上海地区宠物犬戊型肝炎流行病学研究

上海地区宠物犬戊型肝炎流行病学研究
Serological survey of hepatitis E virus infection among house pet dogs
in Shanghai region
专 业：兽医硕士
学号：**********
作者姓名： 桑志迪
指导教师： 华修国
答辩日期： 2008年6月
上海交通大学农业与生物学院
上海地区宠物犬戊型肝炎流行病学研究
摘 要
调查我国上海及其周边地区宠物犬中戊型肝炎病毒（HEV）感染情况。

随机采集上海地区散养宠物犬血样共70份，分离血清。

应用抗HEV抗体间接酶联免疫实验对血清样品进行HEV抗体检测。

15份宠物犬血清抗 HEV 阳性，宠物犬抗HEV抗体阳性率为21.4%。

在各品种宠物犬中杜宾犬的 HEV 感染率较高，感染率为33.3%。

刚毛犬的感染率为14.3%，雪纳瑞犬的感染率为25%，狼犬与可卡犬的感染率均为20%，金毛犬的感染率为11.1%。

各宠物犬中雌性HEV阳性率为34.38%，雄性HEV阳性率为8.51%，差异显著（P<0.05）。

同时进行RT-n PCR检测，但没有检测到病毒RNA。

关键词: 戊型肝炎病毒;动物; RT-n PCR; 间接ELISA
Serological survey of hepatitis E virus infection among house pet dogs in Shanghai region
【Abstract】To determine the prevalence of hepatitis E virus HEV in house pet dog in Shanghai, China. 70 pet dog serum samples were collected from Shanghai area, China. Detection of anti-HEV IgG antibody was conducted by using commercial ELISA. The HEV RNA was tested by using RT-PCR method. Our results showed that 15 of 70 (21.4%) pet dog serum samples were positive for anti-HEV IgG antibody. Among different species of pet dogs, the Doberman Pinscher showed the highest positive rate for anti-HEV antibody. The prevalence rate for species of gangmao, Schnauzer, and langquan were 14.3%, 25%, 20%, and 11.1%, respectively. The positive rate for male and female pet dog were 34.8% and 8.51%, respectively. The differences between male and female were very notable. However, we failed to detect HEV RNA in this serum samples. This suggested these antibody positive pet dogs were previously infected by HEV-liked virus.
Key words: hepatitis E virus ;animal; RT-n PCR; ELISA
目 录
第一章文献综述 (1)
第二章宠物犬中抗体的检测 (21)
引言 (21)
1.材料与方法 (23)
1.1 检测样品 (23)
1. 2 检测方法 (24)
1.2.1最佳HRP标记的兔抗狗IGG浓度的确定 (24)
1.2.2抗原抗体最佳反应时间 (24)
1.2.3 HRP标记的兔抗狗IGG最佳反应时间 (24)
1. 3 间接ELISA的操作步骤 (25)
1．3. 1 对照试验 (25)
1. 3. 2 加待测样品 (25)
1.3.3 洗板 (25)
1.3.4 加样 (25)
1.3.5 洗板 (25)
1.3.6 加HRP标记的兔抗狗IGG (26)
1.3.7 洗板 (26)
1.3.8 加酶底物溶液 (26)
1.3.9 终止反应 (26)
1.3.10 测定吸光值 (26)
1. 4 重复性试验 (26)
2 结果 (27)
2.1 最佳HRP标记的兔抗狗IGG的稀释度 (27)
2.2 抗原抗体最佳反应时间的确定 (27)
2. 3 HRP标记的兔抗狗IGG最佳反应时间的确定 (28)
2.4 重复性试验 (29)
2.5 上海部分地区宠物犬血清HEV IGG的检测结果 (29)
2.5.1 血清中抗HEV抗体阳性率 (29)
2.5.2 不同品种、不同性别宠物犬血清抗HEV抗体阳性率 (30)
第三章血清中病毒核酸检测 (31)
1.材料方法 (31)
1.1 检测样品 (31)
1.2 HEV RNA的提取 (31)
1.3 巢式PCR(RT -N PCR) 方法检测 (32)
1．3．1简并引物的设计 (32)
1.3.2 RT-N PCR (32)
2. 病毒核酸检测结果 (33)
3 讨论 (33)
参考文献 (36)
致谢 (43)
攻读学位期间已发表的学术论文 (44)
符号说明
BSA BovineSerum Albumin, 牛血清白蛋白
DEPC diethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯
DNA Deoxyribonucleic Acid 脱氧核糖核酸
dNTP Deoxy-nucleatrde triphosphate脱氧核苷酸三磷酸
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid乙二胺四乙酸
ELISA Enzyme-linked immunosobent assay酶联免疫吸附试验
ET-NANBH Enterically Transmitted Non-A Non-B Hepatitis, 急性传染性非甲非乙型肝炎
HA Hepatitis A, 甲型肝炎（甲肝）
HAV Hepatitis A virus, 甲型肝炎病毒
HB Hepatitis B, 乙型肝炎（乙肝）
HBV Hepatitis B virus, 乙型肝炎病毒
HE Hepatitis E戊型肝炎
HEV Hepatitis E Virus戊型肝炎病毒
HRP Horseradish Peroxidase, 辣根过氧化物酶
IEM ImmunoElectron Microscopy, 免疫电镜
Ig Immunoglobulin, 免疫球蛋白
PBS Phosphate-buffered saline 磷酸盐缓冲液
ORF Open Reading Frame, 开放读码框架
PCR Polymerase chain reaction聚合酶链式反应
RNA Ribonucleic Acid 核糖核酸
RNase A Ribonuclease A核糖核酸酶A
RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction 反转录聚合酶链式反应
TE Tris/EDTA buffer TE缓冲液
第一章 文献综述
戊型肝炎(Hepatitis E, HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus, HEV)引起的一种人和多种动物的人兽共患病，一般经粪－口途径传播。

人HE在发展中国家和地区发病率达80%以上，致死率为1%左右，怀孕期为6-8月的孕妇，其死亡率可达20% (Balayan et al, 1983)。

在历史上人HE有多次爆发，如印度新德里于1955-1956年冬天，引起29,000人发病；我国1988-1989年新疆地区大流行造成多达20万人以上发病。

目前我国人群中戊型肝炎仍以散发形式流行 ( Huang RT et al. 1999)。

2002～2004 年卫生部传染病报告疫情显示，6种肠道传染病中，除了戊肝病例逐年以约40 %的速度在增长外，均呈下降趋势。

为此，我国已被列为因戊肝发病和死亡所致的经济负担最严重的国家之一。

以前认为戊型肝炎流行地区主要分布在发展中国家，但是近年来在美国、法国、新西兰、澳大利亚等发达国家亦有散发病例报道。

戊型肝炎病毒不但可以侵犯人类，在其他动物中也广泛存和与传播。

人们相继在猪、羊、老鼠等动物中检测到戊肝病毒。

1. 分子病原学
HEV是一个近似球形的二十面体颗粒，形似杯状，无包膜，表面粗糙，有纤突，平均直径为27～34nm。

根据病毒颗粒大小和形态以及表面特征曾将其归为杯状病毒科（Caliciviridae），ICTV 第8次报告建议将HEV 暂归为戊型肝炎病毒科(family Hepeviridae), 并为唯一的戊型肝炎病毒属(genus Hepevirus)成员
( /ICTV )。

病毒对高盐、氯化铯及氯仿敏感，反复冻融以及在蔗糖中可结成团，导致病毒活性下降，在碱性环境中较稳定，在镁和锰离子存在下可保持完整（Nanda SK et al.Protranteed viremia during acute sporadic hepatitis E virusinfection.Gastroenterology 1995;108:225-30）。

内部呈两种不同形态：一是密集，为完整的病毒颗粒；另一种内部含电荷透亮区，为不含完整基因的病毒颗粒（图1）。

蔗糖梯度离心前者的沉降系数为185S，后者为165S。

1983年，Balagan 等应用免疫电镜技术从一受试志愿者的粪便中观察到病毒样颗粒。

1989年Reyes等从感染HEV的猕猴胆汁中，应用分子克隆技术提取了HEV RNA，并筛选出一段长约1.3kb的HEV阳性克隆ET1.1，获得了该病毒的基因克隆，将其正式命名。

其基因组为单条正链RNA分子，长度约7.2Kb，5′端形成帽子结构。

编码区被一个25nt短非编码区阻断，并且在其末端紧随一个65nt的非编码区和polyA结构。

编码区由3个部分重叠的开放式阅读框（ORFs）组成（图2）：
图3，HEV基因组结构图。

A为基因1-3型基因组HEV结构图，B为基因4型HEV基因组结构图。

ORF1长约5Kb，位于基因组5′末端，编码包括RNA复合物的非结构蛋白：鸟苷酸转移酶（guanylyl transferase）、甲基转移酶（Magden et al,2001）和一个RNA依赖的RNA聚合酶（Agrawal, 2001; Koonin et al,1989）。

Tam等在HEV感染的恒河猴肝组织Norther blot 分析中检测到了基因组RNA和两个分别为2kb和3.7kb的共3′末端 RNA（Tam et al,1991）。

随后，这两个亚基因组RNA也被报道存在于HEV中国株转染的细胞培养物中（Xia et al,2000）。

重组HEV基因组全长构建成功后，在转染进程中ORF1被认为直接进入宿主细胞以合成RNA聚合酶。

研究表明，在基因组全长转染后，ORF2、ORF3蛋白产物的表达需要一种功能性病毒多聚酶，这提示是ORF1编码了它们（Emerson et al,2004）。

ORF2长约2Kb，位于编码区的3′末端，编码病毒壳体（caspid protein），分子量约75KD。

现在ORF2蛋白的多重免疫区肽段已经鉴定出来，这种蛋白含有一个非常保守的大约10％精氨酸残基的N端，其作用可能是在RNA骨架上中和负电荷。

这项研究也支持了ORF2编
码HEV衣壳蛋白的假设（Meng, 2003）。

从早期的研究中我们知道，ORF2编码一个约75KD的蛋白，加工后为一N-端糖基化的88kD的蛋白，其糖基化位点为137，310和562位的天冬酰氨残基。

进一步的研究表明ORF2蛋白含有一N-端信号肽，在此信号肽的作用下ORF2蛋白穿过内质网膜。

内质网也是ORF2蛋白糖基化的的主要场所。

如今ORF2已经被用不同的系统所表达，包括原核系统、真核系统和转染哺乳动物细胞等。

董晨(2006)等将ORF2编码452～617位氨基酸的基因片段插入原核表达载体中进行表达，结果显示用原核表达的重组蛋白天然可溶, 相对分子质量(M r )约为22 000, 并可形成直径为20 nm左右的病毒样颗粒, 能与戊型肝炎患者血清发生Western blot 阳性反应, 免疫小鼠后可诱导产生高滴度的特异性抗体。

体外中和试验显示产生的抗体具有中和HEV的活性。

HEV的主要中和表位区域集中于ORF2 的394～606aa之间(Zhang, 2001; Zhang, 2005; Li, 2005)，且重组表达的相应片段(E2)能够很好地再现病毒衣壳外表面的主要结构特征(Li S W,2005;李少伟等, 2002; 李少伟等, 2004; 葛胜祥, 2003)。

何水珍(2006)等以该区域片断作为诱饵蛋白，用传统的酵母双杂交方法（MATCHMAKER Two-Hybrid System 3,Clonteck）从人胚胎肝细胞文库中筛选与之结合的靶蛋白。

通过核酸序列分析及同源性检索表明，4个克隆与之有相互作用，其中一个克隆与p38IP高度同源，细胞免疫共沉淀实验结果显示：在哺乳动物细胞水平仍能够检测到E2与P38IP片段的特异的相互作用。

ORF3是个只有372碱基对的小的开放式阅读框，位于基因组的
5′末端，与ORF1、ORF2分别有4nt和331nt的重叠。

ORF3可能编码一个最大123个氨基酸的蛋白，其具体功能尚未明确，推测可能与ORF2（Tyagi, et al, 2002）和包括细胞信号通信在内的细胞蛋白有相互作用（Korkaya et al, 2001; Tyagi et al, 2004）。

最近的研究表明，ORF2中与ORF3重叠部分的基因序列位于ORF2中最保守部分，但该区所编码的蛋白片度变异性最大。

推测该部分基因序列可能折叠形成一个较强的次级结构，从而抑制了核酸序列的变异（Purcell, et al., 2001）。

2. HEV的分型
2.1基因型分型
尽管目前HEV基因分型尚未有统一标准可循，存在很多分歧与问题。

但基于HEV核苷酸序列的系统进化分析，HEV可以分为4种不同的基因型，即基因1、2、3和4型。

其中基因1型在世界范围内广泛流行，但只感染人类。

（被认为只在人群中流行。

）虽然2006年有研究报道在柬埔寨猪粪样中检测到基因1型HEV RNA[4]，但是其确切情况还有待与进一步证实。

基因2型HEV只在墨西哥和非洲少数地区人群中流行，迄今为止，还未在世界其它地区发现。

基因3型和4型被认为是人兽共患病病原体。

其中3型在世界范内的人群和猪群中流行，我国2007年首次在上海猪群中发现基因3型HEV感染。

1993年，基因4型首先在中国人群中被发现。

除中国以外，基因4型还主要在日本、印度、印度尼西亚以及越南猪群和人群中流行。

自2000年以来，基因4型已经成为在中国流行的主要基因型.。

2．2血清型分型
国外已有不少学者提出HEV只有一个血清型的猜测，灵长类动物攻击试验也证实HEV的Ⅰ、Ⅱ、III基因型之间可以发生交叉保护反应。

但是，对近年在中国新发现的HEV第Ⅳ基因型毒株的中和抗原表位以及不同基因型毒株之间有无共同的中和抗原表位，至今尚无研究报道。

因此，目前阶段还没有相关的研究报道证实4种不同基因型的HEV只存在一个血清型。

3. HEV的跨种间感染与宿主范围
很多证据表明HEV可以跨种间感染与传播。

Meng等(1998)用人HEV US-2株静脉内注射感染健康猪，3～4天后，从猪粪便中分离到HEV RNA，2周后猪抗-HEV阳转。

但用巴基斯坦和墨西哥HEV株感染健康猪未获得成功，是否与不同地区的动物宿主对HEV易感细胞受体不同有关，尚需进一步研究。

Balayan等(1990)用急性HEV患者粪便提取液感染4头8～10kg白猪，同时采用口服(2.0ml)和静脉注射(1.5ml)2种途径感染，4头猪中有3头感染HEV。

于感染后14天和37天出现急性肝炎的组织病理学改变，提示人HEV可感染猪。

为证实猪HEV是否可感染人，Meng等(1998)用猪的HEV静脉注射2只恒河猴，1～2周后从粪便中分离出HEV RNA，并持续3～5周；4周后抗-HEV阳转，持续16周，表明猪HEV可感染猕猴，从而为猪HEV感染人类提供了依据。

据报道(Hsieh et al, 1999)，屠宰场的工人和卖猪肉者抗-HEV阳性率明显高于普通人群(分别为26.7 %、15.0%和8.0 %)，提示携带HEV的猪可能作为人感染HEV的传染源。

另外，高
桥雅春(2005)认为食用生的或半熟的患有HE的病猪、鹿肝或肉易引起人HE。

食源性污染正在成为HEV的重要传播因素。

也有学者认为接触猪的尸体(如猪销售和屠宰等)比接触猪的活体(养猪) 具有更高的HEV感染风险(Jary, 2005)。

越来越多的报道显示戊型肝炎是人兽共患疾病。

人是HEV的天然宿主，但是动物却做为HEV的天然蓄池，从而扩增病毒以感染人类。

已经有几种灵长类动物被证实对HEV易感，包括绢毛猴，食蟹猴，猕猴, 猫头鹰猴，黑猩猩，非洲绿猴，豚尾猴。

因为猕猴能很好地模拟HEV感染后的各种症状，因此被认为是最有价值的模式动物。

许多报道表明，在自然状态下家养的猪、羊、野鹿可以被HEV感染，而且在实验室中，这些物种也可以实验感染HEV。

实验室研究表明，灵长类动物感染HEV后的发病过程和人类相似，只是病毒粒子在体内持续时间上稍有区别。

多种检测及其研究手段在人类及动物中HEV的检测结果均支持戊型肝炎是一种人兽共患病。

近来，一种新的类似于哺乳动物HEV的病毒从美国鸡的胆汁中分离出来。

鸟类HEV最早于2001年在鸡中发现，其基因组序列与哺乳动物HEV有明显差异，可能被划分为第5种基因型。

它在北美主要引起鸡的肝脾肿大（hepatitis-splenomegaly,SH）综合症这一新发疾病。

尽管鸟类与哺乳动物HEV基因组同源性只有约50－60％，但他们外壳蛋白上具有相同的抗原表位。

而且二者在基因组结构上和ORF1的功能组成上亦十分相似。

鸟类HEV在美国鸡场中呈地域性流行，也可突破种间屏障感染火鸡。

本课题组在皖南某动物园的调查结果显示，两个分离自
鸟类的HEV分离株与另外9个分离自哺乳动物的HEV分离株同属基因4型，ORF2的同源性约98％。

这就意味着这些毒株可能共同起源于哺乳动物，之后在自然状态下通过哺乳动物－鸟类方式传染给这些鸟类。

这是到目前为止第一次在自然条件下发现哺乳动物HEV感染鸟类。

4. HEV的体外细胞培养
随着对HEV基因的克隆与测序，人们对HEV有了较多的了解。

但是由于缺乏合适的细胞培养系统，影响了对HEV分子生物学特性更深入的研究。

学者们为了摸索出有效的体外细胞培养体系做了大量的工作。

Tam（Tam AW , et al. V iro logy, 1996;）等使用10%的HEV 粪便悬液静脉注射接种猕猴，待猴的ALT升高时进行肝脏活检，分离HEV感染的肝脏原代细胞，在添加了激素和生长因子的无血清培养液（SFM）中培养。

在培养的65天中，用株特异性RT-PCR方法一直能在细胞中检出正链病毒RNA及提示病毒复制的负链病毒RNA , 证实该细胞系能在体外支持病毒复制。

Huang 等[Huang RT , et al. J Gen V iro l, 1992 ] 用从新疆分离的HEV 87A 株的粪便悬液接种人胚肺二倍体细胞(2BS) 并连续传代。

该病毒能够与来自新疆, 缅甸, 印度及前苏联的戊肝病人的急性期血清反应, 而与恢复期血清的反应则较差。

在第二次传代细胞培养的第3 天观察到典型的CPE现象。

乐耕耘等用戊肝患者急性期阳性粪便悬液感染恒河猴进行病毒的扩增与活化，后超速离心纯化病毒，获得细胞培养用毒种。

将其接种于各种人源性细胞（包括人胚肺二倍体细胞KMB17、人肺癌细胞A549、人肝癌
细胞BEL7402、人宫颈癌细胞Hela和非人灵长类细胞-非洲绿猴肾细胞 Vero，通过细胞病变观察、RT-PCR 检测及免疫荧光实验来判定细胞是否对HEV敏感。

结果他们发现，A549、KMB17、BEL7402细胞中第一代传代7-9天出现细胞病变，11-13天脱落， 传至10代仍可经正链和负链RT-PCR检测到HEV基因组正链RNA和复制的负链RNA的存在3 而Hela和Vero细胞未见细胞病变，分别于2-4代后经RT-PCR不能扩增到特异片段。

Huang 等[Huang RT , et al. Clin D iag L ab Immun, 1999; 6(5) : 729～ 733]将HEV87A株在人肺癌细胞系A549中成功传代, 病毒在A549中连传4代后滴度稳定，该细胞系中有典型CPE 出现。

但病毒在该细胞系传至第9 代后便再无法检出。

Toshinori等发展出一个有效的细胞培养体系。

他们使用高滴度的HEV（2.0×107拷贝/mol，基因3型）粪便悬液接种肝癌细胞株（PLC/PRF/5），成功传代5代。

当使用滴度为6.4×104 拷贝的HEV在6孔板接种PLC/PRF/5单层细胞时，在接种后14天检测到病毒RNA，在第60天达到最高值9.1×105 拷贝/ml；当使用滴度为8.66105，copiesHEV接种时，于接种后第12天检测到病毒，第60天达到最高滴度8.6×107拷贝/ml。

他们同时发现，当接种温度高于70℃时，HEV病毒不能在PLC/PRF/5上生长；而当病毒于56
℃孵育30分钟后依然有感染力。

5. 流行模式与地理分部
HEV主要经粪—口传播，也就是说病毒通过水和食物侵入人体，在肝脏中大量增殖后与胆汁一起进入肠道，再与粪便混合后排出体外，其他人因接触受该粪便污染的水源、食物等而感染，由此形成一
个传染环。

在HE多发地区，则以饮水为主要传染途径，含有病毒的粪便流入河，渗入地下，或是人饮用未经煮沸的河水和井水后感染，或是因洪水使粪便四处飞散，扩大了感染的概率和范围。

HEV感染主要以局部流行和零星散发两种形式存在。

世界上第一次爆发发生在印度新德里，主要是因水源污染引起，共有29000人受到感染（Vishwanathan R. Infectious hepatitis in Delhi(1955–56). A critical study: epidemiology. IndianJ Med Res 1957; 45:49–58.）。

自此以后，HE的主要爆发事件时有发生(见表1)。

、尼泊尔、苏丹、吉尔吉斯斯坦等地有流行。

我国自1980 年以来，新疆，辽宁，吉林，内蒙古和山东等省均有戊型肝炎的流行。

研究发现，在这些爆发事件中，15-40岁人群的感染率比其他人群高1-15%（29）。

然而也有其他研究结果显示，儿童也有更高的易感性（193，194）。

在爆发期间，HEV致死率为0.2-4%，但是至今还令人迷惑的是，有10-20%的感染然HEV的孕妇发生急性肝衰，特别是在妊娠第三期（31.195，196）。

在印度，30-60%的肝炎是由HEV感染引起的，在我国发生的急性病毒性肝炎中，戊型肝炎约占10%〔庄辉,毕胜利, 王佑春,等. 2002.〕。

图2描述了世界上报道的HEV流行区域分布
图。

图中显示的为本土HEV流行，伊拉克的流行情况有待与进一步证实。

图2，HEV流行地域分布图。

6. 临床特征与免疫反应
HEV作为人类一种爆发性疾病，其感染主要以亚临床症状存在。

其潜伏期从15-60天不等，平均潜伏期为40天（。

对志愿者的临床研究发现，在口服病毒阳性粪便悬液后，临床症状持续了36天。

HEV感染的临床症状与其他病毒性肝炎较为相似。

感染有时候可能是完全没有症状，也由可能类似于没有其他明显特征的急性病毒性发热。

当表现出症状时，通常为急性自限型病毒性感染，一般可以持续数周。

有些病人肝炎会导致长时间的cholestatic过程，黄疸前期症状可以持续1-10天（平均3-4天）。

上腹疼痛、恶心、呕吐等胃肠道症状也常有报道。

黄疸期会突然出现，主要表现为，黄疸，尿黑，粪便呈土色。

一般情况下，这种症状持续12-15天，一月内完全康复。

大约一般的
病人会有发烧，2/3的病人有关节痛，肝功能检测显示肝坏死。

实验室检测显示异常的包括胆红素尿，血清胆红素异常升高；血清中丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT)，天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST)和血清碱性磷酸酶活性显著性升高。

转氨酶水平升高先于症状出现约10天左右，并且于一周后达到峰值。

然而，转氨酶的显著性增高与肝损伤并无很好的相关性。

大部分病人随着症状减轻，血清转氨酶水平和胆红素异常逐渐减少，6周后达到正常水平。

临床研究显示，血清ALT水平的上升在黄疸出现时或之前到达一个最高值，这与其他病毒性肝炎相类似。

大约22天在血清中可以首次检测到HEV RNA，在前黄疸期（pre-icteric）持续，在黄疸期开始下降，在ALT水平达到顶峰时最终消失。

据报道，在印度、泰国、墨西哥等流行地区HEV的抗体水平显著高于美国、德国、日本等非流行地区。

在健康人群中，HEV抗体阳性率接近25%。

血清学调查发现，所有国家包括工业化国家，都有一个低的但持续的抗HEV抗体水平存在。

在症状出现时，血清中HEV-IgM 抗体即会出现，并能持续2周到3个月。

HEV-IgM抗体出现后，即能检测到HEV IgG抗体，IgG抗体水平在感染期迅速升高，而在康复期逐渐下降。

抗HEV-IgG抗体通常能存在很长时间，有报道显示，在病人康复数年后HEV-IgG抗体阳性率任然高达47%。

当然，重复感染造成的IgG 抗体阳性这种情况也不能排除在外。

儿童中IgG抗体阳性率调查结果与预期存在很大分歧。

有研究认为，免疫球蛋白A（IgA）可以作为HEV 新近感染的一个标志。

试验动物接种HEV病毒肝脏产生组织病理学变
化2-3周后，ALT水平明显升高。

14-22天肝脏可以检测到HEV病原产生，同时胆汁中可检测到病毒粒子，18-25天病理变化更为显著。

在第4-6周，ALT峰出现时或之前（28-39天）可以检测到HEV抗体的产生。

病理变化持续产生39天后，肝中HEV抗原消失。

这些病理变化包括inflammatory cell infiltration和肝细胞坏死。

肝细胞内细胞器异常变化，包括内质网膨胀，线粒体遭破坏，肝糖原消失，内质网膜增厚，微管聚合产生海绵状结构。

发病机理
由于HEV的血清学试验最近才可以使用，所以戊型肝炎的发病机理有待深入研究。

据信，HEV进入宿主体内主要是因误食被HEV污染的水源而经粪-口途径传播。

病毒在体内开始复制位点尚未确定，但推测可能是位于肠道中。

病毒是如何进入肝脏的这一点也尚不清楚，有人推测可能是通过血液流通。

病毒在肝细胞内复制，然后通过未知机制释放到胆汁和血液里。

通过对有限的志愿者的研究发现，口服病毒22天后出现病毒血症，先于黄疸出现月1周（月30天），34天后粪便中可以检测到病毒样颗粒。

一名志愿者体内的HEV抗体于41天首次出现，持续约2年。

7. 检测方法
有多种方法可用于戊型肝炎的检测，包括免疫电镜技术（IEM），荧光抗体阻断试验（fluorescent antibody blocking assay），PCR，EIA和最精发展出的immunochromatographic assay。

在上述方法中，用EIA和immunochromatography法检测HEV IgG或IgM是最方便的方法，而且对常规检测来说，这两种方法价格便宜结果稳定。

检测要求在急性感染的早
期进行，以免得到错误的阴性结果。

而抗HEV IgM阳性结果则提示急性感染正在进行。

在存在高或增加滴度的抗戊型肝炎抗体，在存在高滴度的HEV IgG抗体存在，或抗体正在迅速增加的情况下，即便是没有IgM抗体存在，也可以诊断为急性戊型肝炎的感染。

然而，在HEV
流行地区这些诊断方法需要进一步地验证。

这时候可以采用RT-PCR
法进行验证。

很多试验表明，RT-PCR结果与EIA结果能够很好地吻合。

但EIA这种诊断方法有很多局限性，而且在流行区域它的诊断灵敏度也还不确定。

７.1 免疫电镜
在黄疸前期，免疫电镜技术被用来检测27-34nma的病毒粒子，和血清中的抗体水平。

但这种检测方法往往需要的大量的抗原和高滴度的抗体。

由于HEV通过粪便排毒持续时间短，并且通过消化道时大部分病毒颗粒易被降解，使病毒缺损，完整的病毒颗粒较少，故检测较困难。

７.2 荧光抗体阻断试验
荧光抗体阻断试验通过抗原-抗体相互作用而半定量地检测HEV抗原。

这种方法的特异性已通过使用ET-NANB hepatitis病人及试验用短尾猴接种前、急性感染期和恢复期血清而得到证实。

最近，抗原特异性HEV-Ag通过定位于3‘端的重组蛋白的吸收试验而得到确定。

虽然免疫抗体阻断试验可以用于血清学诊断，但目前还仅限于实验室阶段，不适合于常规诊断。

７.3 酶联免疫吸附实验
酶联免疫吸附实验( ELISA) 是目前用于检测血清HEV 抗体最常用的方法, 其中以间接ELISA用途最广。

用于检测HEV的抗原有组织培养全病毒抗原、合成肽抗原和表达抗原。

1991 年美国Grenelabs公司以HEV墨西哥株和缅甸株ORF3区的一段重组表达多肽为抗原, 首次研制出第一代抗HEV ELISA试剂盒。

不久即被Shidmore利用Yarbough构建的ORF2和ORF3两个克隆的表达产物作抗原建立的第二代ELISA方法所代替, 第三代检测试剂为真核表达系统产物。

夏宁邵等[夏宁邵, 郑英杰, 张军. 戊型肝炎是否为人兽共患病的讨论[J]. 中国人兽共患病杂志, 2003.]报道了此类抗原的成功研制, 并用其研制出了抗HEV IgG 和抗HEV E2 IgM试剂( 万泰试剂) , 该试剂对急性期血清和恢复期血清均有很强的反应性, 在大量感染动物系列血清试验中均表现出了较好的特异性和灵敏度。

７.4 RT-PCR
RT-nPCR法是目前检测病毒RNA的常用方法有很高的敏感度和特异性。

1997年，Meng（1997,94:9860～9865）等基于HEV缅甸株序列，设计了两组用于巢式RT-PCR的简并引物，并在第一次PCR片段扩增和测序后，又设计了一个猪特异性引物与另一简并引物用于扩增猪HEV的ORF2和ORF3。

1998年，他们又设计了针对猪HEV的ORFI及末端非结构区的简并引物，用于RT-PCR。

该方法除了被用于检测急性期血清和粪便样品是否HEV RNA阳性外，还被用于监测水源是否被HEV污染。

链特异性RT-PCR现在被设计用于检测动物体内或细胞培养液中是否存在HEV RNA负链，从而判断病毒是否正在复制。

RT-nPCR扩正产物结合限。