隐球菌墨汁染色标本的创新制作法——优化染色法_论文

隐球菌墨汁染色标本的创新制作法——优
化染色法
【摘要】目的观察隐球菌墨汁染色标本优化染色法的效果。

方法传统法将菌液与墨汁混合后封片；优化法将菌液经动物增菌、培养后再与墨汁混合，封片。

两法各制片100张，进行效果比较。

结果试验组优片90张，良片10张；对照组优片10张，良片20张，差片70张。

传统染色法镜下所见，隐球菌荚膜结构模糊，细菌分布不均匀，墨汁浓度过淡或过浓，影响观察；优化染色法染出的标本镜下观察，隐球菌荚膜结构清晰，细菌分布均匀，芽生孢子结构多。

结论优化法制作的标本有保留时间长、操作简便和特适用于实验室大批制片及教学等优点。

【关键词】隐球菌；隐球菌墨汁染色；标本片
隐球菌墨汁压片染色法能反映隐球菌的形态特征，便于镜下检查，对隐球菌临床鉴定十分重要，也是重要的教学标本。

但有的标本不能较长时间保存，镜下观察荚膜结构模糊，芽生孢子结构少，且结构不够清晰。

我们经过多年来反复试验，在传统方法的基础上作了多次改进，现报道如下。

1 材料与方法
菌种
新生隐球菌。

沙氏培养基的制备
蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂1g，蒸馏水1 000mL，，20min，备用。

甘油墨汁染液的配制
墨汁50mL，甘油、石碳酸各20mL，混合摇匀备用。

方法设试验组与对照组，各染片100张。

试验组（用优化染色法）将隐球菌接种至沙氏培养基上，37℃培养2d后，将培养基上的菌苔与无菌的生理盐水混合制成菌液（浓度30亿/mL ），取该菌液1mL 注射入小白鼠（体质量约30 g）脑腔内，培养5～7d处死小白鼠取脑脊液与无菌生理盐水3mL混合制成菌液（浓度25～30亿/ mL），然后按1∶1比例取该菌与配制好的甘油墨汁混匀，用接种环取一小环在载玻片，用8×8 mm 盖玻片覆盖于菌液上，直接滴加中性树胶于小盖玻片周围封片。

对照组即传统的染色法，取在沙氏培养基上的隐球菌菌苔和无菌生理盐水混合制成菌液，用接种环取2～3环菌液与一滴墨汁在载玻片混合，覆盖载玻片。

染色效果评判标准
优片：镜下观察可见隐球菌荚膜清晰，有明显的芽生孢子结构，墨汁浓度适中，细菌分布均匀；良片:在镜下观察可见大部分隐球菌有荚膜，但见荚膜结构很稀薄，芽生孢子少；差片：在镜下观察荚膜结构模糊，墨汁浓度过淡或过浓，细菌分布不均匀，细菌易重叠堆积一起。

2 结果
试验组：优片有90张，良片有10张。

对照组：优片有10张，良片有20张，差片有70张。

试验组的制片效果明显优于对照组。

3 讨论
两种不同染色方法的结果表明，创新优化法染色制片的效果明显优于传统法：（1）传统法由于菌种接种在沙氏培养基中取菌苔与生理盐水混合制成菌液，菌液浓度不好掌握，菌液过浓菌体堆积导致荚膜结构看不清，过淡菌体不易寻找；取菌液与墨汁混合，而墨汁比例不好掌握，墨汁过浓不易观察，背影黑糊糊一片；过淡荚膜衬托不出。

（2）优化染色法是取脑脊液（隐球菌脑膜炎的脑脊液有典型的隐球菌结构）和生理盐水配成一定的浓度，然后按比例与墨汁混合。

这样按一定的比例混合，染出的标本菌体分布均匀，墨汁能与菌液彻底地均匀混合，荚膜结构清晰。

（3）传统法制作的标本，因墨汁在常温下易变干，制成的标本不能较长时间保存（最长时间只能保留1个月），只能临时观察，而优化法因墨汁染液中加入甘油，甘油有不易挥发的优点，则染出的标本能保留1～2a，且墨汁与隐球菌混合液装在封密的试管中可放臵于冰箱保存3a以上（还在继续观察），故命名为隐球菌墨汁染色标本优化染色法。

本法有操作方便、效果好、保存时间长和特别适合实验室大批制片及教学需要等优点。