VEGF-C在宫颈癌细胞中的表达及其对细胞增殖、黏附及侵袭的影响
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整理ppt
（M.A.A Al-Rawi.et al. Histolo整gy理papnt d Histopathology 2005）
( Marc G.Achen et al. Cancer Cell. 2005. )
整理ppt
VEGF-C
研究设想
淋巴内 皮细胞
肿瘤细胞
整理pptபைடு நூலகம்
肿瘤 淋巴 转移
两端各3个碱基进行硫代修饰。
整理ppt
➢ 阳离子脂质体 Lipofectamine™2000（美 国Invitrogen公司，系尹如铁副教授惠赠）
➢ Transwell小室（3428型，孔径8um，美国 Corning-Costar公司）
➢ 引物：VEGF-C及内参照GAPDH的引物均由 上海生物工程有限公司合成，其氨基酸序列 及其产物长度如下：
（曹泽毅主编，中华妇产科学，2004 ）
整理ppt
肿瘤淋巴转移是一个多步骤、多因素参与的及其 复杂的过程。近来随着特异性淋巴内皮标记的发现， 淋巴转移的研究成为继血管生成之后肿瘤研究的又 一热点，以期通过阻断肿瘤的淋巴转移，改善患者 的预后。
目前对于肿瘤淋巴转移机制的研究,主要集中在 VEGF-C特异性与受体VEGFR-3 结合，诱导淋巴管 生成，促进肿瘤的淋巴转移方面。
➢ 为便于观察寡核苷酸转入细胞的效率，在反义链 5‘端标记了羧基荧光素(FAM)，FAM的激发波 长是480nm，发射波长是520nm，在荧光显微 镜下是绿色的。
整理ppt
MTT法检测Hela细胞黏附能力的变化
包被基底膜
吸取培养板中的液
体，加入50ul含 10g/L BSA的无血 清高糖DMEM培养 液，37℃，孵育 30min。
整理ppt
VEGF-C反义寡核苷酸的设计
➢ 反义寡核苷酸设计，首先是从美国国立图书 馆的GENEBANK数据库中，查找到人 VEGF-C的基因序列（NM 005429）。
➢ 根据设计原则：长度在15～20bp、修饰； G+C的比例：40%－60%；避免4个碱基以 上自身反向互补序列；避免4G堆积；避免六 个以上的回文结构等。
水化基底膜 接种细胞
10g/L BSA； 50mg/L Matrigel1:2稀液； 10mg/L FN， 以50ul/孔分别加入96孔培 养板，4℃过夜，BSA为对 照基底。
MTT比色法检测
黏附率＝（OD值实验组－OD值BSA组）/ OD值BSA组 ×整1理0p0pt ％
细胞体外侵袭力测定
Transwell
2．主要试剂及其配制
➢ 兔抗人VEGF-C多克隆抗体（北京中山金桥 生物有限公司）
➢ 标记FITC羊抗兔二抗（北京中山生物技术 有限公司）
➢ Matrigel(美国Collaborative Research 公司)
➢ ECM胶（extracellular matrix）E1270 (美国Sigma公司)
实验方法
体外培养Hela细胞 脂质体介导寡核苷酸转染 24h、48h、72h
荧光定量RT-PCR 检测VEGF-CmRNA
间接免疫荧光染色和流式 细胞术检测VEGF-C蛋白
MTT法检测细胞生长
黏附实验
整理ppt
Tanswell小室侵袭实验
材料
1．细胞株 人宫颈癌细胞株Hela由四川大学
华西第二医院妇科肿瘤实验室提供。
整理ppt
➢ 纤维粘连蛋白FN（Roche公司）
➢ VEGF-C寡核苷酸：（由北京赛百盛生物技术 公司合成）
反义链5’-GCC AGC CTC CTT TCC TTA GC-3’，
两端各3个碱基进行硫代修饰，目标核苷酸 251～271，在5’端标记 FAM，
正义链5’-GCT AAG GAA AGG AGG CTG GC-3’，
整理ppt
血管内皮生长因子-C (vascular endothelial growth growth factor-C,VEGF-C)是新近发现的 VEGF家族的新成员，是特异性淋巴管生长因子。 在近50％的人类恶性肿瘤中表达。
VEGFR-3一种酪氨酸激酶受体，主要表达于正常 组织的淋巴管内皮、新生的血管内皮及人的肿瘤细 胞。
141bp
下游引物 5’-CCATCCACAGTCTTCTGGGT-3’
Taqman探 5’-FAM-ACCACAGTCCATGCCATCAC-
针
TAMRA-3
整理ppt
实验仪器
➢ FTC2000 荧光定量基因扩增仪 ➢ MSE Micro-Centaur Centrifuge 微
型台式离心机 ➢ 水平电泳仪（美国BIO-RAD公司） ➢ Gel Doc 1000凝胶成像系统 ➢ 微量移液器（法国Gilson公司） ➢ Elite Esp型流式细胞仪
整理ppt
➢ 设计反义链： 5’-GCC AGC CTC CTT TCC TTA GC-3’；正义链：5’-GCT AAG GAA AGG AGG CTG GC-3’，为提高对核酶的抗性， 在两条链的两端各3个碱基硫代修饰。
➢ 确定序列后，常规进行人类基因组同源性分析， 即：通过Blast分析，证实两条链与人类其他以 已知基因无同源性。
整理ppt
基因名称
核苷酸序列
VEGF-C 上游引物 5’-AGCTACCTCAGCAAGACGTTA-3
产物 长度
93bp
下游引物 5’-GCAGGAAGTGTGATTGGCAAA-3’
Taqman探 5’ -FAM TGCCTCTCTCTCAAGGCCCCA
针
- TAMRA -3’
GAPDH 上游引物 5’-CCTCAAGATCATCAGCAAT-3’
VEGF-C在宫颈癌细胞中的表达及 其对细胞增殖、黏附及侵袭的影响
田小飞 陕西省肿瘤医院妇瘤中心
整理ppt
研究背景
宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，其发病率在我国妇科 恶性肿瘤中居首位。 WHO报道：全世界发病人数为45万， 我国估计年发病人数18万多，约占世界发病总数的1/3。 淋巴转移是宫颈癌的主要转移途径，也是宫颈癌治疗效果 差、存活率低、复发和死亡的直接原因，成为影响患者预 后的重要因素。
ECM包被孔径8um的滤膜
高糖DMEM Hela细胞
1:1条件培养液(NIH3T3) 及高糖DMEM2.5ml
24h、48h擦去上室 中的细胞，HE染色，
计数穿膜细胞数.
（M.A.A Al-Rawi.et al. Histolo整gy理papnt d Histopathology 2005）
( Marc G.Achen et al. Cancer Cell. 2005. )
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VEGF-C
研究设想
淋巴内 皮细胞
肿瘤细胞
整理pptபைடு நூலகம்
肿瘤 淋巴 转移
两端各3个碱基进行硫代修饰。
整理ppt
➢ 阳离子脂质体 Lipofectamine™2000（美 国Invitrogen公司，系尹如铁副教授惠赠）
➢ Transwell小室（3428型，孔径8um，美国 Corning-Costar公司）
➢ 引物：VEGF-C及内参照GAPDH的引物均由 上海生物工程有限公司合成，其氨基酸序列 及其产物长度如下：
（曹泽毅主编，中华妇产科学，2004 ）
整理ppt
肿瘤淋巴转移是一个多步骤、多因素参与的及其 复杂的过程。近来随着特异性淋巴内皮标记的发现， 淋巴转移的研究成为继血管生成之后肿瘤研究的又 一热点，以期通过阻断肿瘤的淋巴转移，改善患者 的预后。
目前对于肿瘤淋巴转移机制的研究,主要集中在 VEGF-C特异性与受体VEGFR-3 结合，诱导淋巴管 生成，促进肿瘤的淋巴转移方面。
➢ 为便于观察寡核苷酸转入细胞的效率，在反义链 5‘端标记了羧基荧光素(FAM)，FAM的激发波 长是480nm，发射波长是520nm，在荧光显微 镜下是绿色的。
整理ppt
MTT法检测Hela细胞黏附能力的变化
包被基底膜
吸取培养板中的液
体，加入50ul含 10g/L BSA的无血 清高糖DMEM培养 液，37℃，孵育 30min。
整理ppt
VEGF-C反义寡核苷酸的设计
➢ 反义寡核苷酸设计，首先是从美国国立图书 馆的GENEBANK数据库中，查找到人 VEGF-C的基因序列（NM 005429）。
➢ 根据设计原则：长度在15～20bp、修饰； G+C的比例：40%－60%；避免4个碱基以 上自身反向互补序列；避免4G堆积；避免六 个以上的回文结构等。
水化基底膜 接种细胞
10g/L BSA； 50mg/L Matrigel1:2稀液； 10mg/L FN， 以50ul/孔分别加入96孔培 养板，4℃过夜，BSA为对 照基底。
MTT比色法检测
黏附率＝（OD值实验组－OD值BSA组）/ OD值BSA组 ×整1理0p0pt ％
细胞体外侵袭力测定
Transwell
2．主要试剂及其配制
➢ 兔抗人VEGF-C多克隆抗体（北京中山金桥 生物有限公司）
➢ 标记FITC羊抗兔二抗（北京中山生物技术 有限公司）
➢ Matrigel(美国Collaborative Research 公司)
➢ ECM胶（extracellular matrix）E1270 (美国Sigma公司)
实验方法
体外培养Hela细胞 脂质体介导寡核苷酸转染 24h、48h、72h
荧光定量RT-PCR 检测VEGF-CmRNA
间接免疫荧光染色和流式 细胞术检测VEGF-C蛋白
MTT法检测细胞生长
黏附实验
整理ppt
Tanswell小室侵袭实验
材料
1．细胞株 人宫颈癌细胞株Hela由四川大学
华西第二医院妇科肿瘤实验室提供。
整理ppt
➢ 纤维粘连蛋白FN（Roche公司）
➢ VEGF-C寡核苷酸：（由北京赛百盛生物技术 公司合成）
反义链5’-GCC AGC CTC CTT TCC TTA GC-3’，
两端各3个碱基进行硫代修饰，目标核苷酸 251～271，在5’端标记 FAM，
正义链5’-GCT AAG GAA AGG AGG CTG GC-3’，
整理ppt
血管内皮生长因子-C (vascular endothelial growth growth factor-C,VEGF-C)是新近发现的 VEGF家族的新成员，是特异性淋巴管生长因子。 在近50％的人类恶性肿瘤中表达。
VEGFR-3一种酪氨酸激酶受体，主要表达于正常 组织的淋巴管内皮、新生的血管内皮及人的肿瘤细 胞。
141bp
下游引物 5’-CCATCCACAGTCTTCTGGGT-3’
Taqman探 5’-FAM-ACCACAGTCCATGCCATCAC-
针
TAMRA-3
整理ppt
实验仪器
➢ FTC2000 荧光定量基因扩增仪 ➢ MSE Micro-Centaur Centrifuge 微
型台式离心机 ➢ 水平电泳仪（美国BIO-RAD公司） ➢ Gel Doc 1000凝胶成像系统 ➢ 微量移液器（法国Gilson公司） ➢ Elite Esp型流式细胞仪
整理ppt
➢ 设计反义链： 5’-GCC AGC CTC CTT TCC TTA GC-3’；正义链：5’-GCT AAG GAA AGG AGG CTG GC-3’，为提高对核酶的抗性， 在两条链的两端各3个碱基硫代修饰。
➢ 确定序列后，常规进行人类基因组同源性分析， 即：通过Blast分析，证实两条链与人类其他以 已知基因无同源性。
整理ppt
基因名称
核苷酸序列
VEGF-C 上游引物 5’-AGCTACCTCAGCAAGACGTTA-3
产物 长度
93bp
下游引物 5’-GCAGGAAGTGTGATTGGCAAA-3’
Taqman探 5’ -FAM TGCCTCTCTCTCAAGGCCCCA
针
- TAMRA -3’
GAPDH 上游引物 5’-CCTCAAGATCATCAGCAAT-3’
VEGF-C在宫颈癌细胞中的表达及 其对细胞增殖、黏附及侵袭的影响
田小飞 陕西省肿瘤医院妇瘤中心
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研究背景
宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，其发病率在我国妇科 恶性肿瘤中居首位。 WHO报道：全世界发病人数为45万， 我国估计年发病人数18万多，约占世界发病总数的1/3。 淋巴转移是宫颈癌的主要转移途径，也是宫颈癌治疗效果 差、存活率低、复发和死亡的直接原因，成为影响患者预 后的重要因素。
ECM包被孔径8um的滤膜
高糖DMEM Hela细胞
1:1条件培养液(NIH3T3) 及高糖DMEM2.5ml
24h、48h擦去上室 中的细胞，HE染色，
计数穿膜细胞数.