法医鉴定试剂盒Identifiler中文用户手册

AmpFlSTR® Identifiler™PCR扩增试剂盒
中文用户手册
中文手册非Applied Biosystems公司官方文件，仅供国内用户参考。

所有资料以英文原版手册为准。

英文原版手册可以从上免费下载。

目录
1 引言 (3)
1 试剂盒概况 (3)
2 试剂盒特点 (3)
3 试剂盒位点 (3)
4 试剂盒成分 (4)
5 保存方法 (4)
6 订购信息 (5)
7 软件配置 (5)
2 310和377升级 (6)
1 310 升级 (6)
2 377升级 (8)
3 PCR扩增 (10)
1 试剂配制 (10)
2 DNA制备 (10)
3 PCR反应 (10)
4 310操作(Mac系统) (11)
1 软件要求 (11)
2 运行设置 (11)
3 光谱校正 (12)
4 电泳操作 (12)
5 GeneScan数据分析 (13)
6 Genotyper基因分型 (13)
7 关机步骤 (13)
5 3100操作 (14)
1 软件要求 (14)
2 光谱校正 (14)
3 PCR扩增 (15)
4 电泳样品准备 (15)
5 电泳参数 (15)
1引言
1．A mpFlSTR Identifiler试剂盒概况
新一代法医鉴定及亲子鉴定试剂盒A m p F l S T R I d e n t i f i l e r P C R扩增试剂盒是一个多重短串联重复序列（S T R）检测试剂盒。

它采用美国应用生物系统公司（ABI）最新的五色荧光、一个泳道技术，可以同时扩增和同时检测16个STR位点（15个4核苷酸重复位点加上A m e l o g e n i n性别判定标记）。

5色荧光中，6-F A M（兰色）、V I C（绿色）、N E D（黄色）和P E T（红色）用于标记样品，L I Z（橙黄色）用于标记G e n e S c a n-500分子量内标。

AmpFLSTR Identifiler PCR扩增试剂盒包含美国C o m b i n e d D N A I n d e x S y s t e m(C O D I S)所要求的全部13个位点，另外增加2个位点：D2S1338和D19S433。

它整合了ABI公司先前推出的Profiler Plus、COfiler和SGM Plus试剂盒中的全部STR位点，满足目前所有国际罪犯数据库的要求，如CODIS、ENFSI、Interpol以及SGM Plus体系。

2．A mpFlSTR Identifiler试剂盒特点
♦单管同时扩增16个位点
包括15个个体识别位点以及一个性别鉴定位点Amelogenin。

♦采用与以往试剂盒完全相同的引物序列
所有位点扩增产物与ABI现有Profiler Plus, COfiler 及SGM试剂盒扩增结果完全一致，罪犯DNA数据库工作可以在不同试剂盒中自由切换。

♦五色荧光技术
五色荧光技术实现了一色荧光标记分子量内标，其余四色荧光标记待测样品，在维持扩增产物大小不变的条件下，有效地提高了单个泳道可以分辨的片段数。

♦扩增产物小
全部16个位点的PCR扩增产物均小于350 bp，扩增效率及重现性高，支持DNA降解样品的扩增。

♦提供完备的解决方案
由试剂、仪器、软件、技术支持等构成完整的体系。

3．AmpFlSTR Identifiler试剂盒位点
位点名称染色体定位Identifiler Allelic Ladder
的等位基因
染料
标记
对照DNA
9947A
D8S1179 8 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,
18, 19
6-FAM 13
D21S11 21q11.2-q21 24, 24.2, 25, 26, 27, 28, 28.2, 29,
29.2, 30, 30.2, 31, 31.2, 32, 32.2,
6-FAM 30
33, 33.2, 34, 34.2, 35, 35.2, 36,
37, 38
D7S820 7q11.21-22 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 6-FAM 10, 11 CSF1PO 5q33.3-34 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 6-FAM 10, 12 D3S1358 3p 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 VIC 14, 15 TH01 11p15.5 4, 5, 6, 7, 8, 9, 9.3, 10, 11, 13.3 VIC 8, 9.3 D13S317 13q22-31 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 VIC 11
D16S539 16q24-qter 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 VIC 11, 12
D2S1338 2q35-37.1 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,
24, 25, 26, 27, 28 VIC 19,
23
D19S433 19q12-13.1 9, 10, 11, 12, 12.2, 13, 13.2, 14,
14.2, 15, 15.2, 16, 16.2, 17, 17.2 NED 14,
15
vWA 12p12-pter 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24 NED 17,
18
TPOX 2p23-2per 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 NED 8
D18S51 18q21.3 7, 9, 10, 10.2, 11, 12, 13, 13.2, 14,
14.2, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,
22, 23, 24, 25, 26, 27 NED 15,
19
Amelogenin X: p22.1-22.3
Y: p11.2
X, Y PET X D5S818 5q21-23 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 PET 11
FGA 4q28 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25,
26, 26.2, 27, 28, 29, 30, 30.2,
31.2, 32.2, 33.2, 42.2, 43.2, 44.2,
45.2, 46.2, 47.2, 48.2, 50.2, 51.2 PET 23,
24
4．AmpFlSTR Identifiler试剂盒成分
AmpFlSTR Identifiler试剂盒的一个包装足以进行200次25-µl反应体系的PCR扩增，并包括相应的使用许可。

成分描述体积
AmpFlSTR PCR reaction Mix 2管，在含有0.05%叠氮酸钠的缓冲液中溶有
MgCl2，脱氧三磷酸核苷酸和牛血清白蛋白。

1.1 mL/管
AmpFlSTR Identifiler
Primer Set
1管，含有荧光标记和未标记的引物。

1.1 mL
AmpliTaq Gold DNA Polymerase 2管，5 U/µL。

50
µL/管
AmpFlSTR Control DNA 9947A 1管，0.10 ng/µL女性人细胞株DNA溶于
0.05%叠氮酸钠和缓冲液中。

0.3 mL
AmpFlSTR Identifiler
Allelic Ladder
1管。

50 µL 5．保存方法
成分保存条件
AmpFlSTR PCR Reaction Mix 2到8℃
AmpFlSTR Identifiler Primer Set 2到8℃，避光 AmpFlSTR Control DNA 9947A 2到8℃
AmpFlSTR Identifiler Allelic Ladder 2到8℃，避光 AmpliTaq Gold DNA Polymerase -15到-25℃
6． 订购信息
试剂名称
货 号 AmpFLSTR® Identifiler™ PCR Amplification Kit
4322288 AmpFLSTR® Identifiler™ PCR Amplification Kit User’s Manual 4323291 Matrix Standard Set DS-33 for the 310/377 systems 4318159 Matrix Standard Set DS-33 for the 3100 system
4323016 Matrix Standard Set DS-33 for the 3700 system (with parameter file CD-ROM)
4327569 Matrix Standard Set DS-33 for the 3700 system 4318254 GeneScan™-500 LIZ™ Size Standard 4322682
7． 软件配置
仪 器
Data Collection Software
GeneScan® Software Genotyper® Software 310 （苹果系统） v 2.1 or higher
v 3.1 or higher
v 2.5.2
310 （PC 系统） V3.0 v 3.7 v 3.7 377 （PC 系统） V3.0 v 3.7 v 3.7 3100
v 1.0.1
v 3.7
v 3.7
软件升级信息： 软件名称
货 号 Genotyper Software v2.5.2 upgrade ，from any previous version
401817
377 Windows NT upgrade from Mac (including Data Collection
Software v3.0)
4327420
GeneScan Analysis Software v3.7, Mac to Windows NT upgrade 4327313 Genotyper Software v3.7, Mac to Windows NT upgrade
4310995
GeneScan Software v3.7 and Genotyper Software v3.7, Mac to
Windows NT upgrade 4327314
2310和377升级方案
1.310升级方案
310有两种升级方案：1）苹果系统上的升级：保留苹果电脑，升级Data Collection、GeneScan和Genotyper软件；2）苹果电脑升级为PC电脑，软件由Mac版本升级为Windows NT版本。

310 （苹果系统） 310
（PC系统）
Data
Collection
软件
v 2.1 or higher (for Mac) V3.0 (for windows NT)
GeneScan®
软件
v 3.1 or higher (for Mac) v 3.7 (for windows NT)
Genotyper®
软件
v 2.5.2 (for Mac) v 3.7 (for windows NT)
升级Kit 1.
P/N
4330430： Topfill, Identifiler
Kit Upgrade for 310 Mac OS
Includes:
P/N 4322288：AmpFlSTR
Identifiler Kit
P/N 4323291：AmpFlSTR
Identifiler Kit User Manual
P/N 4318159：Matrix Standard
Set DS-33
P/N 4322682：GeneScan-500
LIZ Size Standard
P/N 4324229：ABI PRISM 310
Data Collection Software V2.1
P/N 4308451：Genoptyper
software upgrade V2.5.2 1. P/N 4327421：Basic Blunder
for 310 Genetic Analyzer Includes:
P/N 4327282：Genetic Analysis
computer System (PC computer)
P/N 4326986：310 system Data
Collection Software V3.0 for Windows NT
P/N 4316489：Instrument serial
communication cables (2)
2. P/N 4327313：GeneScan
Analysis Software V3.7 for Windows NT
3. P/N 4310995：Genotyper
Software V3.7 for Windows NT 4. P/N 4327314：GeneScan
Software V3.7 and Genotyper
V3.7 for Windows NT
ABI PRISM 310 Collection Versions 2.1安装
1. 备份个人数据
重要：如果您有样品文件或优化过的modules文件需要保存，在ABI PRISM 310 folder外建立一个新文件夹，将需要保存的文件拖放到它里面。

安装新软件将自动覆盖
现有的版本。

2．在运行 310 Data Collection安装程序之前
* Launch your existing 310 Data Collection.
* Go to the Window heading and select Manual Control.
* In the Function section of the window select Calibration File Make and the click on execute.
* Quit the 310 Data Collection software and launch the NEW 310 Data Collection Installer (ver 2.1).
3．RESET 310 Genetic Analyzer
AFTER running 310 Collection 2.1 installer but BEFORE launching the new collection software for the first time, please RESET the 310 Genetic Analyzer as follows:
* Turn the instrument Power OFF.
* While holding down the TRAY button and the GEL PUMP button simultaneously, turn the power switch on the back of the instrument ON. Wait at least ten seconds before releasing
the TRAY and GEL PUMP buttons.
* The first time the 310 collection software is launched after this, new firmware will be downloaded to the instrument.
* After the firmware is downloaded, you will be presented with a window prompting you to quite and re-launch for the new firmware to take affect. Click the Quite button in this window and re-launch 310 Data Collection Software.
4．安装新的Basecaller:
If you currently have any version of Sequence Analysis installed:
* Go to the Sequence Analysis Folder on your hard drive.
* Create a new folder called Basecaller Archive.
* Drag the file in the Sequencing Analysis folder named BasecallerPPC into the folder you just created.
* Go to the 310 Data Collection V2.0 CD and locate the folder called New Basecaller.
* Open the folder and drag the BasecallerPPC from the New Basecaller folder files into the Sequencing Analysis folder on your hard drive.
* Next, drag the following files from the New Basecaller folder to the ABI Folder in the System Folder:
310POP4.bcp ABI-CE1.bcp ABI-CE2.bcp
DT310POP4{BD}v1.mob DT310POP4{dRhod}v1.mob
DP310POP4{BD-21M13}v2.mob DP310POP4{BD-M13Rev}v1.mob The new basecaller should now be installed.
5．重启Macintosh电脑
6．310 Data Collection Installer 2.1所新安装的文件夹
The installer will create the following folder organization if it doesn't already exist on your
destination disk. 你可能需要rebuild the Macintosh desktop以便正确显示icons。

1. ABI PRISM 310
2. ABI PRISM 310:Firmware Image
3. ABI PRISM 310:Modules
4. ABI PRISM 310:Runs
5. ABI PRISM 310:Sample Sheets
6. System Folder: ABI Folder
ABI PRISM GeneScan 3.1安装
双击GeneScan Installer，按页面提示选择I Accept, Next, OK等，重新启动电脑。

首次启动GeneScan v3.1需要输入用户名、公司名和密码。

ABI PRISM Genotyper 2.5.2安装
双击Genotyper Installer，按页面提示选择I Accept, Next, OK等，重新启动电脑。

首次启动Genotyper v2.5.2需要输入用户名、公司名和密码。

Genotyper v2.5.2与以前版本相比的改进之处在于：
* Genotyper 2.5.2支持5色荧光GeneScan sample files的读取和分析。

* A bug related to doing cut/copy/paste in the dye/lane list has been fixed.
不足之处在于：
* Genotyper 2.5.2版创建的documents或templates可以被2.5版打开，但是不能被更早的版本(2.1、2.0、1.1.1等)打开。

AmpFLSTR Identifiler Kit Template安装
将AmpFLSTR Identifiler Kit Template 文件复制到电脑硬盘中即可。

该文件在光盘上的文件名如下：
TEMPLATES TEMPLATE NAME ON DISK
AmpFLSTR Identifiler Kit Template v1 IDENTIFILER_V1
AmpFLSTR Identifiler Kit CODIS Template v1 IDENTIFILER_CODIS_V1
AmpFLSTR Identifiler Kit Template v1和AmpFLSTR Identifiler Kit CODIS Template v1 要求Genotyper软件版本为v2.5.2或以上. Genotyper Software v2.5.2对系统的最低要求是Power Macintosh computer，Mac OS 8.x或9.1操作系统.
2.377升级方案
377只有一种升级方案：苹果电脑换为PC，软件由Mac升级为Windows NT版本。

（PC系统）
仪器 377
Data Collection
V3.0 (for windows NT)
Software
GeneScan® v 3.7 (for windows NT)
Software Genotyper® Software
v 3.7 (for windows NT)
升级Kit 1. P/N 4327420： Basic Bundler for 377 Genetic Analyzer
Includes:
P/N 4327283： Genetic Analysis computer System (PC computer) P/N 4326985：377 system Data Collection Software V3.0 for Windows NT P/N 4316489：Instrument serial communication cables （2） 2. P/N 4327313：GeneScan Analysis Software V3.7 for Windows NT 3. P/N 4310995：Genotyper Software V3.7 for Windows NT
4. P/N 4327314：GeneScan Software V3.7 and Genotyper V3.7 for Windows
NT
3P C R扩增
1．试剂配制
T E缓冲液
混合10m L1M T r i s-H C l，p H8.0、0.2m L0.5M E D T A和990m L去离子水，分装消毒，室温保存。

M a s t e r M i x
1．以下试剂震荡混匀5秒钟，然后短暂离心：AmpFlSTR PCR Reaction Mix，AmpFlSTR Identifiler Primer Set，AmpliTaq Gold DNA Polymerase；
2．计算所需试剂用量：
AmpFlSTR PCR Reaction Mix 样品数X10.5 µL
AmpFlSTR Identifiler Primer Set 样品数X5.5 µL
AmpliTaq Gold DNA Polymerase 样品数X0.5 µL
3．中速震荡混匀M a s t e r M i x5秒钟，每个P C R管分装15µL。

2．D N A准备
Identifiler每反应使用10µL DNA，浓度0.05–0.125n g/µL，反应总体积25 µL。

1．如果D N A浓度小于或等于0.125n g/µL，加入10 µL；
2．如果D N A浓度大于0.125n g/µL，取一部分样品用TE缓冲液稀释到10 µL体积中含0.5–1.25n g总D N A（终浓度0.05–0.125n g/µL）；
3．阳性对照：10 µL (1 ng)混匀后的AmpFlSTR Control DNA 9947A；
4．阴性对照：10 µL TE缓冲液。

3．P C R反应
热循环仪
推荐使用以下型号的P C R热循环仪，因为Identifiler试剂盒的PCR热循环条件是在这两款PCR仪上优化的：G e n e Amp PCR 9600；G e n e Amp PCR 9700，金基座或银基座。

注意9700有三款不同的配置：金基座、银基座和铝基座。

9700 型PCR热循环仪最佳配置是96-孔板金基座（P/N 4314878）或者96-孔板银基座（P/N N805-0001），AB 公司所有HID试剂盒的PCR反应条件都是在该机型上建立的。

经验表明，铝座9700（P/N 4314879）可以得到满意结果。

如果使用铝基座9700而实验结果有疑问，可能需要重新优化反应条件。

D N A扩增
1．按下述程序扩增D N A：
95℃ 11 min → (94 ℃ 1 min → 59 ℃ 1 min → 72 ℃ 1 min) × 28个循环
→ 60 ℃ 60 min → 4-25 ℃保温。

2．如果P C R产物的保存时间小于2周，保存于2到6℃；
3．如果P C R产物的保存时间大于2周，保存于-15到-25℃。

4．P C R产物不需纯化，直接与甲酰胺、分子量标准混合，变性后上电泳仪电泳。

4310操作(M a c系统)
1．软件和M a t r i x要求
软件
D a t a C o l l e c t i o n S o f t w a r e v2.1以收集5色荧光数据；
GeneScan Analysis v3.1；
Genotyper software v2.5.2。

M a t r i x
采用d y e s e t D S-33(6-F A M,V I C,N E D,P E T和L I Z)m a t r i x标准品，运行F i l t e r S e t G5 M o d u l e文件G S S T R P O P4(1m L)G5。

2．运行设置
设置电泳温度
在电泳开始前就将电泳温度设置好，可以节省时间。

在G S S T R P O P4(1m L)G5 m o d u l e运行开始的时候会自动进行这一加热步骤。

仪器可能需要长达30分钟以达到60℃，事先升温可以利用这一段时间准备样品。

设置温度的步骤是：关闭310的前门，打开A B I P R I S M310C o l l e c t i o n S o f t w a r e，从W i n d o w菜单中选择M a n u a l C o n t r o l，再从下拉菜单中选择T e m p e r a t u r e S e t，将温度设为60℃，点击E x e c u t e。

分析参数设置
运行A B I P R I S M310C o l l e c t i o n S o f t w a r e v2.1，从W i n d o w菜单中选择P r e f e r e n c e s，再选择G e n e S c a n S a m p l e S h e e t D e f a u l t s，将s i z e s t a n d a r d颜色设为o r a n g e(O)。

从P a g e下拉菜单中选择G e n e S c a n I n j e c t i o n L i s t D e f a u l t s，f i v e-d y e m o d u l e选择G S S T R P O P4(1m L)G5；选择缺省的m a t r i x文件；选择A u t o a n a l y z e w i t h G e n e S c a n A n a l y s i s。

点击O K保存设置。

建立5-d y e样品表(S a m p l e S h e e t)和上样表(I n j e c t i o n L i s t)
运行A B I P R I S M310C o l l e c t i o n S o f t w a r e v2.1，从F i l e菜单中选择N e w，显示C r e a t e N e w窗口，点击所要选择的48管或96管G e n e S c a n S a m p l e S h e e t图标，在所显示的样品表窗口右上角的下拉菜单中选择5D y e，在所显示的5色样品表中填好样品名、s a m p l e i n f o r m a t i o n和c o m m e n t s，指定适当的内标颜色，保存。

从F i l e菜单中选择N e w，显示C r e a t e N e w窗口；点击G e n e S c a n I n j e c t i o n L i s t图标，显示的上样表窗口；在S a m p l e S h e e t下拉菜单中选择正确的样品表，此时可以适当修改电泳参数，然后保存上样表。

在上样表窗口中，点击R u n按钮，开始电泳。

3．光谱校正
1.310/377系统使用的Matrix Standard Set DS-33 (Filter Set G5)包括以下5种荧光染料：
6-FAM、VIC、NED、PET、LIZ。

2.310 Matrix标准品制备：每一Matrix标准品分别按如下比例制备一管：
Hi-Di甲酰胺 25
ul
310 Matrix标准品 1 ul
切勿在Matrix标准品中加入GeneScan-500 LIZ分子量标记。

混合物于95℃变性 3 min ，迅速置冰中冷却3 min。

3.填样品表；在Injection List中，Module选GS STR POP4 (1 mL) G5，Matrix File选
None。

4.电泳完成后，在GeneScan Analysis软件中，从File菜单选New，点击Matrix图
标，选择5 Dyes，指定B、G、Y、R、O各自对应的Matrix标准品电泳文件，Start 输入3300 (可以根据实际电泳结果调整到引物峰之后), Points输入2500，点击OK，计算机完成matrix制作并显示matrix文件表，将matrix文件保存到System文件夹的ABI文件夹中。

4．D N A样品电泳
准备样品和A m p F l S T R I d e n t i f i l e r A l l e l i c L a d d e r
1. 混合Hi-Di Formamide和GeneScan-500 LIZ分子量标记：
Hi-Di Formamide （样品数+2）X24.5 µL
GeneScan-500 LIZ分子量标记（样品数+2）X0.5 µL
确认样品数中包括每批电泳至少一个AmpFlSTR Identifiler Allelic Ladder。

3．震荡混匀，然后简短离心，每个样品管分装25µL上述混合物。

4．每管加入1.5 µL PCR产物或AmpFlSTR Identifiler Allelic Ladder，用枪吹吸混匀。

5．95℃变性 3 min ，迅速置冰中冷却3 min。

样品电泳
1．运行A B I P R I S M310C o l l e c t i o n S o f t w a r e v2.1。

2．从F i l e菜单中选择N e w，显示C r e a t e N e w窗口，点击所要选择的48管或96管
G e n e S c a n S a m p l e S h e e t图标，在所显示的样品表窗口右上角的下拉菜单中选择5
D y e，填好样品名；填好s a m p l e i n f o如B l u e,G r e e n,Y e l l o w,R e d，对于A l l e l i c
L a d d e r，则填入“L a d d e r”。

这对G e n o t y p e r分析数据非常重要。

或者也可以将S a m p l e N a m e栏的内容拷贝到S a m p l e I n f o栏中。

3．填好Injection List；点击Run按钮开始运行。

5．G e n e S c a n数据分析
1.运行G e n e S c a n S o f t w a r e v3.1。

2.从Settings菜单选择Analysis Parameters。

3.填写以下各框：
Analysis Range：选择This Range；输入起始和结束点数。

起点应当选在分子量
标记的75 bp带的刚好前面，终点应当选在分子量标记的450 bp带的刚好后面。

Data Processing：选择Baseline和MultiComponent；选择一种Smooth Option：建
议选择Light smoothing option。

Peak Detection：为每一种颜色选择一个Peak Amplitude Threshold。

Size Call Range：选择This Range：Min输入75，Max输入450。

Size Calling Method：选择Local Southern Method。

Split Peak Correction：选择None。

4.填写完成后点击OK。

5.定义分子量片段大小：
点击一个样品文件的Size Standard栏右边的箭头，从下拉菜单中选择Define
New，输入各片段的bp数，但是250-bp峰不指定大小，使其值为0；保存于GS
Standards文件夹。

6.选择所有颜色，点击Analysis按钮。

7.从Window菜单中选择Results Control，打开GS文件看结果。

6．G e n o t y p e r基因分型
1.双击I D E N T I F I L E R按钮，运行G e n o t y p e r S o f t w a r e v
2.5.2。

2.将缺省值设置成输入raw data, Blue, Green, Yellow, Red和Orange。

3.从File菜单选择Import GeneScan File(s)，选择project file并点击Import。

4.从主页面左下角的宏命令列表中选择Check GS500，从Macro菜单选择Run
Macro。

5.从主页面左下角的宏命令列表中选择Kazam，从Macro菜单选择Run Macro。

6.查看数据。

7．关机步骤
1.取下并清洗Syringe和Block，丢弃未用完的胶。

2.在Manual Control窗口，选择Autosampler Home X, Y Axis并点击Execute。

3.选择Autosampler Home Z Axis并点击Execute。

4.关闭310电源。

53100操作
1．软件要求
数据收集软件(D a t a C o l l e c t i o n)
A B I P R I S M3100D a t a C o l l e c t i o n S o f t w a r e v e r s i o n1.0.1。

数据分析软件
GeneScan Analysis v3.7，Genotyper software v3.7；
或者GeneMapper ID v3.1。

2．光谱校正
Matrix Standard Set Reference Table
AmpFlSTR Kit Filter Set Required Matrix Standard Part Number
Profiler Plus, Cofiler, SGM Plus, Profiler F Matrix Standard Set DS-32
[5-FAM, JOE, NED, ROX dyes]
for ABI Prism 3100 system
4323018
Identifiler G5 Matrix Standard Set DS-33
[6-FAM, VIC, NED, PET, LIZ dyes]
for ABI Prism 3100 system
4323016
1.3100的Matrix Standard Set DS-33 (Filter Set G5)试剂盒中包括1管标准品，可在16
根毛细管束上进行8次校正。

2-8℃保存，切勿冷冻。

2.3100 的Matrix标准品按如下比例制备：
Hi-Di甲酰胺 195
ul
3100 Matrix标准品 5 ul
注意：切勿在Matrix标准品中加入GeneScan-500 LIZ分子量标记。

在96孔板的两排16个孔中每孔分装10 uL标准品/甲酰胺混合物，在9600 或9700 PCR仪上95℃变性 5 min ，迅速置冰中冷却3 min。

3.在3100 Data Collection软件的Plate View页面中，点击New。

然后在Plate Editor页
面完成以下设置：
a) 为检测板命名；
b) 选择适当的Spectral Calibration；
c) 在Plate Type栏选择96-well；
d) 点击Finish。

如下填写样品表：
a)为每一个样品填入样品名；
b)在Dye Set 栏选择G5；
c)在Run module栏选择Spect36_POP4DefaultModule；
d) 在Spectral Parameter栏选择MtxStd{GeneScanSetG5}.par。

4.有关电泳样品的指导请参考3100用户手册。

3.P C R扩增
M a s t e r M i x配制
1.以下试剂震荡混匀5秒钟，然后短暂离心：AmpFlSTR PCR Reaction Mix，
AmpFlSTR Identifiler Primer Set，AmpliTaq Gold DNA Polymerase；
2.计算所需试剂用量：
AmpFlSTR PCR Reaction Mix 样品数X10.5 µL
AmpFlSTR Identifiler Primer Set 样品数X5.5 µL
AmpliTaq Gold DNA Polymerase 样品数X0.5 µL
4.中速震荡混匀M a s t e r M i x5秒钟，每个P C R管分装15µL。

D N A配制
Identifiler每反应使用10µL DNA，浓度0.05–0.125n g/µL，反应总体积25 µL。

1.如果D N A浓度小于或等于0.125n g/µL，加入10 µL；
2.如果D N A浓度大于0.125n g/µL，取一部分样品用TE缓冲液稀释到10 µL体积
中只含有0.5–1.25n g总D N A（终浓度0.05–0.125n g/µL）；
3.阳性对照：取10 µL (1 ng)混匀后的AmpFlSTR Control DNA 9947A；
4.阴性对照：取10 µL TE缓冲液。

P C R扩增
1.按下述程序扩增D N A：95℃ 11 min → (94 ℃ 1 min → 59 ℃ 1 min → 72 ℃ 1 min)
× 28个循环→ 60 ℃ 60 min → 4-25 ℃保温。

2.如果D N A保存时间小于2周，保存于2到6℃；
3.如果D N A保存时间大于2周，保存于-15到-25℃。

4．电泳样品准备
按下表配制，用Hi-Di Formamide补充终体积至10µL。

每次电泳（15个样品）须走一个Ladder。

AmpFlSTR PCR产物或Allelic Ladder都需要在95℃变性 5 min ，然后迅速置冰中冷却3 min。

AmpFlSTR Kit PCR产物
或Allelic Ladder Size Standard Hi-Di
Formamide
Profiler Plus, Cofiler, SGM Plus 1 µL GeneScan-500 ROX Size
Standard: 0.5 µL (P/N 401734)
8.5 µL
Identifiler Kit 1 µL GeneScan-500 LIZ Size
Standard: 0.3 µL (P/N 4322682)
8.7 µL 5．电泳参数
D y e S e t G5
G e n e S c a n36_P O P4d e f a u l t m o d u l e。

Last revised: 2005-1-24。