中草药来源的Ⅰ类HDAC抑制剂筛选

天然产物研究与开发！2018,30:1099-1104
文章编号：1〇〇1'880(2018)7-1099'6
中草药来源的I类HDAC抑制剂筛选
姚晓辉，黎欢，胡阳亮，胡英杰，符林春，沈小
广州中医药大学热带医学研究所中药新药发现实验室，广州，510405
摘要:为从中药来源的化合物中筛选I类组蛋白去乙酰化酶（H D A C)抑制剂，采用H D A C抑制剂筛选试剂盒
从60个化合物中筛选出对H D A C活性抑制作用较强的化合物，再用H D A C3/8抑制剂筛选试剂盒进一步评价
其H)A C抑制，同时W estern-blot法检测其对人宫颈癌细胞株（HeLa) I类H D A C表达的影响。

结果显示：血根
碱、胡椒碱、异甘草素、丹酚酸C g H D A C抑制活性较强;异甘草素和异甘草苷显著抑制H D A C3/8活性;血根碱
对H0a细胞有明显的增殖抑制作用，对I类H D A C的表达有明显的抑制作用。

本研究提示血根碱、异甘草素
和异甘草苷是I类H D A C的抑制剂，其中血根碱值得进一步深人研究。

关键词：I类H D A C抑制剂筛选;天然化合物;血根碱;异甘草素;异甘草苷
中图分类号：R965.1 文献标识码：A D0I： 10. 16333/j. 1001 -6880.2018. 7. 001
Screening of Class I HDAC Inhibitors from Traditional Chinese Medicine
Y A0X ia o-liu i，LI H u a n，H U Y a n g-lia n g，H U Y i n g-ji e，FU L in-c h u n，SH E N X ia o-lin g!
Laboratory o f New Herbal Drug Discovery，Tropical Medicine Institute，
Guangzhou University o f Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China
A b stra ct: To screen class I HDAC inhibitors of natural origin，in total 60 compounds from traditional Chinese medicine
were evaluated the HDAC inhibitory effect by employment of HDAC inhibitor screening kits. Compounds exhibiting high­
er activity to inhibit HDAC were furtlier investigated the effect on inhibiting HDAC3/8 activity by using hibitor screening kits，and the effect on protein expression of class I HDACs in HeLa cells by Western-blotting. It was
found that，Sanguinarine，Pipeline，Isoliquiritigenin，Isoliquiritin，Salvianolic acid C were more active than others to inhib­
it HDAC activity； Isoli(\uiritigenin and Isolicjuiritin significantly inhibited H DAC3/8 activity % In addition，Sanguinarine
strongly inhibited cell proliferation and c ellular expression of class I HDACs in HeLa cells. 0ur results showed that
Isoliquiritigenin，Isoliquiritin and Sanguinarine are potential inhibitors of class I HDACs. Among them Sanguinarine is
worth further studying.
K ey w ords ： screening of Class I HDAC inhibitors ； natural compounds ； sanguinarine ； isolicquiritigenin ； isolicjuiritin
组蛋白乙酰化与去乙酰化过程由功能相互措抗 的组蛋白乙酰化酶（Histone Acetyltransferase，HAT)[1]和组蛋白去乙酰化酶（Histone Deacetylase，HDAC)[2]共同调控[3]。

目前，哺乳动物体内已发现 18种HDAC亚型，分为四类：I类HDAC(HDAC1、HDAC2、HDAC3 和 HDAC8[4])、"类 HDAC( " a类 HDAC：HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9[5]；"b 类 HDAC:HDAC6、HDAC10 [6])、#类 HDAC(SIRT1 ~7[7])和$类只0入匸（只0入01[8])。

HDAC参与 调控基因转录，在细胞增殖、凋亡和分化等生命历程 中发挥着重要作用[9，10]，与肿瘤、炎症等疾病的发生
收稿日期:2018-04-23 接受日期"2018-05-23
基金项目：国家重大科技专项（2014ZX10005002)
!通信作者Tel :86-20-36585456 ； E-mail :xshen2@gzucm‘ edu. cn 发展密切相关，已成为癌症和炎症相关研究的热门 生物学靶标[11—13]。

中药中含有大量天然化合物[14，15]，以HDAC为 靶点开发天然HDAC抑制剂具有广阔的前景。

本 文以体外HDAC抑制活性为药理学指标，对中药来 源的60个化合物进行HDAC抑制活性评价，并探索 其对HeLa细胞中I类HDAC蛋白表达的影响，以期发现天然的高效低毒的I类HDAC抑制剂。

1材料与方法
1.1药物和试剂
60个中药来源的化合物购买于宝鸡市辰光生 物科技有限公司和南京春秋生物工程有限公司，用 DMS0溶解制成20 mM浓度储备液备用；HDAC 抑
1100天然产物研究与开发Vol.30
制剂筛选试剂盒、H D A C3抑制剂筛选试剂盒和
H D A C8抑制剂筛选试剂盒（B i o i s i o，美国，货号依 次为K340-100、K363-100、K348-100);B C A蛋白浓 度测定试剂盒、R I P A裂解液（强）（上海碧云天生物 科技有限公司，中国，货号分别为P0010、P1003B);细胞计数试剂盒（C C K-8)(D J i n d o，日本，货号货号
C K-04);胰酶、R P M I 1640培养基（B I，以色列，货号 分别为03-050-1 A C S、01-100-1 A C S);南美来源G ib-
>胎牛血清（Life T e c h n o lo g ie s公司，美国，货号 10270-106);P V D F膜（M i l i p o e，德国）&
1.2细胞培养
人宫颈癌细胞株(H e L a)由香港浸会大学提供。

H e L a细胞用含有10%胎牛血清的R P M I 1640培养 液培养。

培养环境:37°C，5%C〇2。

取对数生长期 的细胞进行实验。

1.3主要抗体
A n ti-H D A C1 抗体（货号 3601-30)和A n ti-H D A C2抗体（货号3062-30)购自美国
B io v is io n公司；A n ti-
H D A C3抗体（货号a132369)、A n ti-H D A C8抗体（货 号a b187139)、羊抗鼠Ig G H e L(H R P)抗体（货号
a b97040)和羊抗兔IgG H e L(H R P)抗体（货号 a16721)购自美国A B c c m公司；A n t i-G A P D H抗体 (货号T A-08)和A n t i-'-a c t i n抗体（货号T A-09)购 自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1?主要仪器
Synergy H T多功能酶标仪（B i o T e k公司，美 国）；B io-r a d垂直电泳仪（B i o-r a d公司，美国）；C02
细胞培养箱（上海力申科技仪器有限公司，中国）；垂直流超净台（上海智城分析仪器制造有限公司，中国）；倒置光学显微镜（O L Y M P U S，日本h C-D i G i 化学发光成像仪（L i-C o i•公司，美国）。

1.5H D A C与H D A C3/8抑制剂筛选
基于荧光的H D A C抑制剂筛选试剂盒工作原 理在于，本试剂盒所含H D A C底物含有一条乙酰化 赖氨酸侧链，被H D A C去乙酰化后的底物可以和赖 氨酸D evelopei•反应产生荧光团从而被检测到。

荧 光的强弱反映H D A C活性。

H D A C抑制剂存在下产 生的荧光越弱，则说明H D A C抑制剂对H D A C活性 的抑制能力越强。

1.5.1采用H D A C抑制剂筛选试剂盒进行的筛选 实验:将试剂盒和样品储备液平衡至室温，低速离心 1 m in，用蒸馏水将测试样品储备液稀释至200%M (2x工作液）。

根据说明书操作，在96孔板中分别加入含测试化合物或试剂盒提供的阳性药物曲古抑 菌素A(TSA)的工作液50 %L，含有HDAC(HeLa的核提取物）和底物的反应液50 %L，小心混勻。

实验 同时设置无药物的阴性对照组。

将板用膜封口后，置于37 C培养箱中反应45 min。

再加入10 %L的赖氨酸Developei•终止反应，37 C显色30 min后酶 标仪检测荧光强度。

设定阳性对照= 100%，计算待测样品对ffl)A C活性的抑制率％ = ((F@阳性样品阳性）x100C。

本实验每组设置两个复孔，实验结果以“平均值+( G±*表示。

1.5.2采用HDAC3/8抑制剂筛选试剂盒进行的 筛选实验:将试剂盒和样品储备液平衡至室温，低速 离心1min，用Buffet•配置将样品储备液稀释至好需 要浓度(4 X工作液）。

原理同前，根据说明书操作，酶标仪检测荧光强度，（=、（、（je分别代表空白孔、样品孔或阳性对照孔、酶对照孔。

设定&RFU EC = 100%，计算待测样品存在下HDAC3/8的抑制率％= ((j C-()/((j C-(c)X100%。

筛选得到抑制 活性较明显的样品进行细胞实验。

本实验每组设置 三个复孔，实验结果以“平均值±标准差+( G±*表 示。

本实验试剂盒提供的阳性药物为SAHA和TSA。

1.6CCK-8法检测细胞增殖实验
胰酶消化收集对数生长期的HeLa细胞，用生 长培养基配成5 x104个/m L的单细胞悬液，按100 %L/孔接种于96孔培养板，置于37 C 5%C〇2细胞 培养箱中培养24 h后，将培养基更换为含有不同浓 度测试药物或阳性对照药物SAHA的新鲜培养液。

个药物组 别设 的 5 个 ，个
设3个复孔。

实验设置无细胞的空白孔和无药物的 细胞对照组。

将96孔板置于培养箱继续培养48 h 后取出，吸出旧培养基，每孔加入100%L含10% CCK-8的新培养基。

按CCK-8使用说明将板置于 培养箱继续培养2h左右后取出，于酶标仪检测在 450 nm 的 收 A。

计 同药物作用下的 细胞活力％ [细胞活力％=(L药物-L空白）/(L对照- L空白）x100%]。

实验重复三次，实验结果以“平均 值±标准差+( G±S )表亦。

1.7Westem-B l o t法检测药物对HeLa细胞I类HDAC蛋白表达的影响
将Hela细胞接种于10 cm培养皿24 h后，更换 培养 为 有 同测试药物的新 培养 后，继续培养24 h。

采用RIPA裂解液裂解细胞提取总 蛋白，根据BCA 蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定
Vol . 30姚晓辉等:中草药来源的I 类HDAC 抑制剂筛选
1101
Biovisio 公司的HDAC 抑制剂筛选试剂盒所用 的HDAC 为从HeLa 核提取物，是一个混合物，包含 各种亚型的HDAC ,但其成分比例未知。

因此我们 采用该试剂盒对60个中药来源的化合物进行 HDAC 抑制活性初步筛选，并和HDAC 抑制剂TSA 进行比较，结果见表1。

发现在100
工作浓度
下，血根碱、胡椒碱、异甘草素、和丹酚酸C g HDAC 活性的抑制作用最明显，抑制率分别53. 1C 、 53. 1%、52. 7%和51. 0%;其次为异槲皮苷 (45. 1C )，异甘草苷（44. 7% )，盐酸小檗碱 (40. 0% )，丹酚酸 A (37. 7% )，箭藿苷 A (35. 6% )， 抑制率在35%以上。

这些化合物的HDAC 抑制活 性都较TSA 弱，TSA 在20 时对HDAC 活性的抑
制率为73. 3%。

表1
60个化合物对ffl)A C 活性的抑制率（％ )(； =2)
Table 1
Inhibitory effect of 60 compounds on HDAC activity ( %) ( ; = 2)
化合物
Compounds
抑制
Inhibitory rate
(%)化合物
Compounds
抑制
Inhibitory rate
(%)大黄素Emodin 22.0人参阜苷 Rc Ginsenoside Rc 13.9大黄酸Rhein 29.7人参阜苷 Rd Ginsenoside Rd 12.7丹参素Danshensu 19.9人参阜苷 Re Ginsenoside Re 7.7丹参酮 I Tanshinone I 7.4人 苷 RfGins0nosid0Rf 6.8丹参酮 IIATanshinone IIA 4.4人 苷 Rg1 Gins0nosid0Rg113.8丹酚酸 ASalvianolic acid A 37.7人 苷 Rg2 Gins0nosid0Rg2-丹酚酸 BSalvianolic acid B 29.1人 苷 Rg3 Gins0nosid0Rg3
-丹酚酸 CSalvianolic acid C 51.0人 Rh1 Gins0nosid0Rh123.7隐丹参丽 Cryptotanshinone
7.1人 Rh2 Gins0nosid0Rh213.0酸 Pa>hymi>a>id -人
Rh3 Gins0nosid0Rh3
10.2甘草查而丽A L icohalcn e A 30.3人参阜苷 RMGinsenoside RO 14.3甘草次酸Enoxolone -乙酿乌头喊Acetylaconitine 20.9甘草苷 Liquiritin 16.5苯甲醜乌头原减Benzoylaconine 24.5甘草素 Liquiritigenin
21.4苯甲酰新乌头原碱Benzoylmesaconine 30.9甘草酸鞍 Glycyrrhizic acid ammonium salt
7.0次
Hypaconitin0
-苷 Isoliquiritin
44.7去甲乌药减Higenamine
10.0异甘草素 Isoliquiritigenin 52.7Aconitin0
22.4白
Resveratrol
22.0原 Aconin0
23.3苷 Plydatin 25.9新乌头喊Mesaconitine
-汉黄菩苷Fogonoside 17.6Indaconiton0
18.3汉黄苳素Fogonin
26.2宝蕾苷 I Baohuoside I 14.2Phelodendrine>hloride 18.3朝蕾定 AEpimedin A 34.2Bai>alin 30.7朝藿定 BEpimedin B 16.5Bai>alein
30.3
刺芒柄花素Formononetin
0.6
量。

取30 %;蛋白样品进行10% SDS-PAGE 凝胶电 泳。

100V 转膜。

将PVDF 膜用5%脱脂奶粉室温封 闭后，加入用5%脱脂奶粉-TBST 稀释的一抗，4 °C 摇床孵育过夜。

抗体稀释倍数:anti -HDAC 1和anti - HDAC 2 为 1: 1 000，anti -HDAC 3 为 1: 5 000，anti - HDAC8 为 1:50 000，anti-'-actin 和 anti-GAPDH 为 1 :10 000。

TBST 洗膜3次，加入用3%脱脂奶粉- TBST 稀释的二抗（HRP 山羊抗兔:1: 10 000;HRP 山羊抗鼠:1: 20 000)，室温摇床孵育1 h 。

TBST 洗 膜3次，采用化学发光液进行蛋白显影，C -D i i 化 学发光成像仪记录图像。

2
实验结果
2
.1
采用HDAC 抑制剂筛选试剂盒初步筛选的结果
1102天然产物研究与开发Vo1.30续表 1 ( Continued Tab. 1)
化合物Compounds
抑制
InhibitorYrate
化合物
Compounds
抑制
InhibitorYrate
(%)
盐酸小藥喊Berberine chloride hydrate40.0水合淫羊蕾素Oxypeucedanin hydrate-血根碱Sanguinarine53.1胡椒碱Piperine53.1野黄菩苷Scutellarin32.8箭蕾苷 ASagittatoside A35.6人参阜苷 Lbl Ginsenoside Rbl 6.7箭蕾苷 BSagittatoside B32.2人参阜苷 Lb2 Ginsenoside Rb2-淫羊AnhYdroicaritin9.1人参阜苷 Rb3 Ginsenoside Rb314.6异樹皮苷Isoquercitrin45.1 TSA (20 %M)73.3
注:-，未检测出抑制活性。

Note：-,No inhibitory activity detected.
2.2采用HDAC3/8抑制剂筛选试剂盒进一步筛 选的结果
本研究采用的HDAC抑制剂筛选试剂盒，其 H D AC来自于HeLa细胞的核提取物，所含HDAC 包含各种分类和亚型。

筛选的结果不能完全体现测 试药物对I类HADC的抑制作用。

为进一步确定待 测药物对I类HDAD不同亚型的影响，我们选择对 HDAC抑制作用较明显的7个化合物血根碱、胡椒 碱、异甘草素、异甘草苷、异槲皮苷、丹酚酸A和丹 酚酸C进一步进行了 HDAC3/8活性抑制评价，并 和阳性药物SAHA[16]和TSA[17’18]进行了比较。

结果发现，异甘草苷和异甘草素在其工作浓度下对HDAC3表现出了很强的抑制活性，100 时的抑制率分别为99. 5%和98. 3%，接近阳性药物SAHA 在50 时的作用效果；异甘草苷和异甘草素对HDAC8也表现出较好的抑制活性，工作浓度100 时抑制率分别为63. 0%和68.6%，但作用较阳 性药物SAHA和TSA弱。

血根碱、异槲皮苷和丹酚 酸A作用次之。

胡椒碱和丹酚酸C在100时对 HDAC3、HDAC8活性未表现出有明显抑制作用。

具 体结果见表2。

表2测试化合物对H D A C3/8活性的抑制率（％)(; = 3 $g h*
Table 2 Inhibitory effect of test compounds on HDAC3/8 activity ( % ) ( ; = 3, g±s)
样品Sample
工作浓度
Working concentration
(%M)
HDAC3抑制率
HDAC3 inhibition rate
HDAC8 抑制
HDAC3 inhibition rate
(%) 10098.3 ±2.168.6 ±1.3
异甘草素Isoliquiritigenin
5065.1 ±1.846.0 ±1.3
10099.5 ±0.863.0±1.3苷 Isoliquiritin
5067.2 ±3.736.2 ±0.2
10056.4 ±1.446.2 ±9.9 Sanguinarin0
5042.8 ±0.740.5 ±0.3
10076.0 ±0.647.3 ±1.8苷 Isoqu0rcitrin
5041.5 ±1.129.0 ±0.3
10043.5±1.952.7 ±1.3丹酚酸 ASalvianolic acid A
5025.1 ±0.438.7±1.2
100--丹酚酸 CSalvianolic acid C
50--
1007.5 ±2.87-4.6 ±0.9 Piperine
50 5.9 ±2.1-2.94 ±2.2
SAHA5088.5 ±6.292.3 ±0.5
TSA 1.2596.5 ±0.7101.5 ±0.5注:“-”未检测出抑制活性。

Note:*-”No inhibitory activity detected.
Vol . 30姚晓辉等：中草药来源的I 类HDAC 抑制剂筛选
1103
2.3
细胞增殖实验
为了进一步检测待测化合物对细胞内H D A C
表达的 ，以
H 0a
细胞为模型，100
%M
为起始
，检测药物作用48 h
对细胞增殖活力的
，确定细胞实验的作用浓度。

发现，
对
细胞的增殖表现出明显的抑制作用，其半数抑制浓 (IC 5〇)为3?3 %M (图1)。

后试验选择了
1、2、3、4 %M
四个工作 。

其他化合物对H
0a
细胞增殖的抑制作用见表3，其中，
和阳性
对照S A H A 对细胞增殖的抑制作用相对较强，100
%M
作用48 h 后的细胞活力
50C ，其IC ,。

别
为54. 22
和62. 90
%M
，故取50
%M
和25 %M
两个
为药物浓度;100
%M
苷作用48 h 后的
表3
测试化合物对H eL a 细胞活力的影响（％ )( ; = 3 $ g ±*
Table 3 2fe c t of test compounds on viability of HeLa cells (
%
) ( ; = 3，g ±
s
)
化合物Compounds 100 %M 50 %M 25 %M 12.5 %M 6.25 %M ++胡椒碱Piperine
66.21 ±2.5989.52 ±2.2695.37 ±2.67102.55 ±0.6199.72 ±0.71异甘草素 Isoliquiritigenin 25.41 ±1.5559.57 ±1.8174.58 ±1.4790.70 ±2.5596.95 ±0. 14异甘草苷 Isoliquiritin 80.35 ±3. 1688.78 ±1.0296.29 ±3.91100.68 ±1.9397.80 ±2.00丹酚酸 ASalvianolic acid A 85.47 ±0.7796.62 ±3.3792.63 ±1. 1095.94 ±1.0695.75 ±3.94丹酚酸 CSalvianolic acid C 82. 18 ±0.4793.50 ±0.0896.69 ±0.94100. 19 ±0.9099.89 ±1. 11异樹皮苷Isquercitrin
79.47 ±1.4886.28 ±2.0392.59 ±2.4395.23 ±2.7595.64 ±1.29SAHA
40.38 ±7.01
57.52 ±0.38
61.62 ±2. 13
72.69 ±2. 15
76.84 ±1.86
细胞活力在80C 左右;丹酚酸A 、丹酚酸C 、异 苷毒性较轻，100
%M
作用48
h
后的细胞活力
‘80C。

余药取
100 %M
和50 %M
两个药物。

12.5 MM 6.25 MM 3.125 |JM 1563 |JM 0.781 pM
图1
血根碱对H 0l 细胞增殖活力的影响
Fig. 1
2fe c t of Sanguinarine on the proliferation activity of HeLa cells
2?
药物对H e L a 细胞I 类H D A C
蛋白表达的影
响
检测了血根碱、
、丹酚酸A 、丹酚酸C 、异
苷、 苷、 选择工作 下作用于H e L a 细胞24 h 后细胞内I 类H D A C 的表达，
H D A C 抑制剂S A H A 为阳性对照， 如图2所。

H D A C
抑制剂S A H A #50、25
%M )能剂量依赖地抑制 H D A C 3和H D A C 8的表达； （1
〜4 %M )
剂
依赖地抑制H D A C 1、H D A C 3和H D A C 8的表达，但
对
H D A C 3表达的抑制作用最强；丹酚酸A #100
%M
)能明显减少H D A C 3和H D A C 8的表达;异甘草
苷#100、50 %M )能明显减少H D A C 3的表达，但不能
抑制H D A C 8的表达； #50 %M )能一定程度
减少H D A C 3和H D A C 8的表达；
苷#100 %M )
仅能一定
抑制H D A C 8的表达；
、丹酚酸
C
在其工作浓度#100、50 %M
)对全部I 类H D A C
表
无明显抑制作用。

所有化合物对H D A C 2的表 没有明 ，除 的其他化合物对
H D A C 1的表达无明显抑制作用。

图2
测试化合物对H eL a 细胞I 类H D A C 蛋白表达的影响
Fig. 2
2fe c t of test compounds on the expression of Class I HDAC proteins in HeLa
cells
1104天然产物研究与开发Vo1.30
3结论
本实验从中药来源的化合物中筛选出抑制活性 较明显的天然HDAC抑制剂，并进一步研究其对I 类HDAC中HADC3和HDAC8的抑制活性，但由于 缺少合适的试剂盒，未能分析其对HDAC1和 HDAC2活性的抑制效果。

我们的研究发现异甘草 素、异甘草苷能明显抑制HDAC3/8活性，对HDAC3 和HDAC8的表达也表现出了抑制作用；丹酚酸A 对HDAC3/8活性及表达的抑制作用良好;丹酚酸C 能明显抑制HDAC活性；异槲皮苷能明显抑制HDAC3/8的活性，且对HDAC8的表达有一定程度 抑制作用。

本研究中，具有一定HDAC抑制活性的胡椒碱 和丹酚酸C并不能抑制HDAC3/8的活性，也不能 抑制HeLa细胞内I类HDAC蛋白的表达，说明不是 I类HDAC的抑制剂。

工作浓度的丹酚酸A尽管能 抑制HeLa细胞内HDAC3/8蛋白的表达，但对细胞 的增殖抑制能力较弱。

与此同时，异甘草苷对HDAC3/8活性的抑制作用和异甘草素相当，其对 HeLa细胞内HDAC3的表达抑制作用甚至还强于异 甘草素，但异甘草苷对HeLa细胞的抑制作用却没 有异甘草素强。

这些结果说明HDAC3/8可能不是 影响细胞增殖的重要因素。

值得关注的是，血根碱尽管在试剂盒筛选时对 HDAC3/8活性的抑制作用不如异甘草素和异甘草 苷明显，但在HeLa细胞模型上对HDAC3/8表达的 抑制作用是所有化合物中最强，对细胞增殖的抑制 作用也最强，因此血根碱对ffl)A C的抑制作用更多 体现在抑制蛋白在细胞内的表达，而不是抑制蛋白 的生物活性。

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