紫外分光光度法测定肾骨颗粒中多糖的含量

紫外分光光度法测定肾骨颗粒中多糖的含量
王文清;李伟;侯小龙;方建国
【摘要】目的建立肾骨颗粒中多糖的含量测定方法,为其质量评价提供理论依据.
方法采用苯酚-硫酸法显色,紫外分光光度法对肾骨颗粒中多糖的含量进行测定,检
测波长为486 nm.结果该方法线性、精密度、准确度、范围、耐用性均良好,高、中、低浓度平均加样回收率分别为97.85%,99.99%,98.35%(n＝9).结论该方法灵
敏快速,准确可靠,可用于肾骨颗粒中多糖含量的测定.%Objective To establish a method for content determination of polysacchande in shengu granule for qualityevaluation. Methods The content of polysacchande was determined by phenol-sulfuric acid method and UV photometry at486 nm. Results Good linearity, high accuracy and precision, wide range and long durability of calium were obtained in thisway. The average recovery of high,middle and low content was 97. 85% ,99. 99% ,98. 35% ,respectively n
= 9 ). ConclusionThis method is sensitive,accurate and rapid,which can
be used for quality control of calium in shengu granule.
【期刊名称】《医药导报》
【年(卷),期】2012(031)003
【总页数】3页(P352-354)
【关键词】肾骨颗粒;多糖;苯酚-硫酸法;紫外分光光度法;含量测定
【作者】王文清;李伟;侯小龙;方建国
【作者单位】华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部,武汉,430030;华中科
技大学同济医学院附属同济医院药学部,武汉,430030;华中科技大学同济医学院附
属同济医院药学部,武汉,430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部,武汉,430030
【正文语种】中文
【中图分类】R286;R927.2
肾骨颗粒(国药准字Z20080549)是一种以中药牡蛎为主药制成的中药制剂，具有
促进骨质吸收形成，维持神经传导、肌肉收缩、毛细血管正常渗透压，保持血液酸碱平衡的作用。

可用于儿童、成人或老年人缺钙引起的骨质疏松、骨质增生、骨痛、肌肉痉挛，小儿佝偻病等［1］。

笔者对肾骨颗粒中多糖进行了含量测定，为肾骨颗粒的质量控制、质量评价及其药理学的研究奠定基础。

1 仪器与试药
1.1 仪器 UV2450型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)，AUW220D型双量程
分析天平(日本岛津公司)。

1.2 试药肾骨颗粒(湖北省益康制药厂，批号20100902，20101102，20101202，规格:每袋 2 g)，无水葡萄糖对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110833-201001)，苯酚(分析纯，武汉中天化工有限责任公司，批号:20100706)，水为去
离子水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果
2.1 6%苯酚溶液的配制取苯酚100 g，置100 mL烧瓶中，加铝片 0.1 g，碳酸
钠 0.05 g，加热蒸馏，收集180℃馏分6 g，加纯化水100 mL溶解，置棕色瓶中，即得［2-3］。

2.2 葡萄糖标准储备溶液的制备取无水葡萄糖对照品，精密量取0.130 1 g，置100 mL量瓶中，用纯化水定容至刻度，即得浓度为1.301 mg·mL－1的葡萄糖标准溶液。

2.3 供试品溶液的制备取肾骨颗粒2 g，精密称定，置100 mL量瓶中，以去离子水定容至刻度，摇匀，取1 mL置具塞试管中，补水至2 mL，加入6%苯酚溶液1 mL，振荡，再加入硫酸4 mL，迅速振荡，置水浴中30 min，取出后置冷水浴中放置5 min，即得。

2.4 标准曲线的绘制精密吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL葡萄糖标准储备溶液，分别置具塞试管中，补水至2 mL，加入6%的苯酚溶液1 mL，振荡，再加入硫酸4 mL，迅速振荡，置水浴中30 min，取出后置冷水浴中放置5 min，另取1 mL
水做空白，重复上述步骤，分别于486 nm波长处测定吸光度。

以葡萄糖标准溶
液浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得线性方程为 Y=0.498 8X－0.012 8，r=0.998 6。

结果表明，在0.260 2 ～1.301 0 mg·mL－1范围内，吸光度与葡萄糖标准溶液浓度呈线性关系。

2.5 精密度实验
2.5.1 重复性实验取同一批号肾骨颗粒供试品(批号:20100902)2 g，精密称定，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法制备，平行制备6份供试品溶液，于486 nm
处测定吸光度，计算多糖含量。

结果表明:多糖的平均含量为2.14%，RSD为
1.64%，说明本含量测定方法重复性好。

2.5.2 中间精密度在不同时间由不同的分析人员取同一批号肾骨颗粒供试品(批
号:20100902)2 g，精密称定，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法制备供试品
溶液，测定，分别于486 nm波长处测定吸光度，计算多糖含量。

结果表明:多糖
含量为2.10%，RSD为1.45%，说明本含量测定法中间精密度良好。

2.6 稳定性实验取肾骨颗粒供试品(批号:20100902)2 g，精密称定，按“2.3”项
下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，于486 nm波长处测定吸光度值，每
隔30 min测量一次。

结果表明，供试品溶液在3 h内稳定，RSD为1.69%。

2.7 加样回收率实验取肾骨颗粒供试品(批号:20100902)1 g，共9份，精密称定，置100 mL量瓶中，再分别精密加入无水葡萄糖对照品17，21，26 mg，以去离子水定量至刻度，取1 mL置具塞试管中，补水至2 mL，加入6%苯酚溶液 1 mL，振荡，再加入硫酸4 mL，迅速振荡，置水浴中30 min，取出后置冷水浴中放置5 min，即得。

在486 nm波长处测定吸光度值，计算回收率。

结果高、中、低浓度平均加样回收率分别为97.85%，99.99%，98.35%RSD 分别为0.91%，1.71%，1.17%(n=3)，见表 1。

表1 多糖加样回收率测定结果Tab.1 Results of recovery test for polysaccharide样品量多糖含量葡萄糖加入量测定量g回收率/%1.001 5
0.021 4 0.017 1 0.038 0 97.08 1.008 5 0.021 6 0.016 8 0.038 0 97.62 1.005 6 0.021 5 0.017 4 0.038 7 98.85 0.999 8 0.021 4 0.021 3 0.043 0 101.41 1.005
6 0.021 5 0.021 9 0.043 5 100.46 0.998 5 0.021 4 0.021 0 0.042 0 98.10
1.004 2 0.021 5 0.026 5 0.047 5 98.11 1.002 1 0.021 4 0.025 9 0.047 2 99.61 0.998 2 0.021 4 0.026 1 0.046 8 97.32
结果表明:本法测定肾骨颗粒中的多糖含量的回收率良好，高中低浓度加样回收率
的RSD均＜2.0%，符合要求。

2.8 取样范围取肾骨颗粒(批号:20100902)，按照“2.3”项下方法制备高浓度和
低浓度供试品溶液各3份，在486 nm波长处测定吸光度，计算多糖含量，结果
见表2。

表2 多糖范围的精密度测定结果Tab.2 Precision determination of polysaccharide?
结果表明，采用本方法测定肾骨颗粒中多糖的含量，测定结果精密度良好，符合要
求。

2.9 含量测定取3批肾骨颗粒供试品(批号:20100902，20101102，20101202)2 g，精密称定，然后按“2.3”项下供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，每
批样品制备3份供试品溶液。

分别于486 nm处测定吸光度值，计算多糖含量。

结果:3批肾骨颗粒中多糖的平均含量分别为 2.12%，2.10%，2.20%;RSD 分别为1.94%，1.56%，1.20%。

3 讨论
肾骨颗粒是一种以纯天然海洋生物牡蛎为原料的中药制剂，所含营养成分丰富。

但目前其相关质量标准中只对其中的钙含量做了规定，对其他营养成分的含量并没有准确表明。

多糖具有免疫调节、抗癌，抗病毒、降血糖、治疗肝肾疾病、消炎镇痛等临床作用［4-5］，因此测定多糖的含量，对于肾骨颗粒的质量评价也有着重要意义。

相关研究表明，在使用苯酚-硫酸法测定多糖含量时，影响结果的因素较多。

包括:苯酚用量、硫酸用量、反应温度、反应时间等［2，6-8］。

在实验过程中笔者发现，硫酸的用量对肾骨颗粒中多糖含量测定的结果影响最大。

硫酸的用量选择不当会导致标准曲线溶液吸光度度值不成线性相关，甚至会出现低浓度标准溶液的吸光度值大于高浓度标准溶液的吸光度值现象，使标准曲线的r值无法达到规定要求，从而无法测量;也会导致供试品溶液出现黑色物质，对结果产生很大干扰。

因此确
定硫酸用量，对本实验的成败起着举足轻重的作用。

笔者通过改变硫酸的用量，以标准曲线r值为考察指标，得到最佳的硫酸用量为4 mL。

硫酸的用量对实验结果的影响很大，笔者认为可能是苯酚-硫酸法本身的原理造成。

苯酚-硫酸法的基本原理是糖类在硫酸的作用下，水解生成糖醛及其他相关衍生物，可与苯酚缩合，生成在480～490 nm波长处有特征吸收的有色化合物，从而可以在紫外检测器下被检测出来［9-12］。

但是浓硫酸本身具有氧化性，而苯酚也易
被氧化生成红色衍生物，因此硫酸用量不当可能会使苯酚发生氧化;此外浓硫酸还
有炭化性，而肾骨颗粒富含多糖、氨基酸等多种有机成分，过量的浓硫酸会使其中的有机物炭化生成黑色的物质，对测定结果产生影响。

综上所述，在实验过程中必须严格控制硫酸的用量。

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