乳酸菌素对铜绿假单胞菌的抑菌效果研究

乳酸菌素对铜绿假单胞菌的抑菌效果研究
ZHU Yinglian;WANG Peng;SUN Jingxin;WANG Shiqing
【摘要】乳酸菌(LAB)是一类能发酵糖类产生乳酸的革兰氏阳性细菌,大部分能够抑制腐败菌生长.以从泡菜、发酵乳及火腿等原料中分离筛选到的乳酸菌为研究对象,研究其发酵上清液对铜绿假单胞菌的抑菌效果.探讨了不同酶、初始培养pH、NaCl浓度和培养时间对乳酸菌素抑菌活性的影响,研究了乳酸菌素的热稳定性及最小抑菌浓度.结果表明:菌株Zd产生的乳酸菌素具有最好的热稳定性,并在初始pH 为5,添加4％NaCl的环境下培养24 h时具有最佳抑菌活性.
【期刊名称】《青岛农业大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2019(036)002
【总页数】5页(P142-146)
【关键词】乳酸菌;乳酸菌素;假单胞菌;抑菌
【作者】ZHU Yinglian;WANG Peng;SUN Jingxin;WANG Shiqing
【作者单位】;;;
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.92
乳酸菌主要分为乳酸球菌和乳酸杆菌[1]，其在食品中的应用久远，主要用于提高食品的功能性特点与附加值[2]，增加食品的营养价值。

部分乳酸菌可以抑制食品中致病菌与腐败菌的生长，延长食品的货架期[3,4]，研究表明乳酸菌的代谢产物
乳酸菌素是抑制致病菌与腐败菌生理功能表达的关键因素[5,6]。

乳酸菌素与其它细菌素相比，没有毒副作用、无残留、无抗药性，有一定的热稳定性，在人体中很容易被某些蛋白酶降解，不会引起不良反应。

又因为其具有较为明显的抑菌效果[7-11]，因此，乳酸菌素及其类似物作为食品生物防腐剂在食品生产中具有很大的应用前景。

许多研究表明乳酸菌素主要存在于乳酸菌发酵上清液中，因此，本研究主要以从泡菜、发酵乳及火腿等原料中分离筛选到的乳酸菌为研究对象，研究其发酵上清液对假单胞菌的抑菌效果，为乳酸菌素的开发及利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
菌株：泡菜、发酵乳及火腿等原料中分离筛选到的乳酸菌株ZB、Za、Zb、Zc、Zd及Ze，保藏于青岛农业大学发酵工程实验室。

铜绿假单胞菌(菌种号为CICC 21636)：购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

培养基：MRS培养基，牛肉膏蛋白胨培养基均由北京陆桥生物技术有限责任公司提供。

1.2 仪器与设备
SPX型生化培养箱；宁波东南仪器有限公司；BSC-1100IIA2生物安全柜；北京东联哈尔仪器制造有限公司；YX0602电热式蒸汽消毒器；山东新华医疗器械股份有限公司；立式压力蒸汽灭菌器；上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验条件
1.3.1 指示菌的活化
挑取假单胞菌接种于10 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃培养24 h。

1.3.2 乳酸菌抑菌实验
把六株乳酸菌接种于MRS液体培养基中，震荡均匀，于37 ℃下培养24 h后，于4 ℃下10 000 r/min离心10 min，取上清液备用。

取0.1 mL指示菌均匀涂布
于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，静置30 min。

用无菌的12 mm打孔器在平板上等距离打出三个孔，其直径记为d。

分别向小孔中加入0.15 mL乳酸菌发酵上清液，将平板放于37 ℃下培养24 h。

观察并测量抑菌圈的直径，记为D。

而乳酸菌的抑菌能力以D/d来表示。

1.3.3 最低抑菌浓度(MIC)
将乳酸菌培养至菌液浓度为108cfu/mL，梯度稀释成107cfu/mL、106cfu/mL、105cfu/mL、104cfu/mL、103cfu/mL、102cfu/mL和10 cfu/mL七种浓度，分别进行抑菌实验，观察并测量抑菌圈的直径大小。

以完全没有抑菌效果的前一浓度为该乳酸菌的最低抑菌浓度。

1.3.4 乳酸与乳酸菌素抑菌能力比较
测定每种乳酸菌发酵上清液的pH，用乳酸调节MRS液体培养基至相同pH。

分别进行抑菌实验，观察并测量抑菌圈的直径。

1.3.5 酶对乳酸菌素抑菌效果的影响
分别向乳酸菌发酵上清液中加入终浓度为1 mg/mL的过氧化氢酶，胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，并调节pH至各自最适pH，于37 ℃水浴2 h后，再于80 ℃水浴处理2 min使酶失活[13]，分别进行抑菌实验，观察并测量抑菌圈的直径。

以未添加酶的上清液作为对照。

1.3.6 初始pH对乳酸菌素抑菌效果的影响
分别用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液将MRS液体培养基的pH分别调至2、3、4、5、6、7、8，高温灭菌后，接入1 mL乳酸菌菌悬液，37 ℃下培养24 h，4 ℃下10 000 r/min离心10 min，取上清液进行抑菌实验，观察并测量抑菌圈的直径。

1.3.7 NaCl浓度对乳酸菌素抑菌效果的影响
分别向MRS液体培养基中添加0%、2%、4%、6%、8%、10%的NaCl，高温灭
菌后，接入1 mL乳酸菌菌悬液，37 ℃下培养24 h，4 ℃下10 000 r/min离心
10 min，取上清液进行抑菌实验，观察并测量抑菌圈的直径。

1.3.8 培养时间对乳酸菌素抑菌效果的影响
向MRS液体培养基中接入1 mL乳酸菌菌悬液，分别于37 ℃分别培养6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h。

4 ℃下10 000 r/min离心10 min，取上
清液进行抑菌实验，观察并测量抑菌圈的直径。

1.3.9 温度对乳酸菌素抑菌效果的影响
将乳酸菌发酵上清液分别在37 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃、85 ℃、95 ℃条件下处理30 min后进行抑菌实验，观察并测量抑菌圈的直径。

1.3.10 数据统计分析
数据间的比较用SPSS 数据处理系统作方差分析。

字母不同表示在0.05水平上差
异显著(P< 0.05)，字母相同表示两者相比差异不显著。

2 结果与分析
2.1 乳酸菌素抑菌效果的初步测定
由图1可知，这六株菌对假单胞菌均有较好的抑菌效果，但是菌株ZB、Zb、Zd
三株菌的抑菌圈直径与打孔直径之比均超过了2.0，显著高于其他3株菌(P<
0.05)，这表示这三株菌具有较强的抑菌能力，因此本文进一步研究以这三株乳酸
菌为主。

2.2 最低抑菌浓度(MIC)
由表1可知，在同一浓度下，三株菌的抑菌效果差异不显著(P< 0.05)。

但是随着
乳酸菌菌液浓度的降低，三株菌的抑菌效果越来越差，菌株ZB在不同浓度下的抑菌效果差异显著(P< 0.05)，最低抑菌浓度为103cfu/mL。

菌株Zb的浓度为
104cfu/mL和105cfu/mL时抑菌效果差异不显著，最低抑菌浓度为103cfu/mL。

菌株Zd在106cfu/mL浓度以下，各浓度抑菌效果差异显著，最低抑菌浓度为
102cfu/mL。

这说明菌株Zd对铜绿假单胞菌的抑菌效果较好。

图1 六株乳酸菌的抑菌能力Fig.1 The antibacterial ability of the six LAB表1 最低抑菌浓度测定结果Table 1 The results of the minimal inhibitory concentration
浓度/cfu/mLConcentration不同浓度乳酸菌的抑菌能力The antibacterial ability of different concentration
LABD1/dD2/dD3/d1×1072.04±0.08eA2.09±0.08dA1.96±0.03eA1×1061.87±0.04dA1.89±0.03cA1.92±0.05eA1×1051.75±0.07cA1.64±0.04bA1.71±0.07 dA1×1041.47±0.07bA1.59±0.05bA1.60±0.07cA1×1031.11±0.02aA1.29±0.0 9aA1.40±0.04bA1×102111.20±0.02a1×101111
注：D1、D2、D3分别代表菌株ZB、Zb、Zd的抑菌圈直径； a b c 代表同一菌株不同浓度间的显著性差异(P< 0.05), A B C代表同一浓度不同菌株间的显著性差异(P< 0.05)。

2.3 乳酸与乳酸菌素抑菌能力比较
乳酸是乳酸菌生长繁殖过程中产生的特征产物，其属于有机酸，对致病菌和腐败菌的生长具有较强的抑制作用[12]。

由图2可知，纯乳酸溶液的抑菌能力均显著低于三株乳酸菌发酵上清液的抑菌能力(P< 0.05)，这说明三株乳酸菌在发酵过程中，有乳酸菌素产生。

图2 乳酸溶液与乳酸菌素的抑菌效果Fig.2 The bacteriostatic effect of bacterial supernatant and lactic acid
2.4 酶处理对乳酸菌素抑菌能力的影响
过氧化氢是一种强氧化剂，其具有很强的杀菌能力。

汪华等人研究发现0.4 g/L的过氧化氢溶液作用20 s即可杀死50.04%的铜绿假单胞菌[14]，而多数的乳酸菌在生长过程中会产生过氧化氢。

由图3可知，酶处理后三株菌的抑菌能力发生了较
大的变化，其中过氧化氢酶对三株乳酸菌抑菌能力的影响较小，抑菌效果与空白对照相比没有显著变化，这说明过氧化氢不是主要的抑菌物质。

注：a b c 代表不同菌株相同酶处理后的显著性差异(P< 0.05),A B C代表相同菌株不同酶处理下的显著性差异(P< 0.05)。

图3 酶处理对乳酸菌素抑菌能力的影响Fig.3 The effect of bacteriostatic ability of LAB at different enzyme treatment
而三种蛋白酶对乳酸菌抑菌能力产生了较大的影响，其中胰蛋白酶的影响最大，与对照及过氧化氢酶处理后相比较抑菌能力均存在显著性差异(P< 0.05)。

胰蛋白酶使菌株Zd的抑菌能力消失，菌株ZB和Zb的抑菌能力有了较大减弱。

而木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对三株菌抑菌能力的影响相对较小，仅是导致抑菌效果变弱。

说明这三株乳酸菌产生细菌素均对蛋白酶比较敏感，乳酸菌发酵液中的细菌素有可能是蛋白质类物质。

2.5 初始pH对乳酸菌素抑菌能力的影响
乳酸菌的生长繁殖需要一定的酸碱环境，并且其产生的部分乳酸菌素亦对环境具有依赖性，如Zhang 等发现鼠李糖乳杆菌LS-8 能产生一种新的小分子抑菌物质LS-8-25，其仅在酸性条件下具有抑菌能力[15]。

因此初始培养环境的pH值会对乳酸菌的抑菌能力产生较强的影响。

由图4可知，三株乳酸菌均在初始培养
pH=5的时候，拥有最强的抑菌能力，在pH=2和pH=3时没有抑菌能力，当pH>5时，抑菌效果随着pH的增大而减弱。

这一方面说明当初始培养的pH值过大或过小时，会使乳酸菌生长速度减慢，活力降低，导致乳酸菌素的产生量减少，致使抑菌能力变弱；另一方面也说明这三种乳酸菌素对pH较为敏感，适用于酸性环境中。

图4 初始pH对乳酸菌素抑菌能力的影响Fig.4 The effect of bacteriostaticability of LAB at different initial pH
2.6 初始NaCl浓度对乳酸菌素抑菌能力的影响
由图5可知，随着生长环境中NaCl浓度的增加，三株乳酸菌的抑菌效果均呈现先增强后减弱的趋势。

菌株ZB在NaCl浓度为2%时抑菌能力最强，而菌株Zb和
Zd在NaCl浓度为4%时抑菌能力最强；三株菌抑菌能力的变化趋势说明一定浓
度的NaCl可以促进乳酸菌素的产生，抑菌效果增强，但是NaCl浓度过大也会影响乳酸菌素的产生，导致抑菌效果减弱。

同时在NaCl浓度为10%时三株乳酸菌
仍然拥有一定的抑菌能力，说明三株乳酸菌均有一定的耐盐性。

这使其在食品中的应用范围得到了较大提升。

图5 NaCl浓度对乳酸菌素抑菌能力的影响Fig.5 The effect of bacteriostatic ability of LAB at different initial NaCl concentration
2.7 培养时间对乳酸菌素抑菌能力的影响
由图6可知，三株菌随着培养时间的延长，抑菌能力逐渐增强，菌株Zd的最佳培养时间为24 h，菌株ZB和Zb的最佳培养时间为36 h。

而随着培养时间的延长，抑菌能力增加缓慢。

这可能是因为乳酸菌的生长过程中会产生乳酸导致发酵液的
pH降低，当培养时间超过最佳培养时间后，pH开始影响乳酸菌素的活性，导致
三株菌的抑菌能力增加缓慢。

图6 培养时间对乳酸菌素抑菌能力的影响Fig.6 The effect of bacteriostatic abilityof LAB at different incubation time
2.8 温度对乳酸菌素抑菌能力的影响
由图7可知，三株乳酸菌的抑菌能力，均随着热处理温度的逐渐升高而逐渐降低。

菌株ZB和Zb在95 ℃的加热处理后，失去了抑菌能力，这说明这菌株ZB与Zb
产生的细菌素会被95 ℃高温破坏，不再具有抑菌能力，而菌株Zd产生的乳酸菌
素则在95 ℃加热处理后仍有抑菌效果，这说明菌株Zd产生的乳酸菌素具有较强
的热稳定性。

虽然高温会使ZB和Zb产生的乳酸菌素失活，在85 ℃以下这3株
乳酸菌的抑菌效果较稳定，即在巴氏杀菌的温度范围内稳定性较好，有潜力应用于食品中，其中菌株Zd的应用范围更加广泛。

图7 温度对乳酸菌素抑菌能力的影响Fig.7 The effect of bacteriostatic ability of LAB at different temperature
3 结论
本文以发酵食品中分离出的6株乳酸菌为研究对象，研究其对假单胞菌的抑菌效果，研究结果表明，菌株ZB、Zb及Zd的抑菌效果较好。

通过乳酸实验表明，发酵液中含有除乳酸之外的抑菌成分乳酸菌素，并且菌株Zd产的乳酸菌素具有最佳的抑菌能力，其在初始pH=5，添加4%NaCl的的环境下培养24 h时具有最佳产量及活性。

3株乳酸菌产生的乳酸菌素均具有一定的温度稳定性，其中菌株Zd的最强，经95 ℃处理后仍具有抑菌活性。

因此，菌株Zd产生的乳酸菌素对假单胞菌具有良好的抑制作用，进一步研究可对其产生的细菌素进行分离纯化，为抑制假单胞菌天然防腐剂的开发与利用提供一定的研究基础。

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