注:+表示在鉴别培养基琼脂平板上有生长且生长良好;-表示在鉴别培养基琼脂平板上不能生长。

白腐真菌与枯草芽孢杆菌通过原生质体融合获得具有双出发菌株的性状,遗传稳定,可产生孢子的融合子,以RH 表示。

2.3　融合子的筛选结果
表4　菌株对含DBT 培养液脱硫程度
菌株
脱硫前DBT 浓度 12h 后 DBT 浓度
脱硫率 24h 后
DBT 浓度脱硫率T L -3 2.72 1.42±0.005647.79 1.00±0.007963.24白腐真菌 2.72 2.71±0.00430 2.71±0.00430RH -1 2.72 1.58±0.003341.91 1.35±0.004150.36RH -2 2.72 1.46±0.002946.32 1.15±0.003757.72T L -3 5.44 3.47±0.006636.21 2.56±0.005652.94白腐真菌 5.44 5.46±0.00120 5.35±0.00280RH -1 5.44 3.59±0.004834.00 3.05±0.004143.93RH -2 5.44 3.46±0.002336.39 2.59±0.002452.39　注:DBT 浓度mmol/L,脱硫率%;脱硫前后DBT 浓度比较均P
<0.01。

出发菌株和融合子对DBT 的脱硫程度见表4。

从表4看出,RH -1和RH -2对DBT 中的硫均有
5
12 石油与天然气化工　第36卷　第3期 CHE M I C AL EN G I N EER I N G O F O I L &GAS
一定的脱除能力,同时可以看出随着脱硫时间的延长,RH-1和RH-2对硫的脱除能力逐渐增加;如果继续延长脱硫时间或加大生物量,脱硫效果可能更好。

通过筛选得到2株脱硫性能良好的融合子RH-1和RH-2,丝状生长、抗青霉素和制霉菌素,即具有双亲株性状和一定脱硫能力的杂合细胞。

2.4　融合子的稳定性检验结果
融合子(RH-1、RH-2)每一周期增殖培养后脱硫程度见表5。

表5　融合子的生长特性
菌种
脱硫前
DBT浓度
　一个周期后 二个周期后 三个周期后 四个周期后 五个周期后　DBT浓度降解率DBT浓度降解率DBT浓度降解率DBT浓度降解率DBT浓度降解率
RH-12.721.5642.651.5841.911.5144.481.6240.441.5642.65 RH-22.722.0225.732.0624.262.0225.732.0126.102.0524.63 RH-15.443.2340.633.1841.543.2540.253.2140.993.2839.70 RH-25.444.0026.474.1024.633.9826.844.0825.004.0226.10　注:DBT浓度mmol/L,降解率%;脱硫前与每一周期结束后DBT浓度比较均P>0.05。

从表5可以看出,经过多次传代的融合子具有
稳定的脱硫能力。

2.5　脱硫融合子对成品油中有机硫的脱除实验
RH-1和RH-2对成品油中有机硫的脱除能
力见表6和表7。

表6　12h、24h三周期柴油循环脱硫实验结果
菌种脱硫前总硫
浓度,ng/μL
12h总硫
浓度,ng/μL
12h
脱硫率
%
24h总硫
浓度,ng/μL
24h
脱硫率
%
RH-1129.75±0.008931.13±0.002976.0122.44±0.009682.71 RH-2129.75±0.009152.27±0.007859.7131.64±0.008575.61注:脱硫前后硫浓度比较均P<0.01。

表7　12h、24h三周期汽油循环脱硫实验结果
菌种脱硫前总硫浓度
ng/μL
12h总硫浓度
ng/μL
12h
脱硫率
%
24h总硫浓度
ng/μL
24h
脱硫率
%
RH1138.46±0.010935.73±0.004974.1927.56±0.007680.09 RH-2138.46±0.008872.00±0.009947.9939.66±0.007871.26注:脱硫前后硫浓度比较均P<0.01。

表6和表7显示,RH-1和RH-2在脱硫12h 和24h后均具有较高的脱硫效果,且24h脱硫效果明显好于12h;如果延长脱硫时间或增加微生物浓度脱硫效果可能会更好,表明经过原生质体融合得到的微生物可以直接应用于油品的脱硫。

汽油、柴油中含硫有机物种类较复杂,本实验使用的成品油未作任何处理,说明RH-1和RH-2能脱除多种含硫化合物中的硫,且有较大范围的环境耐受能力。

如果以24h为周期进行工业化脱硫生产,比其他工业生产而言,节约时间、能源等,具有一定的经济效益。

在实际生产中,若要满足更高的脱硫率要求,可继续加大微生物的浓度,但无限度的提高微生物浓度势必造成处理成本增加,可在反应器中设计较大的回流比可以有效解决这一问题,同时较大的回流比还可以解决一部分溶解氧的供应问题,降低能耗。

生物催化脱硫具有选择性高、副反应少、反应条件温和、设备简单、运行费用低、投资少、对燃料热值影响小和不造成二次污染等优点,逐渐成为令人瞩目的清洁石油燃料生产技术。

目前,生物脱硫技术已从实验室逐步走向实用阶段,具有广阔的市场前景和良好的经济效益[11～13]。

3　结　论
(1)本实验以被大港油田石油污染的土壤为菌源,通过驯化、筛选、分离得到的3株具有较高脱除有机硫能力的菌株,鉴定为枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subs p.subtilis);
(2)枯草芽孢杆菌通过与白腐真菌的原生质体融合,获得了具有双出发菌株性状,丝状生长,遗传稳定,可产生孢子,具有一定脱硫能力的融合子。

(3)融合子可以直接应用于油品的脱硫,具有较高的脱硫率,且有较大范围的环境耐受能力,有一
612生物脱硫催化剂的筛选 2007　
定的实际应用价值。

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收稿日期:2006-11-27
编　辑:杨　兰
(上接第202页)
Ce O2质量分数为1.5%时,异丁硫醇的转化率可达
到94.4%。

原因可能是改性后催化剂中强酸和强
酸比例增加,活性明显增加,从而使得异丁硫醇的转
化率增加,但是过量的Ce O
2
有可能阻塞分子筛孔
道,降低异丁硫醇的转化率。

所以Ce O
2
含量为
1.5%时可以取得较好的实验结果。

3　结　论
(1)Ce改性后HZS M-5的结晶度总体上呈下
降趋势,特别是氧化铈含量达到2.0%以后显著降
低,低于85%。

铈在HZS M-5分子筛表面有两种
存在形态:含量较低时,主要以无定形高分散态的形
式存在;含量较高时,生成结晶态的Ce O
2。

(2)稀土Ce浸渍处理引起了催化剂比表面积
的下降。

(3)随着Ce O
2
含量的增加,催化剂的酸强度由
弱酸逐渐向中强酸方向偏移,当Ce O
2
含量为2.5%
时,几乎没有弱酸的分布。

(4)催化剂上Ce负载量对异丁硫醇转化率有
较大影响。

随Ce负载量的增加,异丁硫醇转化率
先升高,达到极大值后开始降低。

Ce O
2
质量分数为
1.5%时,异丁硫醇的转化率可达到94.4%。

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收稿日期:2006-12-05
编　辑:杨　兰
712
石油与天然气化工
　第36卷　第3期 CHE M I C AL EN G I N EER I N G O F O I L&GAS
ray diffracti on(XRD),NH3-te mperature p r ogra m des or p ti on(NH3-TP D)and BET methods.Amount of Ce O2i m p regnated has an i m portant effect on its state of existing over HZS M-5zeolite catalyst.W hen the i m p regnated a mount is l o w,Ce O2exists only in a mor2 phous highly dis persed;with the increasing of Ce-i m2 p regnated a mount,a part of Ce O2is f ound t o be crystal state.BET s pecific surface area decreases while HZS M -5catalyst was modified by Ce.The i m p regnati on of Ce O2als o results in increasing of the acidity.The cracking desulfurizati on reacti on of is o-butyl mercap2 ti on over HZS M-5catalyst or Ce-modified HZS M-5zeolite catalyst was studied in the fixed-bed catalyt2 ic m icr o-react or.The results showed that Ce-modi2 fied HZS M-5catalyst enj oys higher mercap ti on con2 versi on,and there is a maxi m um conversi on of94.4% while the CeO2content is1.5%.
Keywords:ZS M-5zeolite catalyst,Ce O2, characterizati on,activity,is o-butyl mercap ti on
The Prepara ti on and Appli ca ti on of Nanom eter Pd/A l2O3Ca t a lyst
Tangbo Hejin(College of Engineer Technol ogy Shanghai Che m istry).CHE M I CAL EN GI N EER I N G O F O I L&G AS,VOL.36,NO.3,pp203～205,2007 (I SSN1007-3426,I N CH I N ES E)
Abstract:The Nanometer-Pd/A l2O3catalyst was p repared by A l2O3and Nanometer-palladiu m powder which was p r oduced by hydr ogen arc p las ma method.The catalytic activity and selectivity of the Nanometer-Pd/A l2O3catalyst in ref or mate hydr o2 genati on p r ocess were studied.The scanning electr on m icr oscopy(SE M)and trans m issi on electr on m icr o2 scope(TE M)indicated that the surface was ordering and honeycomb-like.There was no palladiu m in the interi or of A l2O3carrier of Nano meter Pd/A l2O3cata2 lyst,while the carrier interi or of shell-shaped Pd/ A l2O3p repared by i m p regnati on method had palla2 dium.I n contrast with i m p regnati on method shell Pd/ A l2O3catalyst,nanometer Pd/A l2O3catalyst showed higher catalytic activity and excellent selectivity in re2 for m ing hydr ogenati on test.
Keywords:nanometer Pd/A l2O3catalyst,refor2m ing hydr ogenati on
Advances i n Reacti on K i n eti c M odel on M olecul ar Sca le i n Petroleu m Processi n g
W ang Sheng,Ouyang Fusheng,W eng Huixin,et al (Petr oleum Pr ocessing Research Center,ECUST, Shanghai).CHE M I CAL EN GI N EER I N G O F O I L& G AS,VOL.36,NO.3,pp206～212,2007(ISSN1007 -3426,I N CH I N ESE)
Abstract:The establishment of reacti on kinetic models on molecular scale is very difficult f or many comp lex reacti on syste m s existing in petr oleum p r ocess2 ing.Recent devel opment in molecular kinetic model including the main research methods and typ ical a2 chieve ment was revie wed in this paper.Research of the kinetic model on molecular scale f or p redicting the yield,compositi on and p r operty of the p r oduct effec2 tively will be the trend.
Keywords:comp lex reacti on syste m s,reacti on kinetics,molecular scale,reacti on net w ork
Screen i n g of B i odesulfura ti on Ca t a lyst
Shen Q iying1,Zhao Suoqi1,D ingYuan2(1.China University of Petr oleum,Beijing;2.Depart m ent of Che m ical Engineering,Beijing I nstitute of Petr oche m i2 cal Technol ogy).CHE M I CAL EN GI N EER I N G O F O I L &G AS,VOL.36,NO.3,pp213～217,2007(I SSN 1007-3426,I N CH I N ESE)
Abstract:The m icr oorganis m of desulfurati on have been obtained that were fr om the polluted s oil by the oil thr ough the accli m atizati on-style of blended sulfur compound.It is bacillus subtilis subs p.with ba2 cillus subtilis subs p and white-r ot fungi,the p r ot o2 p last fusi on m icr oorganis m desulfurati on s pore was ob2 tained.The result of the m icr oorganis m gr owing test showed that fusi on m icr oorganis m can gr ow good under the conditi on of30℃,pH7and os motic p ressure10g/ L.And it can gr ow in pH3～11,under24g/L os motic p ressure.It has effective staying power f or changing envir on ment and has great actual value.
Keywords:bi odesulfurati on,p r ot op last fusi on, gr owth characteristic
D iscussi on on Test Run of Large-sca le Amm on i a
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Jun.2007,V ol.36,N o.3 CHE M I CAL EN GI N EER I N G O F O I L&G AS 。