薄层色谱法分析短链烷基糖苷

薄层色谱法分析短链烷基糖苷
付鹿;王万绪;杜志平;王天壮;刘晓英
【摘要】用薄层色谱法分析烷基糖苷APG-06,选出了最佳展开剂,并用高效液相色谱进行验证,对分离的组分进行核磁表征和分析,计算样品聚合度(n).结果表明,以氯仿/无水乙醇/氨水=9.5∶6.5∶0.5(v/v/v)作为展开剂的薄层色谱的分析结果与HPLC一致.分离的APG-06经核磁(1H NMR)计算得到聚合度为1.00,二苷～多苷的平均聚合度为3.47.薄层色谱的优点在于分离能力强,仪器简单,廉价,操作方便.%The short chain of alkyl polyglucosides ( APG-06) was separated and analyzed by the thin layer chromatography (TLC ). The optimum developer was chosen by the HPLC on a verification,1H NMR characterization and analysis of the separated components, the sample was calculated degree of polymerization. The results showed that mobile phase of
CHC13/CH3CH2OH /NH3OH (9. 5: 6. 5: 0. 5 ,v/v/v), and the result of TLC identified with HPLC. The alkyl monoglucoside can be separated,and the degree of polymerization is 1.00, and the alkyl polyglucosides is 3.47. The feature of good separating, easier operating, lower-cost make the TLC be convenient for chemical plants to purify the industrial grade APG.
【期刊名称】《应用化工》
【年(卷),期】2013(042)003
【总页数】5页(P561-564,571)
【关键词】表面活性剂;烷基糖苷;薄层色谱法;结构表征
【作者】付鹿;王万绪;杜志平;王天壮;刘晓英
【作者单位】中国日用化学工业研究院,山西太原030001;中国日用化学工业研究院,山西太原030001;中国日用化学工业研究院,山西太原030001;中国日用化学工
业研究院,山西太原030001;中国日用化学工业研究院,山西太原030001
【正文语种】中文
【中图分类】TQ423.2
烷基糖苷(APG)是由烷氧基取代糖上的羟基衍生而成的绿色表面活性剂。

在进行取代反应时，糖基上的各个羟基相互竞争，形成单、二、三糖苷以及高聚合度的糖苷［1-2］。

由于APG中α，β立体异构体、l，6键和1，4键异构体以及环的异构体的存在，决定了它是一种组成复杂的产品，因此不可能得到每一种组分的纯品［3］。

根据烷氧基链的不同，常将其分为长链APG和短链APG。

不同链长的APG性能略有不同，长链(C＞10)APG由于良好的润湿性和乳化性，低毒，可降
解性，已广泛用于餐洗和化妆品及个人护理用品方面;短链(C＜10)APG因其良好
的水溶性和耐强碱性，应用于硬表面清洗剂中。

近年来，人们对长链APG的研究较多，但是短链APG的报道则较少。

薄层色谱(TLC)法是20世纪50年代后期在纸色谱和柱层析的基础上发展起来的一种色层分析法，其优势在于操作简便、分离效率高、灵敏度高［4-5］。

本实验利用薄层色谱法，根据APG在薄层板上比移值的差异，将工业级APG-06分成残醇、烷基单苷、二苷～多苷以及残糖四大组分进行探讨，且所用材料价格低廉，减少了分析成本，便于普及。

1 实验部分
1.1 试剂与仪器
APG-06(74%)、APG-0810(50%)、APG-1214(50%)均为工业品;麦芽糖、羧甲基纤维素钠、薄层层析硅胶G均为化学纯;葡萄糖、三氯甲烷、无水乙醇、无水甲醇、氨水均为分析纯。

P230高效液相色谱仪;DAD230+二极管阵列检测器;SCIENTZ-18N冷冻干燥
机;DPX-400型氢-核磁共振仪 (内标TMS)。

1.2 薄层色谱条件
采用湿法制板。

将硅胶G与CMC-Na溶液按比例在研钵中调成糊状，朝一个方向充分研磨，以赶走硅胶中的气泡。

将研好的硅胶平铺在玻璃板(10 cm×20
cm×0.25 mm)上，硅胶厚度约0.2 mm，自然振荡，放于平台处，室温下自然晾干。

将未经任何处理的APG-06用氯仿/无水乙醇以3∶1(v/v)溶解，配制成7%
溶液。

作为对照，将APG-0810、APG-1214用同样溶剂分别配制成7% 氯仿/无水乙醇溶液。

点样前，用铅笔在距硅胶板一端2 cm处标记等距且在一条直线上的三个点，然后将APG-06、APG-0810、APG-1214分别点于三个点上，点样量
15 μL为宜。

将板的一端直立放于展开缸中，展开剂由于毛细现象沿着分析板上升，当试剂上升至距板的另一端1～2 cm时取出，用铅笔迅速标出溶剂前沿。

待硅胶
板上的展开剂完全挥发后，将其放入碘蒸气缸中显色，此时碘蒸气被选择性的吸附在APG的各个组分上，约30 min后显色结束。

将板取出，用铅笔标记各点，计
算不同展开体系的比移值(Rf)，选出最佳展开剂。

1.3 APG-06组分的分离
将研好的硅胶平铺在玻璃板(20 cm ×20 cm×0.25 mm)上，硅胶厚度约1.5 mm，制得薄层色谱制备板。

在距硅胶板一端2 cm处标记一条直线，在直线上进行带状点样，每次上样量约600 μL。

在距板两侧1 cm处各点一个样点，上样量为15
μL，作为样品显色的参照。

将制备板以最佳展开剂展开并晾干，将样品带封严，
只让参照点在碘蒸气缸中显色。

显色后将每条携带不同化合物的色带从板上分别刮下，并用氯仿/甲醇=3∶1(v/v)萃取、洗涤，过滤固定相，得到滤液，溶剂用水浴蒸干，在冷阱温度－80℃，真空度14 Pa的冷冻干燥箱中除去溶剂。

1.4 1H NMR 条件
内标物为四甲基硅烷，溶剂为氘代水，对制备板制得的样品进行表征，计算样品聚合度(n)。

1.5 高效液相色谱(HPLC)条件
分析色谱:hypersilbds C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温35 ℃，流动相为 CH3OH-H2O(1∶1，v/v)，流速 0.9 mL/min，进样量20 μL。

配制1‰ APG-06/甲醇-水(甲醇/水=1∶1，v/v)溶液，采用加标法分别向APG-06溶液中加入1%葡萄糖-甲醇、1%麦芽糖-甲醇溶液、10%对甲苯磺酸钠-甲醇溶液 (pH=11.7)以及1‰ APG-06单苷-氯仿/无水甲醇溶液(单苷由薄层色谱制备板制得)、正己醇各1 mL，并与APG-06的原样谱图进行对比，观察各组分加入后峰面积的变化。

1.6 薄层色谱最低检出量
分别将 0.5，1，3，5，15 μL 的 APG-06 溶液点于同一张分析板上，置于展开缸中展开，显色，找出能显色的最低检出量。

2 结果与讨论
2.1 展开剂的选择
展开剂的选择是各组分能否分离的关键。

理想的分离是指所有组分区带的Rf值在0.2～0.8之间，组分区带清晰集中以达最佳分离度［6］。

Rf是指在某种组分移动的距离与流动相移动的距离之比。

可表示为Rf=L/L0，L0表示溶剂前沿与原点的距离，L表示某组分斑点与原点的距离［7］。

常用有机溶剂的极性为:异丙醇＜氯仿＜乙醇＜乙酸乙酯＜甲醇/丙酮＜乙酸＜水［8］。

实验围绕乙酸乙酯，将乙酸乙酯/异丙醇=13∶2(v/v，以下均为体积比)、乙酸乙酯/甲醇=13∶2、乙酸乙酯/甲醇=14∶2、乙酸乙酯/甲醇/冰醋酸=13∶2∶1作为
展开剂，将硅胶板上斑点的个数及Rf值进行对比，发现乙酸乙酯体系显色后斑点
较少，说明APG中的各组分没有很好的分离。

围绕异丙醇［9］，将异丙醇/冰醋酸/无水甲醇=10∶0.5∶1、异丙醇/氨水/水
=6∶2∶1 作为展开剂，发现两种展开剂的分离时间都较长，约12 h，但氨水的加入能够明显增加分离效果。

为缩短分离时间，尝试了异丙醇/氨水/水=10∶0.5∶1、异丙醇/氨水/水=10∶0.4∶1 两种展开体系，发现异丙醇/氨水/水=10∶0.5∶1 的分离效果与异丙醇/氨水/水=6∶2∶1的分离效果相似，但分离时间明显缩短(约6 h)。

异丙醇体系的分离时间过长，主要是异丙醇的粘度相对较大，导致展开速度较慢。

由于氨水能够增加分离效果，同时考虑到氯仿对APG良好的溶解性，因此选择氯仿、无水乙醇作为展开剂，尝试不同比例后发现氯仿/无水乙醇/氨水
=9.5∶6.5∶0.5 的展开时间大约90 min，Rf在0.2～0.8之间，展开效果良好。

因此选择氯仿/无水乙醇/氨水作为最佳展开剂。

不同展开体系的Rf值见表1。

表1 不同展开剂的Rf值Table 1 The Rfvalues of different developing solvent 注:Rfi中i为每种展开剂分离后薄层板显色的斑点个数。

APG-06 APG-0810
APG-1214乙酸乙酯/异丙醇=13∶2 Rf1=0.53 Rf1=0.57 Rf1展开剂
(v/v/v)=0.05=0.59乙酸乙酯/无水甲醇=13∶2 Rf1=0.52 Rf1=0.55 Rf1=0.57
异丙醇/冰醋酸/无水甲醇=10∶0.5∶1 Rf1=0.42 Rf1=0.45 Rf1=0.46 Rf2=0.16 Rf2=0.19 Rf2=0.21 Rf3=0.077 Rf3=0.10 Rf3=0.11异丙醇/氨水/水=6∶2∶1
Rf1=0.68 Rf1=0.70 Rf1=0.72 Rf2=0.58 Rf2=0.62 Rf2=0.68 Rf3=0.51
Rf3=0.55 Rf3=0.57异丙醇/氨水/水=10∶0.5∶1 Rf1=0.54 Rf1=0.55 Rf1=0.61 Rf2=0.24 Rf2=0.26 Rf2=0.30 Rf3=0.13 Rf3=0.13 Rf3=0.15异丙醇/氨水/水
=10∶0.4∶1 Rf1=0.37 Rf1=0.38 Rf1=0.41 Rf2=0.15 Rf2=0.15 Rf2=0.17
Rf3=0.13 Rf3=0.14 Rf3=0.17 Rf4=0.07 Rf4=0.08 Rf4=0.10氯仿/无水乙醇/氨水=9.5∶6.5∶0.5 Rf1=0.75 Rf1=0.79 Rf1=0.81 Rf2=0.66 Rf2=0.71 Rf2=0.72 Rf3=0.46 Rf3=0.47 Rf3=0.49 Rf4=0.34 Rf4=0.35 Rf4=0.35 Rf5=0.26
Rf5=0.27 Rf5=0.27 Rf6=0.21 Rf6=0.22 Rf6=0.24 Rf7=0.05 Rf7=0.06 Rf7
2.2 APG-06的组分分析
图1 是以氯仿/无水乙醇/氨水=9.5∶6.5∶0.5作为展开剂，经碘蒸气显色30 min 后的薄层色谱图片。

图1 氯仿/无水乙醇/氨水作为展开剂不同碳链APG的薄层色谱图片Fig.1 The picture of different carbon chain lengths of APG on TLC plate with the mobile phase of CHCl3/CH3CH2OH/NH3OH
由图1可知，随着C6～C12极性的降低，Rf值升高。

这是由于化合物的分离是固定相的吸附和洗脱剂对于化合物的洗脱两者之间竞争的结果。

以硅胶作为固定相时，硅胶是极性的，试样中极性更强的组分对于硅胶的结合力更强，可抵抗流动相将其从原点带走，而极性更低的组分吸附到硅胶上的效果不好，容易被流动相向上带走，所以具有更高的Rf值［10］。

由于残醇的极性最小，可以肯定在试剂前沿处的斑点是残醇，而未反应的多糖由于多—OH的存在，极性最大［11］，所以组分3
为未反应的残糖。

根据Rf的大小将APG中各组分分成四个部分——残醇、组分1、组分2、残糖。

组分1的斑点最大，颜色最深，说明在烷基糖苷中该部分所占
比例最高。

由于组分1、组分2是APG的有效成分，因此对组分1，2进行研究。

2.3 APG-06 的1H NMR 解析
以氯仿/无水乙醇/氨水=9.5∶6.5∶0.5 作为展开剂，将制备板分离制得的组分1、组分2进行1H NMR表征，见图2。

由图2可知，组分 1中δ(×10－6)在0.850～1.598有3 处吸收，即 0.850(s，—
CH3，3H)，1.279(s，—(CH2)3—，6H)，1.598(s，—CH2—，2H)，总积分高
度为10.91，该区间为—R基的特征区，此处应为CH3(CH2)3—的特征化学位移区;在3.382～4.450区间有多处吸收，并有分裂峰产生，峰形为宽区间，总积分高度为12.99，代表糖基上的H以及烷基与糖苷键的氧原子相连的亚甲基上的两个H，因此糖环上的积分为10.99。

组分2中δ在0.850～1.597范围内，有3处吸收，即 0.850(s，—CH3，3H)，1.280(s，—(CH2)3—，6H)，1.597(s，—CH2—，2H)，总积分高度为 10.99，δ在 3.538 ～4.477范围内，H 的积分为40.09，代表糖基上的H以及烷基与糖
苷键的氧原子相连的亚甲基上的两个H，因此，糖基上H的实际积分应为38.09。

理论上，C6烷基糖苷上的H与烷基链上的氢个数比应为(11n+2)∶11［12-13］，计算得到组分1聚合度为 1.00，组分2的聚合度为3.47。

因此可断定组分1为不同构型的单苷，但是组分2中至少含有3种成分，因此推断组分2是二苷、三苷、四苷以及多苷的混合物。

图2 组分1、组分2的1H NMRFig.2 1H NMR spectroscopy of the component 1 and 2 on the silica TLC plate
2.4 HPLC液相分析
为验证薄层色谱的正确性，利用HPLC对APG-06进行分析。

向APG-06溶液中
加入麦芽糖、葡萄糖溶液使峰2、峰3加强，结果见图3。

由图3可知，烷基单苷的加入，使得13～17峰得到加强，其他的峰几乎不变，可以确定13～17峰是不同构型的单苷;正己醇的加入，使峰18加强。

考虑到APG
在生产过程中将对甲苯磺酸钠作催化剂［14］。

因此，向溶液中加入对甲苯磺酸钠，发现峰1明显加强。

将HPLC与薄层色谱对比后，发现两者的结果一致，验
证了薄层色谱的正确性。

图3 APG-06的高效液相和薄层色谱对比图Fig.3 HPLC and TLC-sheet picture
of APG-06，each peak of HPLC corresponded to each spot of APG-06 on TLC峰1:对甲苯磺酸钠;峰2:麦芽糖;峰3:葡萄糖;峰4～9:烷基多苷;峰10～12:烷基四苷，三苷，二苷峰的混合物;峰 13 ～17:不同构型的烷基单苷(α，β-吡喃单苷，α，β-呋喃单苷);峰18:正己醇
2.5 最低检出量
将0.5，1，3，5，15 μL 的 APG-06 溶液点于同一张分析板上，置于展开缸中展开、显色，发现点样量为1 μL时即可显色，计算后得到薄层色谱的最低检出量为0.15 μg。

3 结论
(1)用TLC分析APG-06，得到最佳展开剂为氯仿/无水乙醇/氨水=9.5∶6.5∶0.5，HPLC 验证了薄层色谱的正确性。

(2)1H NMR表明，烷基单苷的聚合度与理论值相同，且单苷可完全分离。

(3)薄层色谱的优势在于快速、简便，所用试剂常见，成本较低，便于工业普及。

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